Độc chất chiết từ cá nóc là hỗn hợp của hơn 10 analog, chủ yếu là TTX, còn lại đều có hàm lượng nhỏ. Trong quá trình chiết xuất một phần các analog đã được loại bỏ. Ba analog chính khác là acid tetrodonic, 4-epi TTX và 4-epi anhydrotetrodotoxin thường xuất hiện với TTX do có đặc tính hóa học tương đối giống nhau. Sử dụng phương pháp tinh chế nhiều lần nhằm loại các analog có hàm lượng thấp. Sử dụng dung môi acid acetic loãng 5% để tinh chế nhiều lần theo sơ đồ (Hình 2.2)
Cách tiến hành:
1) Hòa tan độc tố tinh thể đã sấy khô trong 10 ml dung dịch acid acetic 5% (tt/tt). 2) Điều chỉnh tới pH 9,0 bằng dung dịch amoniac đậm đặc.
3) Cho vào tủ lạnh, để yên cho TTX kết tinh.
4) Lọc lấy TTX tinh thể, rửa 3 lần, mỗi lần với 5 ml với nước cất.
5) Sấy trong tủ sấy chân không (60oC; áp suất không quá 0,5 kPa; phosphor pentoxyd; 2 h).
6) Hòa tan TTX tinh thể đã sấy khô trong 10 ml dung dịch acid acetic 5% (tt/tt), rồi tiếp tục tiến hành như mô tả ở các bước từ 2 đến.4
7) Sấy TTX tinh thể thu được trong tủ sấy chân không (60oC; áp suất không quá 0,5 kPa; phosphor pentoxyd) đến khối lượng không đổi.
Kết quả :
1. Định tính TTX trong tinh thể đã phân lập
- Dựa vào khối phổ ESI-MS : Tiêm trực tiếp 1 lượng mẫu dịch chiết vào detector khối phổ, Trên sắc ký đồ ESI-MS, ở chế độ quét toàn thang (TIC – Total ion chromatographic) xuất hiện mảnh khối m/z = 320, ở chế độ MS/MS, bắn phá mảnh mẹ m/z = 320 với mức năng lượng CE = 35V, xuất hiện các mảnh con m/z = 302, m/z = 162 đặc trưng cho TTX (PL1)
- LC-MS/MS: Sắc ký đồ thu được của dung dịch thử có pic với thời gian lưu (tR=6,8 phút) và phổ MS/MS giống với thời gian lưu của pic và phổ trong sắc ký đồ thu được của dung dịch chuẩn (PL5, PL6).
- NMR: dựa vào phổ cộng hưởng từ xác định được cấu trúc đặc trưng của TTX (PL2,PL3)
2. Định lượng TTX bằng phương pháp LC/MS/MS
- Dung dịch chuẩn: Dung dịch TTX chuẩn trong dung môi pha mẫu, có nồng độ chính xác 1µg/ml.
Cách pha: tiêm khoảng 4mL dung môi pha mẫu vào lọ chuẩn 1mg, lắc kỹ, hoà tan hoàn toàn TTX, rút dung dịch ra, cho vào bình định mức 20,0mL. Tráng lại 3 lần, mỗi lần 4mL dung môi pha mẫu. Gộp dịch vào bình định mức 20,0mL. Thêm dung môi pha mẫu cho đến vạch, lắc siêu âm kỹ, lọc qua giấy lọc. Hút 1ml dung dịch này cho vào bình định mức 50ml, lắc kỹ. Lọc qua màng lọc 0,45µm ta thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 1µg/ml.
- Dung dịch thử:
Hòa tan độc tố tinh thể thu được ở phần chiết xuất trong dung môi pha mẫu với nồng độ khoảng 1µg/ml.
Cách pha dung dịch thử: cân chính xác khoảng 2,03mg chất vừa phân lập theo quy trình, pha trong bình định mức 20mL. Thêm 12mL dung dịch acid acetic 0,1%, lắc siêu âm kỹ, thêm dung dịch acid acetic 0,1% vừa đủ, lọc qua giấy lọc. Hút 1ml dung dịch này, pha trong 10mL Methanol thu được dung dịch 1. Hút tiếp 1mL
dung dịch 1, pha loãng trong 10mL Methanol. Lọc qua màng lọc 0,45µm thu được dung dịch tiêm sắc ký.
Tiến hành sắc kí LC-MS/MS ở các điều kiện đã nêu
Kết quả:
Sau khi tiến hành phân lập theo quy trình trên từ 29.8mg độc tố toàn phần chứa TTX thu được 20,7 mg TTX tinh thể.
Bảng 3.4: Kết quả phân lập
Lần tinh chế Khối lượng tinh thể
(mg) Hàm lượng TTX (X%)
1 25,7 73,9
2 22,5 78,7
3 20,7 82,6
Tiến hành định lượng hàm lượng Tetrodotoxin trong lượng tinh thể phân lập được theo điều kiện ở trên, ta có bảng sau
Diện tích peak dung dịch chuẩn: Sc = 161602,8
Bảng 3.5: Kết quả định lượng TT St X% Lần 1 137251,9 83,7 Lần 2 135365,7 82,9 Lần 3 130998,1 81,1 Trung bình 82,6 RSD 1,61
Bàn luận:
- Quá trình phân lập ta tiến hành tinh chế nhiều lần để loại các analog của TTX. Điều chỉnh pH 8-9 nhằm kết tinh TTX sau đó lọc, rửa, sấy. Sau khi tiến hành phân lập thu được 20,7mg TTX tinh thể với độ tinh khiết là 82,6% đạt yêu cầu. - Hiệu suất của quá trình chiết xuất phân lập là: 69,5%
- Quy trình phân lập đơn giản, dễ thực hiện, ít tốn kém với dung môi đơn giản, rẻ tiền. Thời gian phân lập nhanh.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN:
- Tiến hành chiết xuất được 29,8mg độc tố toàn phần có độ tinh khiết 71,1% từ phủ tạng cá nóc ở quy mô phòng thí nghiệm tham khảo theo quy trình Maoquing Zhou (2003) với các giai đoạn:
1. Chiết bằng phương pháp ngâm lạnh
2. Làm giàu bằng phương pháp trao đổi ion và tách TTX 3. Sơ tinh chế bằng diatomaceous silica-than hoạt
4. Cô đặc và kết tinh
- Khảo sát được một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất: nồng độ dung môi, pH dịch trước khi chạy cột trao đổi ion
- Tiến hành phân lập TTX ở quy mô phòng thí nghiệm theo quy trình Maoquing Zhou (2003) từ 29,8mg độc tố toàn phần bằng cách tinh chế nhiều lần thu được 20,7mg TTX tinh thể với độ tinh khiết là 82,6% đạt yêu cầu. Hiệu suất của quá trình phân lập là: 69,5%
- Quy trình chiết xuất-phân lập đơn giản và không dùng đến dung môi hữu cơ độc xác định được độ tinh khiết của TTX tinh thể thu được.
I. KIẾN NGHỊ:
Do thời gian tiến hành ngắn, điều kiện ở quy mô phòng thí nghiệm còn chưa đầy đủ nên hiệu suất chiết xuất phân lập còn chưa cao; chưa khảo sát hết các thông số khác của quy trình. Khối lượng nguyên liệu còn ít nên còn chưa đánh giá hết những hạn chế của quy trình nên chúng tôi đề nghị:
1. Khảo sát các thông số khác của quy trình: nhiệt độ, lượng than hoạt, pH chạy cột than hoạt...
2. Tiếp tục nghiên cứu trên khối lượng lớn hơn để cải tiến và hoàn thiện quá trình
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt
1. Nguyễn Thị Dụ (2004), “Ngộ độc cá nóc”. Tạp chí y học quân sự, (4), 57-60. 2. Vũ Viết Hà, Nguyễn Hoài Nam, Đặng Văn Thi (2006), “ Hiện trạng nguồn lợi
cá nóc biển Việt Nam, Tuyển tập Nghiên cứu nghề cá biển, (4), 85-119. 3. Bùi Thị Thu Hiền, Bùi Trọng Tâm, Phạm Quốc Long (2009), “ Tetrodotoxin
nguồn gốc vi sinh vật và triển vọng ứng dụng trong y dược ở Việt Nam”, Tuyển tập Hội nghị Khoa học toàn quốc về sinh học biển và phát triển bền vững, 626- 634.
4. Lê Văn Hiệp, Nguyễn Ái Thường, Lâm Thành Hưng, Ngô Phú, Nguyễn Công Bảy (2007), “Bước đầu thử nghiệm tinh chế độc tố cá nóc”, Tạp chí Y học dự phòng, 7(92), 26-29.
5. Nguyễn Hữu Hoàng (2008), Nghiên cứu độc tố trong một số loài Cá Nóc độc ở biển Việt Nam, Bản tin quý số 8-tháng 4/2008 Viện Nghiên cứu Hải sản, Hải Phòng.
6. Lê Quang Huấn, Lê Xuân Tú (1994), “Tách chiết và tinh chế tetrodotoxin từ phủ tạng cá nóc (Tetryodontidae) tại vùng biển Việt Nam”, Tạp chí sinh học, (3), 38-41.
7. Nguyễn Văn Lệ (2005), “Nghiên cứu độc tính cá nóc và các giải pháp xử lý chế biến, quản lý từ khâu khai thác đến khâu tiêu thụ cá nóc đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm”, Kỷ yếu hội thảo toàn quốc về khai thác, chế biến và dịch vụ hậu cần nghề cá, 385-402.
8. Nguyễn Văn Lệ, Nguyễn Hữu Hoàng, Bùi Thị Thu Hiền và ctv (2006), “Kết quả phân tích độc tố cá nóc biển Việt Nam”, Tuyển tập Nghiên cứu nghề cá biển, (4),256-264.
9. Đỗ Ngọc Liên. Nhà xuất bản đại học quốc gia Hà Nội(2007), “Chương 10 thụ thể acetylcholin và sự truyền xung thần kinh”, Sinh học màng tế bào.Tr 43-53. 10.Nguyễn Hoài Nam, Ths.Đặng Văn Thi (2007), “Một số thông tin về cá nóc
Tài liệu tiếng anh
11.Charles T. Hanifin, Edmund D. Brodie III, Edmund D. Brodie Jr (2004), “Apredictive model to estimate total skin tetrodotoxin in the newt Taricha granulosa”, Toxicon, 43, 243-249.
12.Chih -Yu Chen, Hong Nong Chou (1998), “Detection of tetrodotoxin by HPLC in lined-moon shell and puffer fish”, Acta Zoologica Taiwanica, 9(1), 41-48. 13.Chung-him Yu (2008), Detection and Biosynthesis of Puffer Fish Toxin from
Bacterial Culture for Novel Medical Application, Hong Kong Polytechnic University. Department of Applied Biology and Chemical Technology, Hong Kong.
14.David R. Lide (2005-2006), CRC Handbook of Chemistry and Physics 86TH Edition, CRC Press,Taylor & Francis, Boca Raton, FL 2005, p. 3-482.
15.Francesco Santini và James C. Tyler (2003), “A phylogeny of the families of fossil and extant tetraodontiform fishes (Acanthomorpha, Tetraodontiformes), Upper Cretaceous to Recent”, Zoological Journal of the Linnean Society, 139(4), 565–617.
16.Hsiao-Chin Jen, Shin-Jung Lin, Yung-Hsiang Tsai, Chun-Hsiang Chen, Zu- Chun Lin, Deng-Fwu Hwang (2008), “Tetrodotoxin poisoning evidenced by solid-phase extraction combining with liquid chromatography-tandem mass spectrometry”, Journal of Chromatography B, 871, 95-100.
17.Isbister, G.K.; Son, J.; Wang, F.; Maclean, C.J; Lin, C.S.; Ujma, J.; Balit, C.R; Smith, B.; Milder, D.G; Kiernan M.C (2002). “Puffer fish poisoning: A potentially life-threatening condition”. Medical Journal of Australia, 177, 650 - 653.
18.Kelvin Sze-Yin Leung, Bonnie Mei-Wah Fong, Yeuk-Ki Tsoi (2011), “Analytical challenges: determination of tetrodotoxin in human urine and plasma by LC-MS/MS”, Marine drugs, 9, 2291-2303.
19.Manabu Asakawa, Keisuke Miyazawa, Yasuo Shida, Tamao Noguchi(2012), “Instrumental Analysis of Tetrodotoxin”, Chromatography-the most versatile method of chemical analysis, 245-270.
20.Maoqing Zhou, Naning (CN), Frank Hay Kong Shum, North Point (2003),
Method of extracting tetrodotoxin, United State Patent, US.
21.Maoqing Zhou, Naning; Frank Hay Kong Shum, North Point (2003), Method of purrifing tetrodotoxin, United State Patent, US.
22.Monrat Chulanetra, Nitat Sookrung, Potjanee Srimanote, Nitaya Indrawattana, Jeeraphong Thanongsaksrikul, Yuwaporn Sakolvaree, Manas Chongsa-Nguan, Hisao Kurazono, Wanpen Chaicumpa (2011), “Toxin marine puffer fish in Thailand seas and tetrodotoxin they contained”, Toxins, 3, 1249-1262.
23.Munetomo Nakamura et al (1985), “Tetrodotoxin derivatives in Puffer fish”,
Toxicon, 23, pp 271-276.
24.O'Neil, M.J. (ed.) (2006), The Merck Index - An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals. Whitehouse Station, NJ: Merck and Co., Inc., p. 1590. 25.Ryuichi Watanabe, Toshiyuki Suzuki, Yasukatsu Oshima (2011), “Preparation of Calibration Standards of N1-H Paralytic Shellfish Toxin Analogues by Large-Scale Culture of Cyanobacterium Anabaena circinalis (TA04)”, Marine Drugs, 9(3), 466-477.
26.Santini F, Sorenson L, Alfaro ME. (2013), “ A new phylogeny of tetraodontiform fishes (Tetraodontiformes, Acanthomorpha) based on 22 loci”,
Mol Phylogenet, 69(1), 177-187.
27.Toshio Goto et al.(1964), “Extraction and purification of the puffer fish toxin tetrodotoxin”, Japan Chemical society, 85, pp508.
28.Xiao-Wu Chen, Hong-Xia Liu, Yi-Bao Jin, Shang-Fu Li, Xin Bi, Stephen Chung, Shu-Sheng Zhang, Yu-Yang Jiang (2011), “Separation, identification and quantification of tetrodotoxin and its analogs by LC-MS without calibration of individual analogs”, Toxicon,57, 938-943.
PHỤ LỤC
1. PHỤ LỤC 1: Phổ ESI-MS của TTX
2. PHỤ LỤC 2:Phổ 1H-NMR của chất phân lập 3. PHỤ LỤC 3:Phổ 13C-NMR của chất phân lập 4. PHỤ LỤC 4:Phổ DEPT của chất phân lập
5. PHỤ LỤC 5: Sắc ký đồ LC-MS/MS dung dịch mẫu trắng
6. PHỤ LỤC 6: Sắc kí đồ LC-MS/MS dung dịch chuẩn TTX nồng độ 1µg/ml
PHỤ LỤC 6: Sắc kí đồ LC-MS/MS dung dịch chuẩn TTX nồng độ 1µg/ml
PHỤ LỤC 7: Sắc kí đồ LC-MS/MS dung dịch thử