acetat:
3.5.1. Phân lập bằng sắc ký cột
Chạy cột sắc ký tương tự với hệ dung môi DCM và MeOH tăng dần độ phân cực (gradient lượng MeOH từ 0% đến 20%).
Sơ đồ 3.3: quy trình phân lập cắn ethyl acetat
- Phân đoạn H2 được tẩm với 25 g silicagel chạy cột để phân lập. Để bay hơi bớt dung môi, nhận thấy phân đoạn ống 34 - 40 xuất hiện tinh thể bám trên thành ống, tinh thể tan ít trong n – Hexan, EtOAc và DCM.
Hút bớt dung dịch, rửa tủa bằng MeOH sau đó rửa nhanh với n Hexan thu được chất có màu trắng ngà, lượng chất ~ 0,5g
Chấm sắc kí kiểm tra với hệ dung môi: DCM: MeOH (90: 10), nhận thấy xuất hiện một vết chính có Rf bằng 0,4, kí hiệu ME40 nhưng chưa sạch (còn dính 1 vết có Rf bằng 0,35)
Hình 3.10 Sắc kí đồ phân đoạn 34 - 40 thu được trong hệ dung môi:
DCM: MeOH (90: 10)
- Kiểm tra so sánh với cắn EtOAc nhận thấy đoạn 34 - 40 chính là chất có Rf
0,4 hiện màu hồng tím với thuốc thử H2SO4. Kết quả thể hiện qua sắc ký đồ, hình 3.11
Hình 3.11 Sắc kí đồ cắn EtOAc và chất ME40 trong hệ dung môi DCM:
MeOH (90: 10)
Tiếp tục chạy cột tinh chế phân đoạn 34 - 40 này. Các phân đoạn khác có nhiều vết, tách không rõ ràng.
- Phân đoạn 34 – 40 tẩm với 1,5g silicagel, gộp các ống nghiệm có vết sạch. Để dung môi bay hơi tự nhiên cho tinh thể kết tinh trên thành ống.
ME40 là chất kết tinh màu trắng, đo nhiệt độ nóng chảy được 360°C - 362°C. Trên sắc kí không hiện UV ở cả 2 bước sóng λ = 254 nm và λ = 365 nm. Hiện màu hồng với thuốc thử H2SO4 để lâu chuyển sang màu xám có Rf
0,4 trong hệ dung môi DCM: MeOH (90: 10)
Nhận xét chất ME40 có nhiệt độ nóng chảy tương tự daucosterol. Hòa lượng nhỏ chất kết ME40 trong DCM. Chấm so sánh với daucosterol chuẩn với hệ dung môi: DCM: MeOH (90: 10)
Kết quả thể hiện qua sắc ký đồ, hình 3.12
Hình 3.12 Sắc kí đồ chất chuẩn daucosterol và chất ME40 thu được
trong hệ dung môi: DCM: MeOH (90: 10)
T: chất thu được ME40 C: Daucosterol chuẩn.
Nhận xét: Chất thử chạy sắc ký cho vết tương đối gọn, có Rf của ME40 tương tự Rf của chất chuẩn daucosterol. Sơ bộ xác định EM40 là daucosterol.
3.5.2 Xác định cấu trúc chất phân lập được
- Nhiệt độ nóng chảy: 297 – 300 °C
- Phổ IR: ν = 3404,88 cm-1 (-OH); 2949,36 cm-1 (CH2-); ν = 1613,65 cm-1
(C=C)
Phổ khối m/z là [M-H+2H2O]- = 611,25, [M+Na]+= 599,29 tương ứng với công thức phân tử là C35H60O6.
Trên phổ 1H-NMR cho thấy xuất hiện tín hiệu đặc trưng (δH 3,16 ppm, m, 1H) của proton thuộc nhóm methin (H-3) liên kết dị tố oxi, ngoài ra ta còn thấy xuất hiện tín hiệu đặc trưng cho nhóm methin olefinic thể hiện qua tín hiệu ở 5,39 ppm (1H, d, J = 5 Hz), 2 tín hiệu singlet đặc trưng cho 2 nhóm methyl (δH 1,05; 0,75). Ngoài ra 4 tín hiệu của nhóm methyl còn lại độ chuyên dịch (δH 1,22; 0,96; 0,90; 0,84). Từ các giữ kiện trên cho ta các giả thuyết về một phần cấu trúc đặc trưng cho terpen khung stigmastan.
Ngoài ra trên phổ cho thấy xuất hiện tín hiệu proton đặc trưng cho vòng đường, trong đó H-anome có ở δH = 4,3 ppm., với hằng số ghép cặp J = 8, chứng tở đường phải có cấu hình đường beta. Các tín hiệu trong vùng từ 3,2 ppm-3,88 ppm, cho thấy đây là một đường glucozo. Số liệu phổ thu được kết hợp với việc so sánh với chất đối chứng, cho ta thấy số liệu phổ phù hợp với công thức đã công bố của hợp chất Daucosterol
O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 O HO HO HO OH H H 1' 2' 3' 4' 5' 6' (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
TT H (J, Hz) (500 MHz, CD3OD) Tài liệu H (J, Hz) (500 MHz,
CDCl3 + CD3OD)[16]
1 2
3 3,16 (1H, m) 3,59 (1H, m) 4 5 6 5,39 (1H, d, J = 5 Hz) 5.37 (1H, d, J = 5,0 Hz) 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 0,75 (3H, s) 0,70 (1H, s) 19 1,05 (3H, s) 1,03 (1H, s) 20 21 0,96 (3H, d, J = 6,5 Hz) 0,95 (1H, d, J = 5,1 Hz), 22 23
24 25 26 0,90 (3H, m) 0,94 (1H, d, J = 5.3 Hz) 27 0,84 (3H, m) 0,83 (1H, d, J = 6,9 Hz) 28 29 0,85 (3H, br s), 1’ 4,39 (1H, d, J = 8 Hz) 4,41 (1H, d, J = 7, 9 Hz) 2’ 3,29 (1H, m) 3,23 (1H, t, J = 7,9 Hz) 3’ 3,60 (1H, m) 3,42 (1H, t, J = 7,9 Hz), 4’ 3,60 (1H, m) 3,42 (1H, m) 5’ 3,29 (1H, m) 3,29 (1H, m) 6’ 3,86 (1H, t, J = 2 Hz) 3,67 (1H, m) 3,75 (1H, dd, J = 10,0; 5,0 Hz), 3,84 (1H, d, J = 10,0 Hz)
- Bàn luận Mối liên hệ của daucosterol trong tác dụng của cây mảnh bát Daucosterol là một glycosid của beta – sitosterol có tác dụng điều hòa miễn dịch, chống nấm candida và vi khuẩn, phòng ngừa hoặc điều trị Parkinson, chống khối u và có thể sử dụng như một chất chống oxi hóa.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
1. Kết luận
Sau quá trình thực hiện khóa luận, chúng tôi đã thu được một số kết quả: - Xác định được thân lá mảnh bát (Coccinia indica) có các nhóm chất: saponin triterpenoid, vết alkaloid, phytosterol và carotenoid và bằng phương pháp này không thấy sự có mặt của flavonoid, anthranoid, tanin, acid amin, acid hữu cơ, đường khử tự do và chất béo.
- Đã phân lập được một số chất trong phân đoạn n - hexan và ethyl acetat của thân lá mảnh bát MH1 (0,04 g), MH2 (0,075 g), MH41 (0,06 g), ME40 (0,08g)
- Đã nhận dạng được chất phân lập: MH1 là alcol béo no 32 C, MH2 là ceton béo no 32C, MH41 là beta - sitosterol và EM40 là daucosterol.
2. Đề xuất
- Tiếp tục tinh chế và nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của mảnh bát.
- Nghiên cứu phát triển cây mảnh bát (Coccinia indica) thành thuốc chữa bệnh tiểu đường
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Bộ môn Dược liệu (2006), Thực tập dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội.
2. Võ Văn Chi (2012), Từ điển các cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr. 1444 3. Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 4. Võ Văn Chi (2004), Từ điển cây thuốc Việt Nam (bộ mới), tập II, NXB y học, tr. 44 - 45.
5. Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, tập II, NXB Khoa học và kỹ thuật, tr. 650 - 652.
TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI
6. Ajithabai, Sreedevi, Jayakumar, Mangalam S Nair, Deepa P N Nair, Sunitha Rani S P (2011), “Phytochemical Analysis and Radical Scavenging Activity of the Extracts of Costus picatus Linn and Coccinia indica W& A, two Ethnic Medicinal Plants used in the Treatment of Diabetes mellitus”,
Free Radicals and Antioxidants, p. 77 – 82.
7. Akanksha saklani, Versha parcha, Ishan dhulia and Deepak kumar (2012), “Combined effect of coccinia indica (Wight & Arn) and salvadora oleoides (decne) on blood glucose level and other risk factors associated with type 2, diabetes mellitus in alloxan induced diabetic rats”, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, vol 4, Suppl 4, p. 319 - 322.
8. Department of Pharmacology, College of Korean Medicine, Kyung Hee University, Hoegi-dong, Dongdaemun (2014), “The β-sitosterol attenuates atopic dermatitis-like skin lesions through down-regulation of TSLP”,
Experimental biology and medicine (Maywood, N.J.), p. 239.
9. Goldy Yadav, (2010), “Medical properties of ivy gourd (Cephalandra indica)”, International Journal of Pharma. Research & Development, p. 92- 96.
10. Lohitha Na, Srinivasan Sb, Harish Kumar DRa (2012), “Isolation and structural characterization of major phytoconstituents from Coccinia indica
extract (aerial parts)”, contemporary investigations and observations in pharmacy, p. 110 – 115.
11. M Elamathi and M H Muhammad Ilyas (2012), “Phytochemical constituents, fluorescence analysis and proximate composition of
cephalandra indica naud. unripe fruits”, International journal of comprehensive pharmacy, Vol. 03, Issue 09, p. 1 – 3. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
12. Manish Gunjan, Goutam K. Jana, A. K Jha, Umashanker Mishra (2010), “Pharmacognostic and antihyperglycemic study of Coccinia indica”,
International Journal of Phytomedicine 2, p. 36 – 40.
13. NIranjan Sutar, “Pharmacognostical studies of coccinia indica Wight & Arn leaves”, International Journal of Pharma. Research & Development, p. 15 – 18.
14. Preeti Bhadauria, Bharti Arora, Birendra Vimal, Akanksha Kulshrestha (2012), “In vitro Antioxidant Activity of Coccinia Grandis Root Extracts”,
Indo Global Journal of Pharmaceutical Sciences, p. 230 – 237.
15. Sourabh S. Baghel, Sonal Dangi, Prashant Soni, Priya Singh and Yogesh Shivhare (2011), “Acute Toxicity Study of Aqueous Extract of Coccinia indica (Roots)”, Asian J. Res. Pharm. Sci, Vol. 1, Issue 1, p. 23-25.
Mohammed Benkhaled (2012), “Chemical constituents of Centaurea omphalotricha Coss & Durieu ex Batt. & Trab”, Rec. Nat. Prod, pp 292- 295.
17. V. c. bambal, n. s. wyawahare, a. o. turaskar, t. a. deshmukh (2011), “Evaluation of wound healing activity of herbal gel containing the fruit extract of coccinia indica Wight and Arn. (Cucurbitaceae)”, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, vol 3, Suppl 4, p. 319 – 322.
18. Vaishali Sidram Chatage and Udhav Narba Bhale (2012), “Changes in some Biochemical Parameters of Ivy Gourd (Coccinia Indica Wight and Arn”, Fruits after Infection of Fruit Rot, Plant Pathology & Microbiology,
Vol 3, Issue 3, p. 1 – 2.
19. Venkata Sai Prakash Chaturvedula, Indra Prakash (2012), “Isolation of Stigmasterol and β-Sitosterol from the dichloromethane extract of Rubus suavissimus”, Chaturvedula and Prakash, International Current Pharmaceutical Journal, p.239 – 242.
PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: GIẤY CHỨNG NHẬN MÃ SỐ TIÊU BẢN PHỤ LỤC 2: PHỔ HỒNG NGOẠI CỦA MH1 PHỤ LỤC 3: PHỔ 13C - NMR CỦA MH1 PHỤ LỤC 4: PHỔ 13C - NMR CỦA MH1 (tiếp) PHỤ LỤC 5: PHỔ 1H - NMR CỦA MH1 PHỤ LỤC 7: PHỔ HỒNG NGOẠI CỦA MH2 PHỤ LỤC 8: PHỔ 13C - NMR CỦA MH2 PHỤ LỤC 9: PHỔ 13C - NMR CỦA MH2 (tiếp) PHỤ LỤC 10: PHỔ 1H - NMR CỦA MH2 PHỤ LỤC 11: PHỔ 1H - NMR CỦA MH2 (tiếp) PHỤ LỤC 12: PHỔ HỒNG NGOẠI CỦA MH41 PHỤ LỤC 12: PHỔ HỒNG NGOẠI CỦA MH41 PHỤ LỤC 13: PHỔ KHỐI MH41 PHỤ LỤC 14: PHỔ 13C - NMR CỦA MH41 (tiếp) PHỤ LỤC 15: PHỔ 13C - NMR CỦA PHỤ LỤC 16: : PHỔ 1H - NMR CỦA MH41 PHỤ LỤC 18: PHỔ 1H - NMR CỦA MH41 (tiếp) PHỤ LỤC 19: PHỔ HỒNG NGOẠI CỦA ME40 PHỤ LỤC 20: PHỔ KHỐI ME40
PHỤ LỤC 21: : PHỔ 1H - NMR CỦA ME40 PHỤ LỤC 22: PHỔ 1H - NMR CỦA ME40 (tiếp) PHỤ LỤC 23: PHỔ 1H - NMR CỦA ME40 (tiếp)