3.4.1 Phân lập bằng sắc ký cột:
Chuẩn bị:
- Chuẩn bị chất hấp phụ
Cân silicagel 60 (cỡ hạt 0,04 - 0,063 mm) được hoạt hóa ở 110°C trong 1h.
Để nguội ở bình hút ẩm. - Chuẩn bị cột
trên giá. Vặn khóa cột. Lót 1 lớp bông sạch ở đáy cột.
Thêm n - hexan vào silicagel đã hoạt hóa, khuấy đều tạo hỗn dịch, chú ý loại bỏ hết bọt khí. Rót từ từ hỗn dịch lên cột theo thành cột. Dùng pipet rửa thành cột bằng n - hexan. Cho dung môi chạy qua cột vài lần để ổn định cột. - Chuẩn bị mẫu đưa lên cột
Hòa tan cắn vào lượng tối thiểu dung môi và cho lượng tối thiểu silicagel vào khuấy đều cho chất hấp phụ hết lên silicagel. Tiếp tục khuấy cho dung môi bay hơi tự nhiên đến khi khô tơi.
Tiến hành:
- Đưa chất lên cột
Mở khóa cột cho dung môi chảy từ từ đến khi lớp dung môi trong cột gần bề mặt silicagel.
Đưa từ từ silicagel đã hấp phụ chất lên cột, tránh xáo trộn cột. Chú ý phải đưa từ từ để tránh silicagel vón cục và phân tán không đều.
Bổ sung nhẹ nhàng dung môi n - hexan, tránh gây xáo trộn. - Rửa giải
Sử dụng hệ dung môi n - hexan và EtOAc tăng dần độ phân cực (gradient lượng EtOAc từ 0% đến 20%).
Điều chỉnh khóa cột sao cho tốc độ rửa giải khoảng 20 giọt/phút.
Dịch rửa giải được hứng vào các ống nghiệm đã đánh số thứ tự Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi: n - hexan: EtOAc, quan sát bản mỏng dước ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm, 365 nm. Sau đó phun thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH rồi hơ nóng, gộp các phân đoạn ống có sắc ký đồ giống nhau.
Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập các chất trong cắn n – hexan
- Cắn n – hexan của mảnh bát tẩm với 120g silicagel, chạy cột thu được 3 phân đoạn chính lần lượt là H1 (10 g), H2 (12g), H3 (11g). Trong khuôn khổ khóa luận, chúng tôi chỉ tập trung vào phân đoạn H1 và H2.
- Phân đoạn H1 tẩm với 30g silicagel. Sau khi gộp các ống có sắc ký đồ giống nhau thu được 3 phân đoạn chính: Phân đoạn 3, phân đoạn 5 – 9 và phân đoạn 20 – 28.
+ Để bay hơi bớt dung môi, phân đoạn 3 và phân đoạn 5 - 9 có xuất hiện cắn ở đáy ống nghiệm. Rửa cắn bằng n – Hexan, được chất màu trắng, xốp. Chất tan ít trong CHCl3.
Lấy một lượng nhỏ chất rắn hòa tan trong CHCl3 chấm sắc kí với hệ dung môi n - hexan: EtOAc (90: 10). Soi bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại hai bước sóng λ = 254 nm và λ = 365 nm không thấy hiện vết. Hiện màu với thuốc thử H2SO4 xuất hiện 1 vết gọn, kí hiệu MH1 (0,04 g) và MH2 (0,075 g), sơ bộ xác định là chất sạch.
Kết quả thể hiện qua sắc ký đồ, hình 3.4.
Hình 3.4 Sắc kí đồ chất MH1 (3) và MH2 (9)
Đo nhiệt độ nóng chảy của 2 chất MH1 và MH2 lần lượt là 85°C và 82°C.
+ Phân đoạn 20 – 28 tiếp tục lên cột với 5 g silicagel để phân tách chất. Sau khi gộp các ống có sắc ký đồ giống nhau, để bay hơi bớt dung môi, nhận thấy phân đoạn ống 41 - 50 xuất hiện tinh thể hình kim, màu trắng bám trên thành ống, tan ít trong n – Hexan, tan trong EtOAc và DCM.
được chất có màu trắng ngà, lượng chất ~ 0,3 g
Chấm sắc kí kiểm tra, so sánh với β - sitosterol với hệ dung môi: n - hexan: EtOAc (90: 10), thấy có xuất hiện vết có màu tương tự và Rf bằng Rf
của β – sitosterol nhưng chưa sạch.
Kết quả thể hiện qua sắc ký đồ, hình 3.5
Hình 3.5 Sắc kí đồ chất chuẩn β - sitosterol và phân đoạn ống 41 - 50
C: β - sitosterol chuẩn T: phân đoạn ống 41 - 50
Sơ bộ nhận xét trong hỗn hợp có β - sitosterol. Tiếp tục lên cột để phân lập chất.
- Phân đoạn ống 41 - 50 lên cột với 0,8 g silica gel Gộp các đoạn có sắc ký đồ sạch, cho dung môi bay hơi tự nhiên cho tinh thể kết tinh hình kim trên thành ống. Rửa chất bằng MeOH thu được chất kết tinh kí hiệu MH41 (0,06 g)
Hòa lượng nhỏ chất kết tinh trong DCM. Chấm so sánh với β - sitosterol với hệ dung môi: n - hexan: EtOAc (90: 10) thấy vết gọn. Rf của MH41 tương tự Rf của chất chuẩn.
Hình 3.6 Sắc kí đồ chất chuẩn β - sitosterol và chất kết tinh MH41 thu được trong hệ dung môi: n -
hexan: EtOAc (90: 10)
C: β - sitosterol chuẩn T: Chất kết tinh MH41
Đo nhiệt độ nóng chảy MH41 là 136 °C - 138°C, trùng với nhiệt độ nóng chảy của β – sitosterol. Sơ bộ xác định MH41 là β – sitosterol.
- Phân đoạn H2 tẩm với 30g silicagel. Sau khi gộp các ống có sắc ký đồ giống nhau thu được 2 phân đoạn chính: Phân đoạn 4 – 5 và phân đoạn 17 – 18. + Phân đoạn 4 – 5 tiếp tục lên cột thu được phân đoạn 11-18 có xuất hiện tinh thể hình kim, rửa bằng MeOH và n – Hexan thu được tinh thể trắng kí hiệu MH11 (0,03 g) ( chấm sắc ký kiểm tra khác β – sitosterol) nhưng kết quả đo phổ cho thấy chất chưa sạch, dự đoán là hỗn hợp của các chất có cấu trúc tương tự nhau.
+ Phân đoạn 17 – 18 lên cột thu được các phân đoạn 7 - 8 và phân đoạn 27, tinh chế cũng thu được các chất rắn màu trắng kí hiệu MH7 (0,035g) và MH27 (0,02 g) nhưng kết quả đo phổ chưa sạch, dự đoán là hỗn hợp của các chất có cấu trúc tương tự nhau.
3.4.1 Xác định cấu trúc.
- Chất MH1:
Phổ IR: ν = 3500-335,69 cm-1; 2925,79 cm-1 (CH3-); 28551,2 cm-1 (CH2- ); δCH = 1466,78, 1406,29 cm-1 (CH2, CH3); νC-O-H = 1062,63 cm-1
Trên phổ 1H NMR chúng ta thấy xuất hiện 4 nhóm tín hiệu proton đặc trưng: trong đó có 2 H (δ = 3,64 ppm, q, J =7 Hz) gắn với -OH và gắn với nhóm -CH2, nhóm 4 H tiếp theo (δ = 1,56 ppm, m) và tiếp theo là 56 H đặc trưng cho 28 nhóm -CH2 giữa mạch hidrocacbon, và nhóm -CH3 (δ = 0,88 ppm).
Trên phổ 13C ta thấy xuất hiện tín hiệu đặc trưng của C (δ = 63,13 ppm) gắn với nhóm –OH, một tín hiệu có δ = 14,11 ppm đặc trưng cho nhóm methyl (-CH3), ngoài ra còn có 7 nhóm tín hiệu đặc trưng cho nhóm CH2- của mạch cacbon không phân nhánh. Từ đây có thể dự đoán MH1 có công thức phân tử như sau: C32H65OH (M = 466 mol/g).
Dựa vào phổ ESI-MS, ta thấy xuất hiện các mảnh phân tử đặc trưng như sau: [M-C11H23]- = 311, [M - C10H21]- = 325
Từ đây cho phép ta dự đoán MH1 là một rượu no bậc1, 1-dotriacontanol, có công thức cấu tạo như hình 3.7:
OH Hình 3.7 CTCT của MH1 - Chất MH2: Phổ IR: ν = 2911,65 cm-1 (CH3-); 2855,12 cm-1 (CH2-); ν = 1706,67 cm-1 (C=O) δ= 1469,67 cm-1 (-CH2, -CH3).
Trên phổ 1H NMR chúng ta thấy xuất hiện 4 nhóm tín hiệu proton đặc trưng: trong đó có 2 H (δ = 2,36 ppm, t, J= 1,5 Hz) gắn với C=O và gắn với nhóm -CH2, 3H tiếp theo (δ = 1,66 ppm, m)), và tiếp theo là 56 H đặc trưng cho 28 nhóm -CH2 giữa mạch hidrocacbon, và nhóm -CH3 (δ = 0,88 ppm, t, J = 7 Hz) gắn với -CH2.
Trên phổ 13C của MH2 ta thấy xuất hiện 11 tín hiệu C, trong đó δ = 14,11 ppm đặc trưng cho nhóm methyl (-CH3), các tín hiệu δ = 33,62 ppm, δ = 31,94 ppm đặc trưng cho hai nhóm -CH2 cạnh C=O, các tín hiệu còn lại đặc trưng cho các nhóm -CH2 có trong mạch dài. Từ đây có thể dự đoán công thức phân tử như sau: C32H66CO
Dựa vào phổ ESI-MS, ta thấy xuất hiện các mảnh phân tử [M- C10H21]- = 325, [M- C11H23]- = 311.[5]
Từ đây cho phép ta dự đoán MH2 là một ceton có công thức phân tử như hình 3.8: O Hình 3.8. CTCT của MH2 - MH41: Phổ IR: ν = 3426,59 cm- 1 (- OH); 2942,99 cm - 1 (-CH2-); ν = 1654,63 cm- 1 (C = C) δ = 1459,06, 1374,55 cm - 1 (- CH2, - CH3), ν = 1051,01 cm - 1 (C - OH).
Phổ khối m/z là [M]+ = 414,09, tương ứng với công thức phân tử là C29H50O.
Phổ 1H - NMR (500 MHz, CDCl3): Trên phổ 1H - NMR của chất xuất hiện tín hiệu đặc trưng cho hydroxy methin C - 3 (δH 3,21, 1 H, m). 2 tín hiệu singlet đặc trưng cho 2 nhóm methyl (δH 1,029; 0,68), thêm vào đó sự có mặt của nhóm methin olefinic thể hiện qua tín hiệu ở 5,35 ppm (1H, t, J = 2,5 Hz). Ngoài ra 4 tín hiệu của nhóm methyl còn lại độ chuyên dịch (δH 1,57; 0,94; 0,84; 0,81), cho ta các giả thuyết về một phần cấu trúc đặc trưng cho terpen khung stigmastan.
Trên phổ 13C: Phân tích phổ C13 cho thấy có 29 C, có tín hiêu đặc trưng của liên kết olefinic có độ chuyển dịch δ = 140 ppm và 121,7 ppm. Độ chuyển dịch δ = 71,8 ppm đặc trưng cho nhóm methin gắn với nhóm hidroxy. Tín hiệu đặc trưng cho 6 nhóm methyl tại δ = 19,8; 19,4; 18,8; 19,0; 11,9; 11,9.
Từ việc phân tích phổ và dựa vào các tài liệu đã công bố có thể khẳng định đây là Stigmast - 5 - en - 3 - ol hay còn gọi là β - sitosterol, có công thức trong hình 3.9. [6][19]. HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
Hình 3.9. Công thức cấu tạo của MH41 (β - sitosterol) Bảng 3.2. Phổ 1H, 13C - NMR của MH41 STT C H (J, Hz) 1 37,27 - 2 32,68 - 3 72,82 3,52 (1H, m) 4 42,34 - 5 140,78 - 6 121,72 5,37 (1H, t, J = 2,5 Hz). 7 31,92 -
8 31,68 - 9 50,16 - 10 36,91 - 11 21,10 - 12 39,80 - 13 42,32 - 14 56,79 - 15 24,31 - 16 28,25 - 17 56,48 - 18 11,99 0,68 (3H, s) 19 19,82 1,02 (3H, s) 20 36,52 - 21 19,05 0,92 (3H, d, J = 9 Hz) 22 33,96 - 23 26,12 - 24 45,86 - 25 29,18 - 26 19,82 0,84 (3H, d, J = 2 Hz) 27 19,05 - 28 23,08 0,81 (3H, m) 29 12,87 0,84 (3H, d,J = 2 Hz)
- Bàn luận mối liên hệ của β – sitosterol trong tác dụng của cây mảnh bát: Beta - sitosterol là một trong những dạng phổ biến của phytosterol còn được gọi là "sterol ester thực vật” có tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, chống vi khuẩn và tác dụng chống viêm.
Beta - sitosterol đã được sử dụng để làm thuốc, cho bệnh tim và mỡ máu. Nó cũng được sử dụng để thúc đẩy hệ thống miễn dịch và ngăn ngừa ung thư ruột kết, cũng như sỏi mật, nhiễm lạnh và cúm, viêm khớp dạng thấp, bệnh lao, bệnh vẩy nến, dị ứng, ung thư cổ tử cung, đau cơ, lupus ban đỏ hệ thống (SLE), hen suyễn, rụng tóc, viêm phế quản, chứng đau nửa đầu, và mệt mỏi. Đàn ông sử dụng beta - sitosterol cho bệnh tăng sản tuyến tiền liệt lành tính hoặc BPH. Phụ nữ sử dụng để giảm các triệu chứng của thời kỳ mãn kinh . Nó cũng được sử dụng để tăng cường hoạt động tình dục. Vận động viên maraton đôi khi sử dụng beta - sitosterol để giảm đau và sưng sau khi chạy. Một số người sử dụng beta - sitosterol cho da để điều trị vết thương và bỏng. Trong thực phẩm, beta - sitosterol được thêm vào một số loại bơ thực vật để sử dụng như một phần của hạ cholesterol của chế độ ăn uống và ngăn ngừa bệnh tim . FDA cho phép các nhà sản xuất tuyên bố rằng các loại thực phẩm có chứa các este sterol thực vật như beta - sitosterol là để giảm nguy cơ mạch vành tim bệnh (bệnh mạch vành). Mặc dù có rất nhiều bằng chứng cho thấy beta - sitosterol làm mức cholesterol thấp hơn, nhưng không có bằng chứng nào cho thấy sử dụng lâu dài beta - sitosterol thực sự làm giảm nguy cơ phát triển bệnh mạch vành.[8]