Nghiên cứu thành phần hóa học của cây mảnh bát (coccina indica)

ĐẶT VẤN ĐỀNgày nay, con người càng ngày càng có xu hướng sử dụng nguồn dượcliệu làm thuốc. Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới ẩm gió mùa với nguồnthảo dược phong phú. Trong đó, cây mảnh bát phân bố rộng rãi ở khắp cáctỉnh nước ta, tất cả các bộ phận của cây đều có giá trị y học. mảnh bát được sửdụng chữa bệnh đái tháo đường, phát ban da, ghẻ lở, mụn nhọt, vết thương bịrắn cắn, đau khớp, viêm phế quản… Ngoài ra, lá non và quả mảnh bát cũng cóthể dùng làm rau ăn.Tuy nhiên ở Việt Nam hầu như chưa có nghiên cứu về thành phần hóahọc cũng như tác dụng sinh học của mảnh bát. Vì vậy, chúng tôi tiến hànhnghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học của cây mảnh bát(Coccinia indica)” với 2 mục tiêu sau: Xác định sự có mặt một số nhóm chất chính có trong thân, lá mảnh bát. Phân lập và xác định cấu trúc một số chất từ dịch chiết thân, lá mảnh bát.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Nơi thực hiện:

1 Khoa hóa thực vật – Viện Dược Liệu

2 Bộ môn Dược liệu

HÀ NỘI – 2014

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này là kết quả của quá trình học tập tại trường Đại học Dược Hà Nội và quá trình nghiên cứu, học tập của em tại Viện Dược liệu

Với tình cảm chân thành, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân

đến TS Nguyễn Văn Tài và TS Hoàng Quỳnh Hoa dù bận rất nhiều công

việc nhưng đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, dìu dắt em trong quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn thành khóa luận

Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các cán bộ, các anh chị kĩ thuât viên tại

khoa Hóa Thực vật - Viện Dược liệu đặc biệt là chị Nguyễn Thị Huyền

Phương và các thầy cô ở bộ môn Thực Vật, Dược Liệu trường Đại học

Dược Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu

Mặc dù bản thân đã rất cố gắng nhưng chắc chắn khóa luận không tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý giá của các thầy cô

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Phan Thị Hường

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Đặc điểm thực vật chi Coccinia 2

1.2 Đặc điểm thực vật loài mảnh bát (Coccinia indica Wight and Arn.) 3

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 12

2.2 Nội dung nghiên cứu 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 16

3.1 Xác định sự có mặt của một số nhóm chất hữu cơ có trong thân lá mảnh bát (Coccinia indica) bằng phản ứng hóa học 16

3.2 Chiết xuất phân đoạn dịch chiết n - hexan và ethyl acetat thân, lá mảnh bát Coccinia indica 21

3.3 Định tính phân đoạn dịch chiết n - hexan, ethyl acetat của mảnh bát bằng sắc ký lớp mỏng 24

3.4 Phân lập và xác định cấu trúc một số chất trong phân đoạn n - hexan 26

3.5 Phân lập và xác định cấu trúc một số chất trong phân đoạn ethyl acetat: 36

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CTCT DCM

Dd EtOAc EtOH MeOH

kl

IR NMR

MS

Rf SKLM

tt

TT

Công thức cấu tạo Dichloromethan Dung dịch Ethyl acetat Ethanol Methanol Khối lượng Phổ hồng ngoại Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Phổ khối

Hệ số lưu Sắc ký lớp mỏng Thể tích

Thuốc thử

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân, lá

mảnh bát (Coccinia indica) bằng phản ứng hóa học ………… 20

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1: Tóm tắt quy trình chiết phân đoạn từ thân lá mảnh bát…… 23

Sơ đồ 3.2: quy trình phân lập các chất trong cắn n – hexan……….28

Sơ đồ 3.3: quy trình phân lập cắn ethyl acetat……….37

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 2.1: Cây mảnh bát Coccinia indica……… ………

Hình 3.2: Sắc kí đồ phân đoạn n – hexan dưới ánh sáng tử ngoại hai bước sóng λ = 254 nm và λ = 365 nm ………

Hình 3.3 Sắc kí đồ phân đoạn EtOAc dưới ánh sáng tử ngoại hai bước sóng λ = 254 nm và λ = 365 ………

Hình 3.4 Sắc kí đồ chất MH1 (3) và MH2 (9) ………

Hình 3.5 Sắc kí đồ chất chuẩn β - sitosterol và phân đoạn (41 – 50)……

Hình 3.6 Sắc kí đồ chất chuẩn β - sitosterol và chất kết tinh MH41 thu được trong hệ dung môi: n - hexan: EtOAc (90: 10) ………

Hình 3.7 CTCT của MH1………

Hình 3.8 CTCT của MH2………

Hình 3.9 Công thức cấu tạo của MH41 (β - sitosterol)………

Hình 3.10 Sắc kí đồ phân đoạn 34 - 40 thu được trong hệ dung môi DCM: MeOH (90: 10) ………

Hình 3.11 Sắc kí đồ cắn EtOAc và chất ME40 trong hệ dung môi DCM: MeOH (90: 10)………

Hình 3.12 Sắc kí đồ chất chuẩn daucosterol và chất ME40 thu được trong hệ dung môi DCM: MeOH (90: 10)………

12

25

26

29

30

31

32

33

34

38

38

39

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, con người càng ngày càng có xu hướng sử dụng nguồn dược liệu làm thuốc Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới ẩm gió mùa với nguồn thảo dược phong phú Trong đó, cây mảnh bát phân bố rộng rãi ở khắp các tỉnh nước ta, tất cả các bộ phận của cây đều có giá trị y học mảnh bát được sử dụng chữa bệnh đái tháo đường, phát ban da, ghẻ lở, mụn nhọt, vết thương bị rắn cắn, đau khớp, viêm phế quản… Ngoài ra, lá non và quả mảnh bát cũng có thể dùng làm rau ăn

Tuy nhiên ở Việt Nam hầu như chưa có nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học của mảnh bát Vì vậy, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học của cây mảnh bát

(Coccinia indica)” với 2 mục tiêu sau:

- Xác định sự có mặt một số nhóm chất chính có trong thân, lá mảnh bát

- Phân lập và xác định cấu trúc một số chất từ dịch chiết thân, lá mảnh bát

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật chi Coccinia

1.1.1 Vị trí, phân loại chi Coccinia

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan 1987, chi Coccinia thuộc:

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Coccinia

Chi Coccinia thuộc họ Bầu bí (Curcubitaceae) [Từ chữ Hy Lạp

kokkinos: màu đỏ tươi] – mảnh bát, Hoa bát, bình bát

Cây thảo, có thân leo hay trườn Lá có cuống Phiến có hình dạng thay đổi Tua cuốn đơn hay chẻ đôi, có lá bắc mềm ở các mấu, ở chỗ đính của lá và tua cuốn

Hoa đực đơn độc hay thành chùm ngắn, cỡ trung bình, màu vàng da cam, vàng hoặc ít khi trắng, cuống hoa khá ngắn Có khi có lá bắc Đế hoa thường hình chuông Lá đài 5 nhỏ, dạng răng Tràng hoa hợp với 5 thùy dính đến hơn 2/3 chiều cao, thùy rời khá ngắn, nguyên Nhị 3, có chỉ nhị dính thành cột trung tâm đính ở đáy đế hoa Bao phấn hướng ngoài, thường hợp thành 3 khối Hoa cái đơn độc rất ít khi thành chùm nhỏ Bao hoa giống như

ở hoa đực Bầu hình trứng hay trứng thuôn chứa nhiều noãn ngang, đầu nhụy chia 3 thùy Nhị lép nhỏ

Quả nang không mở, nạc, nhỏ, màu lục, viền trắng rồi hồng, hình cầu hay hình trụ, có vỏ quả mỏng

Hạt nhiều, nhỏ, dẹp

Chi Coccinia gồm tới 30 loài ở châu Phi, một số loài phân bố rộng

trong các vùng nhiệt đới

Ở nước ta có 1 loài Coccinia indica [4]

1.2 Đặc điểm thực vật loài mảnh bát (Coccinia indica Wight and Arn.)

Tên Việt Nam : Rau mảnh bát, dây bình bát, hoa bát [4][5]

Tên nước ngoài :

Anh: Ivy gourd, Baby watermelon

Ấn độ: Kovai, Bimbi, Kanturi

Trung quốc: Hong gua

Tây Ban Nha: Pepino Cimarron

Malay alam: Kova, Koval

1.2.2 Đặc điểm thực vật

Cây thảo nhẵn và mảnh, mọc leo cao, đôi khi dài tới 5 m hay hơn Lá có cuống hình 5 cạnh, có răng, rộng 5 – 8 cm, hình tim ở gốc, rất nhẵn, chia 5 thùy hình tam giác, có mũi nhọn cứng Tua cuốn đơn

Hoa đực và hoa cái giống nhau, mọc đơn độc hay xếp lại hai cái một ở nách lá, có cuống dài 2 cm

Quả hình trứng ngược hoặc thuôn, dài 5 cm, rộng 2,5 cm, khi chín có màu đỏ và thịt quả đỏ chứa nhiều hạt [4][5]

Rễ: Triterpenoids, Saponin coccinoside, flavonoid glycoside ombuin 3

- o - arabino furanoside, acetat l upenol, aceta β - amyrin & β - sitosterol, Stigmast – 7 – en – 3 - one, 3 – 0 – β (α – L – arabinopyranosyl – (1 - 2) β – D glucopyranosyl – (1→3) – β hydroxylup 20 (29) – en – 28 oic acid và các chất aglutinin là một chitooligosaccharid - lectin và nhiều polysaccharid như

arabinogalactan, xyloglucan… và các carotenoid [4][9][13]

Quả: Nước 93,1%, protein 12%, chất béo (chiết ether) 0,1%, chất xơ 1,6%;

carbonhydrat 3,5%, chất vô cơ 0,5 mg%, calcium 0,04 mg%; phosphor 0,03% Sắt 1,4 mg%; vitamin A 240IU%; vitamin C 20 mg%, taxaxerone, taxaxerol,

β - carotene, lycopene, cryptoxanthin, β – sitosterol [11]

Quả non chứa lypeol, β - amyrin và cả cucurbitacin β - glucosid [4][5]

- Lá: Alkaloid, carbohydrate, protein và axit amin, tannin, saponin, flavonoid,

phytosterol, triterpenes, cephalandrol, tritriacontane, lupeol, β - sitosterol, cephalandrine A, cephalandrine B, stigma - 7 - en - 3 - one, taraxerone và taraxerol, polysaccharides, xyloglucan, carotenoid và cryptoxanthin

Dịch lá chứa một amylase [13]

Trong rễ, quả và lá mảnh bát, người ta phát hiện được các peptin với hoạt tính

chống lipid cao hạ đường máu [4]

- Phần trên mặt đất: Heptacosane, Cephalandrol, β - sitosterol alkaloids,

Cephalandrine A & B [10]

1.2.7 Tính vị, tác dụng:

Vỏ và rễ có tác dụng xổ, rễ hạ nhiệt; lá hạ nhiệt, dùng ngoài chống

ngứa, tiêu viêm, quả trị đái đường [5]

1.2.8 Công dụng, chỉ định và phối hợp:

- Lá:

Lá non dùng làm rau ăn

Chữa các bệnh ngoài da: hắc lào, vảy nến, ngứa loét, thủy đậu…

Trị lở loét trên lưỡi

Quả thô được sử dụng như rau quả

Bệnh ngoài da, tổn thương da

Nhiễm trùng đường tiết niệu [9][15]

Ở Ấn Ðộ dịch lá và rễ dùng trị bệnh đái đường Dùng cả cây để làm thuốc trị bệnh lậu Lá dùng đắp ở ngoài da trị phát ban da, trị ghẻ lở, mụn nhọt, các vết thương và các vết cắn của rắn rết

Trong y học dân gian Ấn Độ, ở nông thôn người ta uống dịch ép từ quả mảnh bát chín với liều 5 ml, cách nhau 6 giờ một lần làm giảm đáng kể lượng đường trong máu Có thể dùng dạng bột quả mảnh bát chín phơi khô với liều

10 g, ngày 3 lần Người ta cho rằng dạng bột có tác dụng tốt hơn dạng dịch ép Tác dụng hạ đường máu chính là do các pectin đã được phát hiện có trong quả mảnh bát [4][5]

Ở Campuchia người ta dùng dịch chiết từ thân để trị bệnh đau giác mạc

Ở Indonesia, người ta còn dùng cây làm thuốc trị bệnh đậu mùa, đau dạ dày và ruột

Dân gian dùng củ ngâm rượu bóp chữa sưng đau hay các khớp bị viêm

Lá mảnh bát phối hợp với bùm sụm, cỏ mầm trầu, dền gai, mỗi thứ một nắm sắc uống để trị cao huyết áp

Theo sách thuốc cổ Vệ sinh yếu quyết, Hải Thượng Lãn Ông đã dùng dây mảnh bát để chữa trúng độc bằng cách lấy rễ củ của cây để tươi, rửa sạch, giã nát, vắt lấy nước cốt uống hoặc rễ phơi khô 30 – 50 g, thái nhỏ, sắc với

200 ml nước còn 50 ml, uống làm 1 lần trong ngày

Theo kinh nghiệm dân gian, lá mảnh bát để tươi, giã đắp chữa mụn nhọt, lở loét, vết cắn do rết hoặc côn trùng; nếu giã nát lá, thêm nước, gạn uống, rồi lấy bã hơ nóng, xoa miết khắp người chữa cảm sốt, đau đầu Thân và

lá mảnh bát 50 – 100 g, nấu với 4 - 5 lít nước trong 30 phút đến 1 giờ; đợi khi nước ấm, đem tắm dùng bã xát mạnh để chữa ghẻ Ngày làm một lần

Dây mảng bát 50 g, phối hợp với rễ cây chùm ngây 30 g, cam thảo dây

20 g, thái nhỏ, phơi khô, sắc với 400 ml nước còn 100 ml, uống làm hai lần trong ngày, chữa đái rắt hoặc bí đái Để chữa trĩ, lấy lá mảnh bát tươi 50 g, rau diếp cá tươi 50 g, hoa mào gà 5 g, xơ mướp đốt tồn tính 5 g, sắc uống trong ngày

Nước ép từ thân lá dây mảnh bát và rễ thủy xương bồ có tác dụng chữa sốt cao, đau đầu, chóng mặt

Hạt mảnh bát nghiền nát, trộn với dầu dừa, bôi hàng ngày có tác dụng chữa ghẻ

1.2.9 Tác dụng dược lý

Trong vài thập kỷ qua, một số nghiên cứu đã được thực hiện về tác

dụng sinh học và tác dụng dược lý của dịch chiết Coccinia indica:

Polyprenol (C60 - polyprenol) màu vàng, là thành phần hoạt tính sinh

học chính của Coccinia indica đã được chứng minh tác dụng trọng điều trị rối

loạn lipid máu, chống viêm, chống oxy hóa, chống gây đột biến, đái tháo đường, kháng khuẩn, chống loét, ngăn ngừa tổn thương gan, ra đờm, giảm đau và kháng viêm [8][9]

- Điều trị tiểu đường:

Coccinia indica được sử dụng chính trong điều trị tiểu đường Các dịch

chiết từ các bộ phận khác nhau của cây với các dung môi khác nhau cho thấy hiệu quả trị đái tháo đường như sau:

Chiết xuất cồn được cho là an toàn cho nghiên cứu tác dụng sinh học như không có tác dụng gây chết người là ở liều 600 mg/kg đường uống ở chuột

Chất chiết từ lá của Coccinia indica làm giảm đáng kể glucose - 6 - phosphat

và fructose - 1,6 - bisphosphate trên cả chuột bình thường và chuột bị mắc bệnh tiểu đường do streptozotocin

Hỗn hợp dịch chiết methan rễ cây M.paradisiaca và lá của C.indica trên

chuột mắc bệnh tiểu đường không chỉ kiểm soát glucose máu đến mức độ kiểm soát mà còn khắc phục được những rối loạn chuyển hóa protein

Chiết xuất của Coccinia indica (300 mg/kg) giảm đáng kể lượng đường

trong máu bằng 47,4% và 37,1% (P <0,01) vào ngày thứ 7 và 59,7% và 48,5%

vào ngày thứ 14 Giảm đáng kể (P <0,01) cholesterol toàn phần trong huyết thanh là 31,7% và 43,3% và triglycerid huyết thanh là 45,5% và 39,4% đã được quan sát vào ngày thứ 14 với liều các dịch chiếu của mảnh bát (300 mg/kg) [6][8][11][13]

- Tác dụng hạ mỡ máu:

Chiết xuất ethanol của Coccinia indica làm hạ triglyceride (TG) và làm

giảm cholesterol hiệu ứng trong mô hình chuột rối loạn lipid máu [9]

- Chống phù nề:

Chiết xuất dung dịch nước của lá tươi có hiệu quả chống lại carrageenin gây ra phù nề chân trong chuột Wistar và chuột Thụy Sĩ Hiệu quả tương đương với diclofenac 20 mg/kg thể trọng ở 50 mg/kg nhưng nó được phát huy

là đáng kể ở mức cao hơn liều [8][9]

- Tác dụng chống loét, chống oxy hóa:

Dịch chiết thô ethanol dẫn đến cô lập được chất tinh khiết 4 - hydroxy - 3

- methoxy benzaldehyd có tác dụng chống loét và chống oxy hóa

Bột lá chiết xuất với nước và methanol đã được thử nghiệm trên chuột bị

loét dạ dày do dùng aspirin Các dịch chiết bột lá của Coccinia indica làm gia

tăng đáng kể lưu lượng nhầy, giảm trong mức độ lipid peroxy (LPO) và superoxide dismutase (SOD) hoạt động

Dịch chiết MeOH 50% hoặc EtOH 50% từ toàn bộ cây Coccinia indica

cho thấy tác dụng loại các gốc tự do gần như tương tự như của nhân sâm [6][9][14]

- Hoạt động chống vi khuẩn:

Hoạt động chống vi khuẩn của dịch chiết quả mảnh bát bằng các dung môi khác nhau: ether dầu hỏa, diethyl ether, chloroform, ethyl acetate, acetone, methanol, ethanol và nước đã được thử nghiệm với sáu vi khuẩn gram âm và gram dương:

Dịch chiết ether dầu hỏa có hiệu quả tích cực nhất và cho thấy hoạt tính kháng khuẩn chống lại tất cả gram thử nghiệm, tạo vùng ức chế tối đa đường

kính 19 mm với Stephylococcus aureus

Các dịch chiết khác cũng ức chế sự tăng trưởng của một số vi sinh vật thử nghiệm nhưng ở mức độ thấp hơn và chủ yếu chống lại các vi khuẩn gram

dương S.aureus

Dịch chiết methanol đã cho thấy khả năng chống lại Bacillus cereus và

Psedomonas putida tạo ra vùng ức chế có đường kính 15 mm và 13 mm

Dịch chiết nước không chỉ ra tác dụng kháng khuẩn đáng kể

Chiết xuất chloroform chống lại tất cả các vi khuẩn thử nghiệm với sự ức chế khu vực khác nhau, 1 mm - 7 mm

Chiết xuất ethanol cho thấy tác động đáng kể đối với Shigella boydii và

Chiết xuất nước của lá của Coccinia indica cho thấy ức chế sự tăng trưởng và đột biến trên nấm N.crassa Kết quả cho thấy 1 ml dịch chiết lá cho đáp ứng với vi khuẩn thử nghiệm N.crassa [9]

- Độc tính trên gan:

Thử nghiệm dịch chiết cồn của quả Coccinia indica trên chuột có gan

nhiễm độc do CCl4 và theo dõi mức độ AST, ALT, ALP, protein toàn phần, bilirubin toàn phần và bilirubin tự do tại mức liều 250 mg/kg Dịch chiết cồn giảm hoạt động của các enzym (AST, ALT và ALP) và giảm lượng bilirubin

so sánh với của silymarin (p<0,05) [9]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất

- Nguyên liệu: M ảnh b át được hái ở Ninh Bình vào tháng 4 Mẫu tươi được

giám định tên khoa học ở Viện Dược liệu với mã số tiêu bản HNIP/18065/14, tiêu bản được lưu tại bộ môn thực vật – Trường đại học dược Hà Nội

Hình 2.1: Cây mảnh bát Coccinia indica

- Hóa chất: Dung môi dùng trong chiết xuất là dung môi công nghiệp đã cất

lại Các hóa chất, dung môi dùng cho kết tinh, tinh chế là dung môi tinh khiết của Trung Quốc

2.1.2 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

- Các dụng cụ cần thiết trong quá trình thực nghiệm như bình nón, cốc có

mỏ, ống nghiệm, pipet, bình cầu

- Thu hồi dung môi bằng máy cất quay Rotavapor R - 200 của hãng BUCHI - Viện Dược liệu

- Xác định độ ẩm trên máy PRECISA HA60 - Viện Dược liệu

- Cân phân tích PRECISA - Viện Dược liệu

- Đo nhiệt độ nóng chảy trên máy STUART – Viện dược liệu

- Bản mỏng silicagel GF254 (Merck) tráng sẵn pha thuận - Viện Dược liệu

- Phổ hồng ngoại đo trên máy quang phổ hồng ngoại IMPACT 410 NICOLET - Viện Hóa học

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 13C đo trên máy BRUKER AVANCE AM500 FT - NMR - Viện Hóa học

- Phổ khối đo trên máy sắc kí lỏng - khối phổ SHIMADZU LC - MS 2010EV - Viện Hóa học

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Định tính các nhóm chất hữu cơ chính có trong thân, lá mảnh bát

- Nghiên cứu thành phần hóa học của phân đoạn dịch chiết n - hexan và ethyl

acetat của thân, lá cây mảnh bát

+ Định tính phân đoạn dịch chiết n - hexan và ethyl acetat của thân, lá mảnh bát bằng sắc ký lớp mỏng

+ Phân lập bằng sắc ký cột một số chất trong phân đoạn n - hexan và phân đoạn ethyl acetat

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ chính trong cây mảnh bát

Định tính các nhóm chất chính trong dược liệu theo phương pháp hóa học ghi trong tài liệu [1]

2.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học của phân đoạn dịch chiết n - hexan

và ethyl acetat của thân, lá cây mảnh bát

2.3.2.1 Định tính phân đoạn dịch chiết n - hexan, ethyl acetat của mảnh bát bằng sắc ký lớp mỏng

Chấm và chạy sắc ký lớp mỏng dịch chiết n - hexan của mảnh bát, so sánh với chất chuẩn đối chiếu β – sitosterol

Chấm và chạy sắc ký lớp mỏng dịch chiết ethyl acetat

Tiến hành soi dưới ánh sáng tử ngoại hai bước sóng λ = 254 nm và λ =

365 nm và hiện màu với thuốc thử H2SO4.

2.3.2.2 Phân lập bằng sắc ký cột một số chất trong phân đoạn n - hexan và phân đoạn ethyl acetat

+ Cột sắc ký: Sử dụng các cột có kích thước 7 x 45 cm; 4 x 45 cm; 2 x 45 cm + Hệ dung môi rửa giải:

Phân đoạn n – hexan: Sử dụng hệ dung môi n - hexan và ethyl acetat tăng dần độ phân cực (gradient lượng ethyl acetat từ 0% đến 20%) Phân đoạn ethyl acetat: Sử dụng hệ dung môi DCM và MeOH tăng dần

độ phân cực (gradient lượng EtOAc từ 0% đến 20%)

- Độ tinh khiết của chất phân lập được kiểm tra sơ bộ bằng SKLM, đo nhiệt độ chảy Sau đó sử dụng các phương pháp phân tích phổ (phổ hồng ngoại IR, khối phổ ESI - MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H/13C - NMR),

tham khảo cơ sở dữ liệu phổ của các tài liệu đã công bố để biện giải cấu trúc chất phân lập được

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Xác định sự có mặt của một số nhóm chất hữu cơ có trong thân lá

mảnh bát (Coccinia indica) bằng phản ứng hóa học

Định tính thân lá mảnh bát (Coccinia indica) để sơ bộ nhận biết các

nhóm chất có trong dược liệu, giúp định hướng cho quá trình phân lập các chất sau này

- Chuẩn bị dịch chiết cồn: Cho 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 100

ml, thêm 50 ml EtOH 90°, đun cách thủy 10 phút, lọc nóng Dùng dịch lọc làm các phản ứng

- Chuẩn bị dịch chiết ether dầu hỏa: Cho 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, đổ ngập ether dầu hỏa, ngâm qua đêm, lọc Dịch lọc dùng để làm các phản ứng

3.1.1 Định tính alcaloid

Lấy 5 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm dung dịch

H2SO4 20% cho ngập dược liệu, đun sôi vài phút Để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn, kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6 N đến pH kiềm Chiết alcaloid bằng cloroform ( CHCl3) 3 lần, mỗi lần 5 ml Dịch chiết CHCl3 được gộp lại và lắc với H2SO4 2% Gạn lấy lớp nước acid, cho vào

3 ống nghiệm, mỗi ống khoảng 1 ml rồi thêm vào:

- Ống 1: 2 - 3 giọt TT Dragendorff, dung dịch trong suốt, không có tủa vàng cam

- Ống 2: 2 - 3 giọt TT Mayer, dung dịch có tủa vàng nhạt, lượng ít

- Ống 3: 2 - 3 giọt TT Bouchardat, dung dịch trong suốt, không có tủa nâu Kết luận: dược liệu có vết alcaloid

3.1.2 Định tính anthranoid

- Phản ứng Borntraeger: cho 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 10 ml dung dịch H2SO4 25% cho ngập dược liệu rồi đun sôi trong vài

phút Lọc dịch chiết vào bình gạn, để nguội rồi lắc với 5 ml ether Lấy 1

ml dịch ether cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml KOH 10%, lắc kỹ

Kết luận: dược liệu không có anthranoid

3.1.3 Định tính flavonoid

- Phản ứng Cyanidin: cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm một ít bột M g kim loại, rồi thêm vài giọt HCl đặc Đun nóng trên bếp cách thủy sau vài phút thấy xuất hiện màu xanh nâu

- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm 2 - 3 giọt dung dịch FeCl3 5%, thấy dung dịch chuyển màu xanh rêu

- Phản ứng với kiềm: Nhỏ vài giọt dịch chiết cồn lên một mảnh giấy lọc, hơ khô rồi đặt mảnh giấy lên miệng lọ amoniac đặc, không thấy màu vàng, khi soi dưới đèn tử ngoại không thấy có màu vàng sáng

Kết luận: dược liệu không có chứa flavonoid

3.1.4 Định tính saponin

- Hiện tượng tạo bọt: Cho bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 10 ml nước lắc mạnh trong 5 phút Để yên, thấy bọt bền vững sau 15 phút

- Phản ứng Salkowski: Lấy 10 ml dịch chiết cồn cho vào bình nón và thêm

10 ml H2SO4 loãng Đun sôi cách thủy vài phút Để nguội, chiết với cloroform Lấy khoảng 2 ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm Thêm từ từ 1 ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm, quan sát thấy giữa hai lớp xuất hiện vòng đỏ nâu

- Phản ứng Liebermann - Burchardt: Lấy 1 ml dịch chiết cloroform ở trên cho vào 1 ống nghiệm rồi cô tới cắn Cho vào cắn 0,5 m l anhydrid acetic, lắc đều, đặt nghiêng ống 45° rồi thêm 0,5 ml acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm để dịch lỏng trong ống chia thành 2 lớp, quan sát thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng trong ống nghiệm có màu đỏ

Kết luận: dược liệu có chứa saponin

3.1.5 Định tính tanin

- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: Lấy 1 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 20 ml Thêm nước ngập dược liệu rồi đun sôi vài phút Lọc nóng, lấy 1 ml dịch lọc cho vào 3 ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch gelatin 1%, không thấy xuất hiện tủa bông

Kết luận: dược liệu không có tanin

- Phản ứng với thuốc thử diazo: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn, thêm vào đó 2 ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thủy tới sôi, để nguội, thêm vài giọt thuốc thử diazo (mới pha), không thấy xuất hiện tủa màu đỏ gạch

Kết luận: dược liệu không có coumarin

3.1.7 Định tính acid amin

- Phản ứng với ninhydrin: Lấy 3 ml dịch chiết cồn cho vào ống nghiệm Thêm vài giọt thuốc thử Ninhydrin 0,5%, đun sôi 2 phút, quan sát thấy dung dịch chuyển màu xanh rêu

Kết luận: dược liệu không có acid amin

3.1.8 Định tính acid hữu cơ

- Phản ứng với Na2CO3: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn và cô tới cắn Hòa cắn trong 1 ml nước và thêm vài tinh thể Na2CO3 không thấy có bọt khí nổi lên

Kết luận: dược liệu không có acid hữu cơ

3.1.9 Định tính đường khử

- Phản ứng với TT Fehling: lấy 1 ml dịch chiết cồn cho vào ống nghiệm, thêm 3 giọt TT Fehling A và 3 giọt TT Fehling B, đun cách thủy trong 10 phút, không quan sát thấy tủa màu đỏ

Kết luận: dược liệu không có đường khử

- Phản ứng với H2SO4 đặc: cô 5 ml dịch chiết ether dầu hỏa tới cắn, thêm 1 -

2 giọt acid sulfuric đặc, thấy xuất hiện màu xanh ve

Kết luận: dược liệu có carotenoid

3.1.12 Định tính phytosterol

- Phản ứng Liberman: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết ether dầu hỏa Bốc hơi dung môi đến khô, cho vào ống nghiệm 1 ml anhydrid acetic, lắc kỹ, thêm 1 ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm Kết quả cho thấy giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện một vòng tím đỏ

Kết luận: dược liệu có phytosterol

Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong mảnh bát Coccinia indica

bằng phản ứng hóa học được tóm tắt trong bảng 3.1

0,5%

Ghi chú: (-) âm tính, (+) dương tính, (++) dương tính rõ

Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân, lá mảnh bát

(Coccinia indica) bằng phản ứng hóa học

Nhận xét – bàn luận:

Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học cho thấy thân, lá mảnh bát có chứa saponin triterpenoid, vết alkaloid, phytosterol và carotenoid và bằng phương pháp này không thấy sự có mặt của flavonoid, anthranoid, tanin, acid amin, acid hữu cơ, đường khử tự do và chất béo

Trong các nghiên cứu khác, trong mảnh bát có flavonoid, tanin, acid amin và chất béo có thể do chúng có hàm lượng ít hoặc phản ứng chưa đủ nhạy để phát hiện

Bằng kết quả định tính này và các nghiên cứu về tác dụng dược lý cho thấy cấc chất kém phân cực có khả năng chữa tiểu đường tốt chúng tôi quyết định lựa chọn khảo sát hai phân đoạn cao chiết n - hexan và EtOAc từ dịch chiết EtOH 96% thân và lá mảnh bát

3.2 Chiết xuất phân đoạn dịch chiết n - hexan và ethyl acetat thân, lá

mảnh bát Coccinia indica

- Xử lý dược liệu

Dược liệu (thân, lá) được thu hái, phơi và sấy khô ở nhiệt độ 55 - 60°C Xác định hàm ẩm dược liệu: 9,39%

Tán nhỏ dược liệu, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo

- Chiết dược liệu với cồn 96°:

Chiết hồi lưu 1 k g dược liệu với 10 l EtOH 96° 3 lần, mỗi lần 2h Sau

đó, gộp dịch chiết rồi lọc qua bông

Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới cắn Thu được cao toàn phần Cân khối lượng cao Ctp = 214,2g

- Chiết phân đoạn dược liệu với n - hexan và ethyl acetat

+ Phân tán đều cắn EtOH toàn phần vào một lượng tối thiểu nước nóng

+ Chiết tiếp với đồng lượng dung môi n - hexan bằng phễu chiết đến khi lớp

n - hexan gần như không màu

Thu các lớp dịch chiết n – hexan, đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới cắn Cắn phân đoạn n - hexan có màu xanh sẫm, dạng keo dính Cân khối lượng cắn CH = 42,5g

+ Phần còn lại chiết tiếp với đồng lượng dung môi ethyl acetat bằng phễu chiết đến khi lớp ethyl acetat gần như không màu

Thu các phần dịch chiết ethyl acetat, đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới cắn Cắn ethyl acetat thu được dưới dạng cắn khô màu vàng nâu Cân khối lượng CE = 9,8g

Sơ đồ chiết xuất dược liệu được tóm tắt trong sơ đồ 3.1

Sơ đồ 3.1: Tóm tắt quy trình chiết phân đoạn từ thân lá mảnh bát

3.3 Định tính phân đoạn dịch chiết n - hexan, ethyl acetat của mảnh bát bằng sắc ký lớp mỏng

3.3.1 Định tính phân đoạn dịch chiết n - hexan bằng sắc ký lớp mỏng

- Chuẩn bị:

+ Dung dịch chấm sắc ký:

Cắn n - hexan được hòa tan lại trong n - hexan để chấm sắc ký

Chất đối chiếu β - sitosterol hòa tan trong chloroform (nồng độ 1 mg/ ml) + Bản mỏng: bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 được hoạt hóa ở 110°C trong 30 phút

+ Hệ dung môi khai triển: n - hexan: EtOAc = 90: 10

- Tiến hành

Chấm sắc ký cắn n - hexan và chất đối chiếu β - sitosterol lên bản mỏng Pha hệ dung môi, lắc đều, để ổn định 5 phút

Đặt bản mỏng vào hệ dung môi khai triển

Sắc ký sau khi khai triển sấy nhẹ cho bay hết dung môi

Kết quả - bàn luận:

Kết quả thể hiện qua sắc ký đồ, hình 3.2

Quan sát các vết sắc ký dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 nm thấy xuất hiện 6 vết chính

Dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 365 nm xuất hiện 6 vết chính

Hiện màu bằng thuốc thử H2SO4 xuất hiện 7 vết có Rf lần lượt là 0,1; 0,27; 0,33; 0,4; 0,73; 0,77; 0,96

Kết quả sắc ký lớp mỏng cho thấy phân đoạn này có nhiều chlorophyll

và carotenoid (có huỳnh quang đỏ dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng λ =

365 nm) và các hợp chất triterpenoid (các vết có màu tím đỏ khi hiện màu

với thuốc thử H2SO4)

Từ các nghiên cứu về thành phần hóa học, mảnh bát chứa β - sitosterol

là phytosterol phổ biến trong thực vật nên chúng tôi sử dụng sắc ký lớp mỏng so sánh cắn phân đoạn n – hexan với chất đối chiếu β – sitosterol Trên sắc ký đồ, chất đối chiếu β - sitosterol không quan sát được dưới ánh sáng tử ngoại nhưng hiện màu hồng khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH rồi hơ nóng, có cùng màu và cùng giá trị Rf với 1 vết của phân đoạn n – Hexan Vì vậy sơ bộ có thể kết luận trong phân đoạn n – Hexan của mảnh bát

Coccinia indica có chứa β - sitosterol

Hình 3.2: Sắc kí đồ phân đoạn n – hexan dưới ánh sáng tử ngoại hai bước sóng λ = 254 nm và λ = 365 nm

I: Cắn n – Hexan II: β – sitosterol

3.3.2 Định tính phân đoạn dịch chiết EtOAc bằng sắc ký lớp mỏng

+ Dung dịch chấm sắc ký: Cắn EtOAc được hòa tan lại trong EtOAc để chấm sắc ký

+ Hệ dung môi khai triển: DCM: MeOH = 90:10

- Kết quả - bàn luận:

Kết quả thể hiện qua sắc ký đồ, hình 3.3

Hình 3.3: Sắc kí đồ phân đoạn EtOAc dưới ánh sáng tử ngoại hai bước sóng

λ = 254 nm và λ = 365 nm và sau khi hiện màu với thuốc thử H 2 SO 4.

Quan sát các vết sắc ký dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 nm thấy các vết mờ trong đó có ít nhất 3 vết Các vết có Rf lớn, ít phân cực hầu như không hiện UV có bước sóng 254 nm

Soi UV với bước sóng 365 nm hiện ít nhất 8 vết của các chất ít phân cực

có Rf lớn có huỳnh quang xanh lam và huỳnh quang đỏ

Hiện màu bằng thuốc thử H2SO4 xuất hiện ít nhất 5 vết có Rf lần lượt là 0,2; 0,4; 0,52, 0,58; 0,93; 1 Trong đó vết có Rf 0,4 hiện rõ, màu hồng tím

3.4 Phân lập và xác định cấu trúc một số chất trong phân đoạn n - hexan 3.4.1 Phân lập bằng sắc ký cột:

trên giá Vặn khóa cột Lót 1 lớp bông sạch ở đáy cột

Thêm n - hexan vào silicagel đã hoạt hóa, khuấy đều tạo hỗn dịch, chú ý loại bỏ hết bọt khí Rót từ từ hỗn dịch lên cột theo thành cột Dùng pipet rửa thành cột bằng n - hexan Cho dung môi chạy qua cột vài lần để ổn định cột

- Chuẩn bị mẫu đưa lên cột

Hòa tan cắn vào lượng tối thiểu dung môi và cho lượng tối thiểu silicagel vào khuấy đều cho chất hấp phụ hết lên silicagel Tiếp tục khuấy cho dung môi bay hơi tự nhiên đến khi khô tơi

Điều chỉnh khóa cột sao cho tốc độ rửa giải khoảng 20 giọt/phút

Dịch rửa giải được hứng vào các ống nghiệm đã đánh số thứ tựKiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi: n - hexan: EtOAc, quan sát bản mỏng dước ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng 254

nm, 365 nm Sau đó phun thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH rồi hơ nóng, gộp các phân đoạn ống có sắc ký đồ giống nhau

Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập các chất trong cắn n – hexan

- Cắn n – hexan của mảnh bát tẩm với 120g silicagel, chạy cột thu được 3 phân đoạn chính lần lượt là H1 (10 g), H2 (12g), H3 (11g) Trong khuôn khổ khóa luận, chúng tôi chỉ tập trung vào phân đoạn H1 và H2

- Phân đoạn H1 tẩm với 30g silicagel Sau khi gộp các ống có sắc ký đồ giống nhau thu được 3 phân đoạn chính: Phân đoạn 3, phân đoạn 5 – 9 và phân đoạn

H2SO4 xuất hiện 1 vết gọn, kí hiệu MH1 (0,04 g) và MH2 (0,075 g), sơ bộ xác định là chất sạch

Kết quả thể hiện qua sắc ký đồ, hình 3.4

Hút bớt dung dịch, rủa tủa bằng MeOH sau đó rửa nhanh với n Hexan thu

được chất có màu trắng ngà, lượng chất ~ 0,3 g

Chấm sắc kí kiểm tra, so sánh với β - sitosterol với hệ dung môi: n - hexan: EtOAc (90: 10), thấy có xuất hiện vết có màu tương tự và Rf bằng Rf

của β – sitosterol nhưng chưa sạch

Kết quả thể hiện qua sắc ký đồ, hình 3.5

Hình 3.5 Sắc kí đồ chất chuẩn β - sitosterol và phân đoạn ống 41 - 50

Hòa lượng nhỏ chất kết tinh trong DCM Chấm so sánh với β - sitosterol với hệ dung môi: n - hexan: EtOAc (90: 10) thấy vết gọn Rf của MH41 tương

tự Rf của chất chuẩn

Kết quả thể hiện qua sắc ký đồ hình 3.6