Phân lập bằng phương pháp tinh chế nhiều lần [21]
1) Hòa tan độc tố tinh thể đã sấy khô trong 10 ml dung dịch acid acetic 5% (tt/tt). 2) Điều chỉnh tới pH 9,0 bằng dung dịch amoniac đậm đặc.
4) Lọc lấy TTX tinh thể, rửa 3 lần, mỗi lần với 5 ml với nước cất.
5) Sấy trong tủ sấy chân không (60oC; áp suất không quá 0,5 kPa; phosphor pentoxyd; 2 h).
6) Hòa tan TTX tinh thể đã sấy khô trong 10 ml dung dịch acid acetic 5% (tt/tt), rồi tiếp tục tiến hành như mô tả ở các bước từ 2 đến.4
7) Sấy TTX tinh thể thu được trong tủ sấy chân không (60oC; áp suất không quá 0,5 kPa; phosphor pentoxyd) đến khối lượng không đổi.
Hình 2.2: Sơ đồ phân lập theo phương pháp của Maoquing Zhou
Tính hiệu suất quá trình phân lập 𝐻 =𝑚𝑠
𝑚𝑡 Trong đó mt: khối lượng TTX trước phân lập ms: khối lượng TTX sau phân lập
2.3.3. Định tính TTX A. Sắc kí lớp mỏng: A. Sắc kí lớp mỏng:
Định tính TTX bằng sắc kí lớp mỏng: dựa trên tài liệu [20], [19] và thực nghiệm điều kiện sắc kí được xác định:
- Bản mỏng: silica gel 60 GF254 Merck tráng sẵn ở 110oC trong 30 phút
- Chuẩn: Tetrodotoxin (Sigma Aldrich, 1mg/lọ, hàm lượng: 99%, SKS: 038K1804) - Dung dịch đối chiếu: Dung dịch TTX trong dung dịch acid acetic 5% (tt/tt) có nồng độ khoảng 50 µg/ml.
- Dung dịch thử: lấy dịch chiết đã cô để chấm sắc kí
- Pha động: n-butanol, acid acetic khan và nước (2:1:1) - Thuốc thử hiện màu: dung dịch thuốc thử Weber
- Cách thử: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl mỗi dung dịch, làm khô các vết chấm bằng luồng không khí mát. Triển khai cho đến khi dung môi đi được khoảng 10 cm. Lấy bản mỏng ra, làm khô bằng luồng không khí mát. Phun dung dịch thuốc thử Weber để hiện màu.
B. Phương pháp khối phổ ESI-MS-tiêm trực tiếp vào detecter khối phổ
Cơ sở của phương pháp MS là phá vỡ cấu trúc phân mảnh phân tử trung hòa thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích (có khối lượng nhỏ hơn) bằng các phần tử mang năng lượng cao. Quá trình phân mảnh đặc trưng cho cấu trúc của phân tử và chỉ ra sự có mặt của những nhóm chức đặc thù, cung cấp những thông tin hữu ích về cấu tạo hoặc nhận dạng, khẳng định cấu trúc chất phân tích. Đặc tính nổi bật của khối phổ là tính chọn lọc và độ nhạy cao.
Cách tiến hành: tham khảo tài liệu [15] và làm thực nghiệm
tiến hành tiêm trực tiếp 1 lượng mẫu vào detector khối phổ, xác định mảnh ion mẹ m/z = 320 và các mảnh con tương ứng đặc trưng của TTX
Mẫu: Pha dung dịch TTX 10ppm trong pha động (ethanol) Tiêm trực tiếp vào detecter với tốc độ 5L/phút.
C. Phương pháp LC-MS/MS
Sắc ký đồ thu được của dung dịch thử phải có pic với thời gian lưu và phổ MS/MS
giống với thời gian lưu của pic và phổ trong sắc ký đồ thu được của dung dịch chuẩn Điều kiện sắc kí: tương tự điều kiện định lượng TTX bằng phương pháp LC-MS/MS
D. Phương pháp NMR
Quét phổ để xác định cấu trúc của chất phân lập