Bước đầu chế tạo và đánh giá hoạt tính enzyme laccase trong phức hệ nano chitosan

Trong công nghệ sinh học nano, laccase được ứng dụng như những chất cảm biến sinh học gắn với các tiểu phân nano dùng cho kiểm nghiệm miễn dịch, xác định glucose, amin thơm và các hợp ch

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

1 Bộ môn Hóa sinh

2 Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

HÀ NỘI - 2014

ơn chân thành nhất tới :

PGS.TS Lê Quang Huấn

TS Đỗ Hồng Quảng Những người Thầy đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, dìu dắt, giúp đỡ và

đặc biệt đã luôn truyền nhiệt huyết cho em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Em xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới anh Phạm Văn Phúc, chị Nguyễn Hải Vân, Ths Lê Thị Thuỳ Dương và các anh, chị đang công tác

tại Phòng Công nghệ tế bào động vật và Phòng Công nghệ tái tạo môi trường

- Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

đã hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện giúp em hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này

Em cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô giáo, các chị kỹ thuật viên - bộ môn Hóa sinh - trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành đề tài

Cuối cùng xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên, cổ

vũ giúp em hoàn thành chương trình đại học và khóa luận tốt nghiệp

Sinh viên

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Phần 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Laccase 3

1.1.1 Giới thiệu về Laccase 3

1.1.2 Nguồn thu laccase 3

1.1.3 Cấu trúc laccase 5

1.1.5 Đặc tính của laccase 9

1.1.6 Ứng dụng của laccase 10

1.1.7 Phương pháp xác định hoạt tính laccse 11

1.1.8 Các phương pháp tách chiết, tinh sạch enzyme 12

1.2 Chitosan và nano chitosan 14

1.2.1 Nguồn gốc và cấu trúc chitosan 14

1.2.2 Tính chất lý hoá của chitosan 14

1.2.3 Tính chất sinh học của chitosan 15

1.2.4 Tiểu phân nano chitosan 15

1.2.5 Các phương pháp chế tạo hạt nano chitosan 16

Phần 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị 22

2.1.1 Vật liệu 22

2.1.2 Hoá chất 22

2.1.3 Thiết bị, máy móc 22

2.2 Nội dung nghiên cứu 23

2.3.3 Phương pháp xác định tính chất enzyme laccase 26

2.3.4 Phương pháp tạo hạt nano chitosan 28

2.3.5 Phương pháp cố định enzyme laccase lên hạt nano chitosan 30

2.3.6 Phương pháp phân tích đặc điểm của nano chitosan 31

2.3.7 Phương pháp kiểm tra hiệu quả cố định enzyme laccase lên nano chitosan 31

Phần 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33

3.1 Kết quả tách chiết, tinh sạch enzyme laccase 33

3.1.1 Nuôi cấy thu dịch enzyme 33

3.1.2 Tinh sạch protein bằng cột sắc ký lọc gel Sephadex G-75 33

3.1.3 Tinh sạch protein qua cột sắc ký trao đổi ion 35

3.2 Kết quả tạo phức hệ nano chitosan - enzyme laccase 37

3.2.1 Kết quả tạo tiểu phân nano chitosan 37

3.2.2 Kết quả cố định enzyme laccase lên tiểu phân nano chitosan 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO

2,4-D 2,4,- dichlorophenoxyacetic

2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid

ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethybenzthiazoline-6-sulphonic acid DMP Dimethylphenol

DDT Dichloro diphenyl trichloroethane

HAA 3-hydroxyanthranillic acid

PDA Potato dextrose agar

SDS Sodium dodecyl sulfate

TNT Trinitrotoluen

VLA Violuric acid

Bảng 2.1 Thành phần của một bảng gel polyacrylamid 28

Bảng 3.1 Tóm tắt quá trình tinh sạch laccase từ chủng

Tên hình Nội dung Trang

Hình 1.1 Cấu trúc không gian ba chiều của laccase 6

Hình 1.4 Phản ứng deacetyl hoá chitin tạo thành chitosan 15

Hình 1.5 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp tạo liên kết ngang nhũ

tương

18

Hình 1.6 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp giọt tụ 19

Hình 1.7 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp hợp nhất giọt nhũ

tương

20

Hình 1.8 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp tạo gel ion 21

Hình 1.9 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp mixen đảo 22

Hình 2.2 Sơ đồ phản ứng depolymer hoá chitosan phân tử lượng

Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm tinh sạch laccase từ chủng

Cerrena sp.FBV25 qua cột sắc ký lọc gel G-75 trên gel polyacrymide

36

Hình 3.3 Hàm lương protein và hoạt tính các phân đoạn sau khi

qua cột trao đổi ion

37

Hình 3.4 Điện di đồ sản phẩm tinh sạch laccase từ chủng

Cerrena sp.FBV25 trên gel polyacrymide

38

Hình 3.8 Hình ản phản ứng màu của laccace với ABTS 42

ĐẶT VẤN ĐỀ

Laccase là một polyphenol enzyme thuộc nhóm enzyme oxidase có bốn nguyên tử đồng trong phân tử Laccse có khả năng xúc tác phản ứng oxy hoá của nhiều cơ chất khác nhau với chất nhận điện tử cuối cùng là oxy Được tìm ra lần đầu tiên từ năm 1883 [15], enzyme laccase đã thu hút được rất nhiều sự chú ý của các nhà nghiên cứu trong thập kỉ qua bởi đặc tính sinh học

tự nhiên của nó Trong công nghệ sinh học nano, laccase được ứng dụng như những chất cảm biến sinh học gắn với các tiểu phân nano dùng cho kiểm nghiệm miễn dịch, xác định glucose, amin thơm và các hợp chất phenolic [12, 26] Đặc biệt, laccase cũng được báo cáo là có khả năng ức chế virus HIV-1 [14] và các dòng tế bào Hep G2 là dòng tế bào ung thư gan và MCF-7

là dòng tế bào ung thư vú [13]

Cùng với đó, các chất mang gắn thuốc với kích cỡ nano đang được nghiên cứu ứng dụng mạnh mẽ trong y học để chẩn đoán và điều trị bệnh, đặc biệt là với bệnh ung thư Các hạt nano có kích cỡ rất nhỏ có thể đi qua các hàng rào sinh học của cơ thể, mang thuốc đến đúng tế bào bệnh giúp nâng cao hiệu quả điều trị Hơn nữa, khi enzyme được cố định lên các hệ nano, các hạt nano còn có tác dụng bảo vệ hoạt tính enzyme Vì thế, tiềm năng ứng dụng của enzyme laccase cùng với công nghệ nano trong điều trị bệnh là rất lớn Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay chưa có nghiên cứu nào báo cáo về việc

cố định enzyme laccase lên các hạt nano

Chitosan là sản phẩm deacetyl hoá của chitin, thành phần chính của vỏ tôm cua Chitosan có nhiều đặc tính sinh học của một chất mang gắn thuốc lý tưởng như tính hoà hợp sinh học, tính phân huỷ sinh học, độc tính thấp, giá thành thấp [9, 38] Các tiểu phân nano chitosan cũng thể hiện những tính chất

lý tưởng cho việc cố định enzyme như từ tính, và diện tích bề mặt lớn, bảo vệ

enzyme khỏi sự phân huỷ hoá học, tránh sự xáo trộn các ion kim loại của enzyme Chính vì thế, chúng tôi lựa chọn chitosan để tiến hành nghiên cứu

chất mang gắn enzyme laccase cho đề tài: "Bước đầu chế tạo và đánh giá hoạt tính enzyme laccase trong phức hệ nano chitosan", với mục đích bước

đầu nghiên cứu phát triển một loại thuốc chữa ung thư

Đề tài gồm có ba mục tiêu chính:

− Tinh sạch enzyme laccase để thu được enzyme laccase có độ tinh sạch cao, dùng để cố định lên nano chitosan

− Chế tạo và đánh giá một số tính chất của tiểu phân nano chitosan

− Bước đầu cố định enzyme laccase lên nano chitosan và đánh giá hiệu suất

Phần 1: TỔNG QUAN

1.1 Laccase

1.1.1 Giới thiệu về Laccase

Laccase (p-benzenediol: oxygen oxidoreductase, E.C.1.10.3.2) là một polyphenol enzyme thuộc nhóm enzyme oxidase Trong phân tử có chứa 4 nguyên tử đồng có khả năng oxy hoá cơ chất sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử Laccase có phổ cơ chất khá đa dạng bao gồm: diphenol, polyphenol, các dẫn xuất phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, polychlorinated biphenyl (PBC), dioxin và cả hợp chất vô cơ như iod Các loại laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau thì khác nhau về khối lượng phân tử, tính chất glycosyl hoá và các tính chất động học [21]

Trong những năm gần đây, laccase được đặt biệt quan tâm bởi tiềm năng ứng dụng mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp thực phẩm, xử lý ô nhiễm môi trường [35], công nghiệp hoá dược [32], công nghệ sinh học và nano [8, 12, 26] Trong ngành Dược, laccase được ứng dụng trong tổng hợp các hợp chất hoá dược như thuốc mê, thuốc an thần, kháng sinh [32] Ngoài

ra, laccase cũng được nghiên cứu phát triển như những chất cảm biến sinh học dùng trong chẩn đoán và điều trị bệnh [19]

1.1.2 Nguồn thu laccase

1.1.2.1 Laccase trong tự nhiên

Laccase được phân bố rộng rãi trong tự nhiên trong các loại thực vật,

nấm và vi khuẩn Laccase từ thực vật được phát hiện lần đầu tiên ở Rhus

vernicifera (ở cây sơn mài Nhật Bản) vào năm 1883 [15] Sau đó, laccase

được nghiên cứu ở rất nhiều các loại thực vật khác như ở Ficus racemosa L (cây sung), Weeping willow (cây thuỷ dương), Nicotiani tabacum (cây thuốc lá) và Prunus persica (cây đào) Laccase thực vật đóng vai trò trong sự hình

thành thân gỗ, có vai trò polymer hoá các monolignol hình thành các dimer

và trimer trong quá trình lignin hoá Tuy vậy, laccase có nguồn gốc từ thực vật ít được nghiên cứu vì phần lớn chúng có thế oxy hoá khử thấp

Ngoài các nguồn laccase từ thực vật, sinh tổng hợp laccase trong vi khuẩn cũng được khảo sát trong các nghiên cứu gần đây Các loài vi khuẩn đã

được phát hiện là nguồn sinh tổng hợp laccase như Azospirillum lipoferum,

Bacillus subtilis [5] Tuy nhiên, laccase trong vi khuẩn thường thu được hoạt

tính rất thấp và khó có khả năng ứng dụng trong thực tiễn sản xuất

So với laccase tổng hợp từ thực vật, vi khuẩn hay côn trùng, laccase có nguồn gốc từ nấm biểu hiện nhiều ưu thế hơn cả, do có tính ổn định hơn, tính không đặc hiệu cơ chất và khả năng oxi hoá các hợp chất phenol đa dạng [10] Laccase trong nấm là các enzyme ngoại bào có chứa nhiều nguyên tử đồng xúc tác các phản ứng oxy hoá, tham gia chủ yếu vào quá trình phân giải

lignin Laccase đã được phát hiện trong các loài nấm từ các họ Ascomyces,

Deuteromyces, Basidomyces, và trong các chi Botrytis cinerea, Chaetomium thmophilum, Coptius, cinereus, Neurospora crassa, Phlebia radiatre, Pleurotus otreatus, Pycnoporus cinnabarius, Trametes versicolor [17]

1.1.2.2 Laccase tái tổ hợp

Do khả năng xúc tác oxy hoá được nhiều loại cơ chất mà điển hình là các hợp chất có chứa vòng phenol nên laccase có rất nhiều ứng dụng trong công nghệ sinh học Tuy nhiên, laccase được tổng hợp từ các chủng tự nhiên thường với lượng rất ít và yêu cầu các chất cảm ứng với giá thành cao [19]

Do vậy, rất nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đã nghiên cứu biểu hiện gen

mã hoá laccase nhằm tạo ra một lượng enzyme đủ lớn với giá thành hạ đáp ứng nhu cầu ứng dụng của laccase trong các lĩnh vực công nghiệp

Tuỳ vào hệ thống biểu hiện sử dụng, hoạt tính và các đặc tính của laccase tái tổ hợp không hoàn toàn giống với chủng gốc và không giống nhau

ngay cả khi cùng nguồn gen

Các hệ thống vật chủ đã được sử dụng để biểu hiện thành công laccase

từ nấm cho đến thời điểm này chủ yếu là nấm men: S cerevisiae, P pastoris,

P methalonica, Yarrowia lipolytica, K lactis và nấm mốc, điển hình như: A oryzae, A niger, A sojae, T reseei, Pycnoporus cinabarinus [19]

1.1.3 Cấu trúc laccase

Laccase được cấu tạo từ các glycoprotein, với phần carbohydrat góp phần tạo nên mức độ ổn định của enzyme [24] Trong nấm thường xảy ra quá

trình glycosyl hoá với mức độ dao động khác nhau, laccase từ Coriolopsis

fulvocinnerea có mức độ glycosyl hoá lên đến 32% [31] và laccase từ Pleurotus pulmonarius có mức độ glycosyl hoá tới 45% [33]

Một loài sinh vật có thể có nhiều dạng isozyme của laccase, các dạng isozyme này khác nhau về trình tự acid amin và một số tính chất về động học xúc tác Tuy vậy, tất cả các laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4 nguyên tử đồng thuộc 3 loại khác nhau nằm ở các vị trí khác nhau của enzyme Bốn nguyên tử đồng này được chia thành 3 nhóm: loại 1 (T1), loại 2 (T2), loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện tử Các nguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp thụ điện tử và tạo thành phổ điện tử mạnh, trong khi cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ điện

tử hấp thụ điện tử và có thể được hoạt hoá khi liên kết với anion mạnh [34] Phân tử laccase thông thường bao gồm 3 tiểu phần (vùng) chính A, B, C

có khối lượng tương đối bằng nhau, cả ba phần đều có vai trò trong quá trình xúc tác của laccase Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và vùng C, trung tâm một nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên

tử đồng nằm ở bề mặt chung của vùng A và vùng C

Hình 1.1: Cấu trúc không gian ba chiều của laccase

Trung tâm đồng một nguyên tử chỉ chứa một nguyên tử đồng T1, liên kết với một đoạn peptid có hai gốc histidin và một gốc cystein Liên kết giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên tử lưu huỳnh của cystein là liên kết đồng hoá trị bền và hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600 nm, tạo cho laccase có màu xanh nước biển đặc trưng Trung tâm đồng ba nguyên tử có nguyên tử đồng T2 và cặp nguyên tử đồng T3 Nguyên tử đồng T2 liên kết với hai gốc histidin bảo thủ trong khi các nguyên tử đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidin bảo thủ

[17]

1.1.4 Cơ chế xúc tác của laccase

Laccase là enzyme oxy hoá khử có khả năng oxy hoá diphenol và các hợp chất có liên quan, sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử Trung tâm nguyên tử đồng một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy hoá cơ chất

Cơ chất chuyển một điện tử cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử đồng T1 (Cu2+) trở thành dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử đồng

đều ở trạng thái khử (Cu+) Một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận chuyển đồng thời bốn điện tử từ nguyên tử đồng T1 sang cụm nguyên tử đồng T2/T3 qua cầu tripeptit bảo thủ His-Cys-His Phân tử oxy sau đó oxy hoá laccase dạng khử, tạo thành hợp chất trung gian peroxy, và cuối cùng bị khử thành nước [20]

Hình 1.2 Trung tâm hoạt động của laccase

Tất cả các ion đồng đều đóng vai trò quan trọng trong cơ chế xúc tác của laccase Trung tâm nguyên tử đồng một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy hoá cơ chất T1 nhận điện tử đầu tiên từ cơ chất, sau đó điện tử này được vận chuyển qua bộ ba acid amin (His-Cys-His) đến vị trí T2/T3 Phân

tử oxy sau đó nhận điện tử và bị khử thành nước [15]

Trong công nghệ tổng hợp các hợp chất hay trong các công nghệ khác, thì cơ chế xúc tác có thể xảy ra theo một trong các cơ chế ở hình 1.3 Cơ chế đơn giản nhất có thể diễn ra khi các cơ chất bị oxy hoá trực tiếp bởi trung tâm hoạt động do bốn nguyên tử đồng đảm nhiệm Tuy nhiên, các phần tử cơ chất

thường có cấu tạo phức tạp hoặc có thế khử quá lớn Vì vậy chúng không thể tiếp cận được trung tâm phản ứng của phân tử laccase Trong trường hợp này cần một hợp chất hoá học trung gian gọi là mediator (hình 1.3b) Hợp chất hoá học này có thể tiếp xúc với trung tâm phản ứng của laccase và bị laccase oxy hoá thành dạng gốc tự do Sau đó chất trung gian ở dạng oxy hoá nhận một điện tử của cơ chất và trở thành chất khử, tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác Ngược lại, laccase sau khi nhận một điện tử từ chất trung gian thì trở thành dạng khử, và sau đó bị oxy hoá thành dạng oxy hoá và tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác tiếp theo Các chất trung gian thường dùng cho laccase là: 3-hydroxyanthranillic acid (HAA), 2,2'-azino-bis(3-ethybenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS), 1-hydroxybenzo-trialzone (HBT), N-

hydroxyphtaimide (HPI), violuric acid (VLA) [22] v.v Sự tham gia của chất

trung gian một lần nữa làm cho laccase có khả năng tham gia xúc tác với nhiều chất hơn, tức là làm tăng tính không đặc hiệu cơ chất [4]

Sự phù hợp giữa cơ chất và laccase phụ thuộc vào hai yếu tố Thứ nhất

là sự tiếp cận giữa cơ chất và nguyên tử đồng T1 Điều này phụ thuộc rất lớn vào tính chất và vị trí của các nhóm chức trên vòng phenol của cơ chất Sự phù hợp này cũng phụ thuộc vào sự khác nhau giữa thế oxy hoá-khử giữa cơ chất và enzyme Đại lượng này lại phụ thuộc vào cấu trúc hoá học và các nhóm thế Thế oxy hoá khử của laccase dao động trong khoảng 0,4 - 0,8 V [2]

Cũng như các enzyme khác, laccase cũng có những chất ức chế Những chất ức chế này liên quan trực tiếp đến liên kết hoá học của các nguyên tử đồng Các chất ức chế của laccase thường là các ion nhỏ như azide, cyanide, flouride Các ion này sẽ gắn vào trung tâm chứa 3 nguyên tử đồng và chặn các dòng điện tử đi đến các nguyên tử này Các hợp chất khác như acid béo, L-cystein v.v cũng được coi là các chất ức chế nhưng với nồng độ cao hơn

các ion kể trên

a

b

Hình 1.3: Cơ chế xúc tác của laccase

a Cơ chế xúc tác khi không có sự tham gia của chất trung gian

b Cơ chế xúc tác khi có sự tham gia của chất trung gian

Độ bền pH của các laccase khác nhau khá nhiều, đa phần các laccase

bền ở pH 6 Độ bền pH của laccase từ T versicolor nằm trong dải pH từ 2.5 -

7 sau một giờ ủ còn trên 50% [1]

Khoảng nhiệt độ hoạt động tối thích của các laccase thường trong khoảng 25 - 300C tuỳ vào từng loại cơ chất xúc tác và các loại laccase khác nhau Với cơ chất là ABTS laccase thường hoạt động trong khoảng 27 - 300C [18], với cơ chất là DMP laccase hoạt động ở 25 - 300C [18]

Nhiệt độ hoạt động tối thích của các laccase thay đổi trong khoảng 25 -

800C, một vài loại enzyme có nhiệt độ hoạt động tối thích dưới 350C Nhiệt

độ hoạt động tối thích của laccase từ P ostreatus nằm trong khoảng 25 -

350C [18]

1.1.6 Ứng dụng của laccase

Phương pháp oxy hoá sinh học nhờ enzyme được xem là phương pháp khả thi có thể thay thế các phương pháp oxy hoá hoá học do chúng rất thân thiện với môi trường, có tính đặc hiệu và hiệu suất cao Laccase là một trong các enzyme oxy hoá được ứng dụng khá phổ biến trong các ngành công nghiệp do chúng có phổ cơ chất rộng và sử dụng chất nhận điện tử cuối cùng

là oxy phân tử chứ không phải cần các chất nhận điện tử khác như NAD(P)+ Laccase được sử dụng trong một số ngành công nghiệp giấy để phân huỷ lignin trong bột gỗ; tẩy trắng trong công nghiệp dệt nhuộm; xử lý các hợp chất polyphenol và loại bỏ oxy không mong muốn trong một số ngành công nghiệp thực phẩm; hoá mỹ phẩm, dược phẩm v.v Một số ứng dụng cụ thể của laccase được trình bày sau đây:

- Ứng dụng trong xử lý sinh học: Laccase rất hữu hiệu trong việc tham gia xúc tác phân huỷ các chất độc thông qua quá trình oxy hoá, đặc biệt là các chất phức tạp, không tan Laccase có thể tham gia phân huỷ các hợp chất phenol là chất thải của quá trình sản xuất như các hợp chất PAH, PCB từ ngành công nghiệp dầu mỏ, thuốc nổ TNT (trinitrotoluen) trong ngành khai

khoáng, quân sự, thuốc trừ sâu DDT (dichlorodephenyltrichloroethane), HCH (hexachlorocyclohexane), thuốc diệt cỏ (2,4-D,2,4,5-T) v.v dùng trong nông nghiệp [35]

- Ứng dụng trong ngành dược: Có nhiều dược phẩm được nghiên cứu tạo ra từ laccase như các chất kháng khuẩn, giải độc Laccase có thể được sử dụng trong tổng hợp các hợp chất hoá dược như thuốc mê, thuốc an thần, thuốc chống viêm, kháng sinh, v.v., bao gồm triazolo(benzo)cycloalkyl thiadiazines, vinblastine, mitomycin, penicillin X dimer, cephalosporins [32] Ngoài ra, laccase cũng được báo cáo là có khả năng ức chế sự sao mã ngược của virus HIV-1 [14], ức chế sự nhân lên của các dòng tế bào Hep G2 và MCF-7 là các dòng tế bào ung thư gan và ung thư vú [13]

- Ứng dụng trong công nghệ nano: Trong y học, vật liệu nano được ứng dụng rộng rãi như một vật liệu mang chất cảm biến sinh học và vật liệu sinh học Enzyme laccase đã được nghiên cứu sử dụng như những chất cảm biến sinh học Một số cảm biến sinh học có chứa laccase đã được phát triển cho kiểm nghiệm miễn dịch, để xác định glucose, amin thơm và các hợp chất phenolic [12,11,26]

1.1.7 Phương pháp xác định hoạt tính laccse

Nguyên tắc: Dựa trên sự oxy hoá ABTS của enzyme laccase tạo thành hợp

chất hấp thụ ở bước sóng 420 nm, ở điều kiện thí nghiệm [13]

Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ laccase là lượng enzyme cần thiết để tạo

thành 1 µM sản phẩm từ ABTS trong thời gian 1 phút, ở điều kiện thí nghiệm

E

f pu

o

V

D V

A A

U

Aτ: Giá trị hấp thụ quang đo được tại thời điểm τ

Ao: Giá trị hấp thụ quang đo được tại thời điểm τ = 0

Df: Độ pha loãng

1.1.8 Các phương pháp tách chiết, tinh sạch enzyme

1.1.8.1 Các phương pháp tách chiết enzyme:

Các phương pháp cơ học được ứng dụng nhiều để tách enzyme khỏi tế bào và các thành phần khác gồm hai phương pháp:

− Phương pháp ly tâm: Ly tâm là quá trình tách vật rắn ra khỏi dung

dịch Phần lớn các enzyme ngoại bào là các enzyme hoà tan, như vậy sau khi tiến hành ly tâm, dung dịch tách ra khỏi phần chất rắn là dịch enzyme thô Enzyme nội bào nằm trong tế bào sinh vật, muốn thu nhân enzyme nội bào, ta phải tiến hành một giai đoạn phá vỡ tế bào

− Phương pháp lọc: Trong công nghệ enzyme, sau khi phá vỡ thành tế

bào sinh vật hay sau khi lên men, người ta thường sử dụng quá trình lọc

để thu nhận dung dịch enzyme nội bào, enzyme ngoài bào hoà tan Dịch chiết enzyme ở bước này thu được thường chứa nhiều protein và các chất không mong muốn Vì thế, chúng ta cần phải tinh sạch enzyme

1.1.8.2 Các phương pháp tinh sạch enzyme:

− Phương pháp diêm tích: Trong nghiên cứu và trong sản xuất, người ta

dùng dung dịch amonium sunfat để kết tinh enzyme, dung dịch

amonium sunfat để kết tinh enzyme đòi hỏi độ tinh sạch phải rất cao là khó, vì vậy phương pháp này ít được phổ biến

− Phương pháp điện di: Phương pháp điện di chỉ được ứng dụng nhiều

trong phòng thí nghiệm Người ta cũng đã tiến hành áp dụng thử phương pháp này theo quy mô công nghiệp nhưng cho đến nay vẫn chưa được phát triển rộng rãi

− Phương pháp sắc ký:

- Sắc ký lọc gel: Theo phương pháp này, các loại gel được

nạp vào trong cột dùng để tách enzyme Các loại gel được sử dụng rộng rãi trong phương pháp sắc ký cột là: polycryamide, ararose, vinyl polymer, dextran Trong lọc gel, các phân tử được tách ra dựa theo kích thước và hình dáng của chúng

- Sắc ký trao đổi ion Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa

trên sự tích điện của phân tử protein Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp Tính chất tích điện của protein chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi giá trị pH Từ đó, người ta chọn chất trao đổi là anion hay cation

- Sắc ký kỵ nước: Phương pháp này dựa trên sự tương tác của

vùng kỵ nước của phân tử protein với nhóm kỵ nước trên chất nền, sự hấp phụ xảy ra ở nồng độ muối cao và quá trình phân đoạn với muối

Phương pháp này đặc biệt thích hợp đối với những enzyme đã được làm cô đặc trước đó bằng phương pháo kết tủa với muối amonium sulfate

- Sắc ký ái lực: Phương pháp này dựa trên khả năng giữ enzyme

bằng những chất nền không hoà tan, được nhồi vào trong cột sắc ký

1.2 Chitosan và nano chitosan

1.2.1 Nguồn gốc và cấu trúc chitosan

Chitosan là dẫn xuất deacetyl hoá của chitin, trong đó nhóm -NH2 thay thế nhóm -NHCOCH3 ở vị trí C2 của chitin Đơn vị cấu tạo phân tử chitosan

là β-D-glucosamin bởi liên kết α-(1-4)-glycoside [3]

Hình 1.4: Phản ứng deacetyl hoá chitin tạo thành chitosan

Chitin là một polysacrit tồn tại trong tự nhiên với sản lượng rất lớn (chỉ đứng thứ hai sau cellulose), nó tập trung nhiều trong vỏ các loài hải sản như tôm, cua, mai mực, tảo biển và các loài bọ cánh cứng, sinh khối nấm mốc

1.2.2 Tính chất lý hoá của chitosan

− Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức: -OH, -NH2, -NHCOCH3

có nghĩa chúng vừa là alcol, vừa là amine, vừa là amide Phản ứng hoá học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế N-

− Chitosan ở thể rắn tồn tại dưới 2 dạng: dạng tinh thể và dạng vô định

hình Chitosan không tan trong nước, kiềm đặc và loãng, không tan trong cồn, aceton và các dung môi hữu cơ khác Chitosan tan trong dung dịch acid loãng tạo dung dịch keo trong suốt Độ nhớt của chitosan trong dung dịch acid loãng liên quan đến kích thước và khối lượng phân tử trung bình của chitosan (đây cũng là tính chất chung của tất cả các dung dịch polyme)

− Do chitosan có nhóm -NH2 linh động nên có khả năng tạo phức với ion kim loại [30], tạo liên kết với các axit hữu cơ, anhydrit hữu cơ [28]

1.2.3 Tính chất sinh học của chitosan

− Chitosan có độc tính thấp, có thể sử dụng an toàn trên người theo đường uống, đường tiêm, bôi ngoài da và ghép mô [9]

− Chitosan là một hợp chất cao phân tử có tính hoà hợp sinh học với cơ thể [38]

− Chitosan có tính phân huỷ sinh học và hoà hợp sinh học không những với động vật mà còn cả đối với mô thực vật [9]

Do có những tính chất sinh học kể trên, chitosan đáp ứng được các tiêu chuẩn của một chất mang polyme Tác giả Zhang Y, Hou C., Chen A (1997) đã nhận xét, chitosan là một chất mang thuốc tuyệt vời

1.2.4 Tiểu phân nano chitosan

Tiểu phân nano (nanoparticle) là các tiểu phân phân tán cấu tạo đa phân

tử có kích thước từ 1nm đến 1.000 nm, với một cấu trúc thiết kế thích hợp, nó

có vai trò như một phương tiện vận chuyển chuyên biệt, đảm bảo chuyển giao hoạt chất đến đích sinh học (biological target), theo một đường dẫn thuốc phù hợp vào cơ thể người Dạng bào chế này thường được gọi là thuốc điều trị tại đích (drug targeting) và các tiểu phân phân tán được gọi là tiểu phân vận chuyển (vector) Nhìn chung, thuốc điều trị tại đích là một giá mang nano (nanocarrier) cấu tạo đặc biệt giúp chuyển giao hoạt chất đến đích sinh học [1]

Tiểu phân nano chitosan là một loại tiểu phân nano polymer, các tiểu phân nano polymer được phát triển như một dạng bào chế cải tiến nhằm thay thế các liposome kém bền trong thử nghiệm in vivo cũng như trong thời gian bảo quản [1]

Nano chitosan có kích thước siêu nhỏ (10-1000nm) nên dễ dàng đi qua màng tế bào, có thể đưa vào cơ thể qua nhiều đường khác nhau như dùng ngoài da, dùng qua đường miệng, qua mũi Nano chitosan có diện tích và điện tích về mặt cực lớn nên được ứng dụng nhiều trong sinh y học như mang thuốc, vaccine, vector chuyển gen, chống khuẩn, thuốc điều trị ung thư Khi

sử dụng nano chitosan làm chất dẫn thuốc, thuốc điều trị được bảo vệ bởi những hạt nano chitosan khỏi sự phân huỷ sinh học Do kích thước rất nhỏ, những hạt này có tác dụng thấm sâu vào cơ thể, đưa thuốc đến đúng mục tiêu, nâng cao hiệu quả điều trị [36]

Hạt chitosan là một hệ thống phân phối thuốc có tiềm năng lớn Trên thế giới, hầu hết những công trình nghiên cứu gần đây đều nhằm mục đích chế tạo ra những chất mang nano để dẫn truyền thuốc, protein, gen và phát triển vector chitosan hướng đích thuốc trên những tế bào ung thư Một số công trình tiêu biểu là điều chế hạt chitosan gắn với acid polyacrylic để điều khiển

và kéo dài thời gian phóng thích thuốc; điều chế nano chitosan với cholesterol để dẫn thuốc đến mắt; biến tính với N-trimethyl mang protein làm

hệ thống dẫn truyền đường mũi; tạo phức với acid deoxycholic để dẫn truyền gen [25]

1.2.5 Các phương pháp chế tạo hạt nano chitosan

Theo S.A Agnihotri (2004), có 5 phương pháp chủ yếu tạo hạt nano chitosan là: Phương pháp trùng hợp nhũ tương (emulsion cross-linking), phương pháp giọt tụ/kết tủa (coacervation/precipitation), phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương (emulsion-droplet coalescence), phương pháp tạo gel ion

(ionic gelation), và phương pháp mixen đảo (reverse-micelle) [29]

Phương pháp được sử dụng nhiều nhất là tạo gel ion, ưu điểm của phương pháp này là quá trình chuẩn bị đơn giản và không cần phải sử dụng dung môi hữu cơ hay sử dụng lực nén lớn, do đó phương pháp này được nghiên cứu rộng rãi trong tổng hợp chất dẫn thuốc và thực phẩm chức năng [36]

1.2.5.1 Phương pháp trùng hợp nhũ tương

Hỗn hợp nhũ tương nước trong dầu (w/o) được tạo ra bằng cách phân tán dung dịch chitosan trong dầu Những giọt lỏng được làm bền bởi chất hoạt động bề mặt Nhũ tương sau đó được liên kết bằng tác nhân tạo liên kết thích hợp như glutaradehyde Hai nhóm -CHO của glutaradehyde sẽ phản ứng với nhóm -NH2 của chitosan để trùng hợp tạo hạt nano chitosan

Hình 1.5 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp trùng hợp nhũ tương 1.2.5.2 Phương pháp giọt tụ/kết tủa

Phương pháp này sử dụng tính chất của chitosan là không tan trong dung dịch kiềm Bởi vậy, chitosan sẽ bị kết tủa, tạo giọt ngay khi dung dịch chitosan

tiếp xúc với dung dịch kiềm Dung dịch kiềm có thể là NaOH, metanol hoặc ethandiamine Dung dịch chitosan sẽ được một thiết bị nén phun vào dung dịch kiềm để tạo hạt nano

NaOH-Hình 1.6 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp giọt tụ

1.2.5.3 Phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương

Phương pháp này sử dụng nguyên tắc của cả hai phương pháp: tạo nối ngang nhũ tương và kết tủa Thay vì sử dụng tác nhân tạo nối ngang, kết tủa tạo ra bằng cách cho các giọt chitosan kết hợp với các giọt NaOH Một hệ nhũ tương bền chứa dung dịch chitosan cùng với thuốc tạo ra trong parafin lỏng Đồng thời, một hệ nhũ tương bền khác chứa dung dịch chitosan và NaOH cũng được tạo ra theo cách như trên Khi cả hai hệ nhũ tương này được trộn lại với tốc độ khuấy cao, các giọt từ mỗi hệ sẽ va chạm một cách ngẫu nhiên, hợp lại và kết tủa thành những hạt nhỏ

Hình 1.7 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương 1.2.5.4 Phương pháp tạo gel ion

Cơ chế của phương pháp này dựa trên tương tác tĩnh điện giữa chitosan tích điện dương và một polyanion như tripolyphosphate Kỹ thuật này có ưu điểm là giai đoạn chuẩn bị đơn giản và thực hiện trong môi trường nước Đầu tiên chitosan được hoà tan vào dung dịch acetic Sau đó chitosan được trộn lẫn với polyanion để tạo hạt nano chitosan dưới điều kiện khuấy từ liên tục tại nhiệt độ phòng Kích thước và điện tích bề mặt có thể kiểm soát bằng cách sử dụng những tỷ lệ chitosan và polyanion khác nhau