Mẫu 1 bổ sung 1ml PBS 1X, pH 7.4 có chứa 10µl enzyme Laccase.
Mẫu 2 bổ sung 1ml Natri Acetate 20mM, pH 5.5 có chứa 10µl enzyme
Laccase.
Mix đều các ống, ủ ở nhiệt độ phòng thời gian 1-2h, sau đó tiến hành ly tâm ở
13000v/p trong thời gian 10 phút, 4°C. Tách riêng phần dịch nổi và phần cặn (là phức hệ nano chitosan - laccase). Rửa cặn hai lần với nước và tiến hành kiểm tra hoạt độ enzyme.
2.3.6. Phương pháp phân tích đặc điểm của nano chitosan 2.3.6.1. Chụp ảnh SEM (Scanning Electron Microscope) 2.3.6.1. Chụp ảnh SEM (Scanning Electron Microscope)
Scanning electron microscope (SEM) là một trong các loại kính hiển vi
điện tử sử dụng các chùm tia electron năng lượng cao tương tác với các electron trên bề mặt mẫu vật từđó sản sinh ra các electron thứ cấp, electron tán xạ phản hồi. Các electron phản hồi này được ghi nhận lại cho biết các thông tin về bề mặt và thành phần mẫu.
2.3.6.2. Đo thế zeta và kích cỡ tiểu phân
Nhìn chung, các tiểu phân tích điện ở bề mặt thường đặc trưng bởi thế
năng zeta thể hiện lực đẩy giữa các tiểu phân. Thế zeta được đo bởi tốc độ di chuyển của các tiểu phân trong vùng điện trường. Trong thực nghiệm, hệ tiểu phân phân tán có giá trị tuyệt đối của thế zeta giữa 20 và 30 mV sẽ tạo sự ổn
định tĩnh điện học nhờ lực đẩy giữa các tiểu phân tích điện cùng dấu.
2.3.7. Phương pháp kiểm tra hiệu quả cố định enzyme laccase lên nano chitosan chitosan
Hiệu suất cố định enzyme lên nano chitosan được tính toán thông qua hoạt độ enzyme Laccase còn lại trong sản phẩm Nano chitosan Laccase so
với hoạt độ enzyme Laccase ban đầu trước khi cố định. Phương pháp xác
định hoạt độ enzyme đã trình bày trong phần 2.3.5.
Công thức tính hiệu suất: H = 𝐔 !!!"#$%& !"##"$% 𝐔 !"##"$% x 100%
Phần 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết, tinh sạch enzyme laccase
Bảng 3.1: Tóm tắt quá trình tinh sạch laccase từ chủng Cerrena sp
FBV25 Bước tinh sạch Tổng hoạt tính (U) Tổng hàm lượng protein (mg) Hoạt độ riêng (U/mg) Hiệu suất thu hồi (%) Độ tinh sạch (lần) Dịch enzyme thô 7434 1619 4,5 100 1 Màng lọc tiếp tuyến 10 kDa 7347 345 21,3 98,8 4,7 Sắc ký lọc gel Sepadex G-75 3039 37,4 81,2 40,8 18 Sắc ký trao đổi ion 2398 4,1 584,9 32,3 130
3.1.1. Nuôi cấy thu dịch enzyme
Chủng Cerrena sp. FBV 25 được nuôi cấy trong môi trường PDA ở
30ºC, lắc 150 vòng/phút. Sau 4 ngày nuôi cấy, dịch canh trường được ly tâm 5000xg ở 4°C để loại sinh khối tế bào thu dịch enzyme thô. Dịch enzyme sau 4 ngày đạt hoạt tính 11437 U/l.
Dịch enzyme sau khi được cô qua màng lọc tiếp tuyến 10kDa có hoạt tính riêng 31,3 U/mg và hiệu suất 98,8%. Dịch enzyme sau khi cô được đưa lên cột sắc kí lọc gel Sephadex G-75 với thế tích 2ml/lần. Thu 40 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 1ml. Kết quả kiểm tra hoạt tính laccase của các phân
đoạn cho thấy, laccase tập trung ở các phân đoạn từ 15 đến 22. Điện di đồ cho thấy ở các phân đoạn còn khá nhiều băng protein tuy nhiên xuất hiện một băng protein đậm có khối lượng phân tử xấp xỉ 60kDa. Sau khi qua côt sắc kí lọc gel G-75, laccase được tinh sạch 18 lần, có hoạt tính riêng 81,2 U/mg và
đạt hiệu suất 40,8%.
Hình 3.1: Hàm lượng protein và hoạt tính các phân đoạn sau khi qua cột sắc ký lọc gel 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 0 10 20 30 40 50 Số phân đoạn Hoạt 0nh laccase
Nồng độ protein Nồng độ protein Protein content (µg/mL)
(µg/mL) Hoạt tính
Hình 3.2: Điện di đồ sản phẩm tinh sạch laccase từ chủng Cerrena
sp.FBV25 qua cột sắc ký lọc gel G-75 trên gel polyacrymide
1: dịch enzyme thô;
2: enzyme cô qua màng lọc tiếp tuyến 10kDa;
3-7 các phân đoạn enzyme tinh sạch qua sắc ký lọc gel G-75; 8: marker protein chuẩn
3.1.3. Tinh sạch protein qua cột sắc ký trao đổi ion
Những phân đoạn qua cột Sephadex G-75 có hoạt tính laccase cao
được đưa tiếp lên cột sắc kí trao đổi ion. Thu 70 phân đoạn, thể tích mỗi phân
đoạn 1ml. Kết quả kiểm tra hoạt tính laccase của các phân đoạn cho thấy, các phân đoạn từ 27-30 có hoạt tính cao hơn hản so với các phân đoạn khác. Các phân đoạn có hoạt tính cao được điện di kiểm tra trên gel 12,5% polyacrylamide. Điện di đồ cho thấy enzyme thu được ở các phân đoạn trên là khá sạch. Các phân đoạn này có duy nhất một loại protein có khối lượng phân tử khoảng 60kDa.
Hình 3.3: Hàm lượng protein và hoạt tính các phân đoạn sau khi qua cột trao đổi ion
Hình 3.4: Điện di đồ sản phẩm tinh sạch laccase từ chủng Cerrena
sp.FBV25 trên gel polyacrymide
L1: dịch enzyme thô;
L2: enzyme cô qua màng lọc tuyến tính 10kDa;
0 10 20 30 40 50 60 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000 0 10 20 30 40 50 60 70 Số phân đoạn
Hoạt tính laccase(U/L) Hoạt 0nh laccase
Nồng độ protein
L3: enzyme tinh sạch qua sắc ký lọc gel G-75; L4: enzyme tinh sạch sau sắc ký trao đổi ion; M: marker protein chuẩn
Enzyme đã tinh sạch có hàm lượng protein 0,05mg/ml, hoạt độ riêng 583U/mg và có độ sạch 130 lần so với dịch enzyme thô ban đầu. Theo các nghiên cứu đã công bố, laccase của nấm thường có trọng lượng phân tử trong khoảng từ 40-60kDa [37] và sự biến động này cũng phụ thuộc vào các hệ sinh thái và môi trường nuôi cấy khác nhau. Kim và cộng sự (2002) đã nghiên cứu laccase tinh sạch từ chủng Cerrena unicolor CFC-120 có kích thước 58kDa [18].
3.2. Kết quả tạo phức hệ nano chitosan - enzyme laccase 3.2.1. Kết quả tạo tiểu phân nano chitosan 3.2.1. Kết quả tạo tiểu phân nano chitosan
Kết quả đo kích cỡ mẫu Nano chitosan
Hình 3.6. Kết quả đo phân bố kích cỡ nano chitosan
Các hạt nano chitosan tạo được có hình cầu và có đường kính trung bình là 39.21nm
Kết quả thế Zeta mẫu Nano chitosan:
Thế zeta trung bình của các hạt nano chitosan là 17.3 mV, giá trị này là tương đối tốt cho thấy hệ nano chitosan tương đối ổn định.
3.2.2. Kết quả cố định enzyme laccase lên tiểu phân nano chitosan
STT OD0 OD1 OD2 U 1 Dịch nổi1 0, 052 0, 172 0, 288 1965, 4 2 Nanochitosan Laccase1 0, 177 0, 219 0, 218 341, 5 3 Dịch nổi2 0, 112 0, 169 0, 171 991 4 Nanochitosan Laccase2 0, 246 1, 098 1, 630 11526 5 FBV-Lac 13 0, 050 0, 240 0, 408 12422, 6
Bảng 3.2: Kết quảđo hoạt độ nano chitosan - laccase và laccase
Mẫu 1: mẫu sử dụng đệm PBS 1X (pH=7, 4)
Mẫu 2: mẫu sử dụng đệm Natri Acetate 20mM (pH=5, 5) Mẫu đối chứng: enzyme Laccase tự do
OD0, OD1, OD2 :Giá trị hấp thụ quang đo tại thời điểm t = 0, 1 phút và 2 phút
Hiệu suất cố định enzyme lên nano chitosan:
Với mẫu nano chitosan - laccase sử dụng đệm natri acetate: H = 𝐔 !!!"#$%&𝐔 !"##"$% !"##"$% x 100%
Với mẫu nano chitosan - laccase sử dụng đệm PBS: H = 𝐔 !!!"#$%&𝐔 !"##"$% !"##"$% x 100%
= !"#"",! !!"#,! ! x 100% = 2,75%
Qua kết quả trên ta thấy hoạt độ enzyme trong quá trình tạo phức hệ
nano chitosan - laccase ở mẫu sử dụng đệm natri acetate được bảo toàn hơn so với mẫu sử dụng đệm PBS. Nguyên nhân có sự khác biệt trên là do ảnh hưởng giá trị pH của dung dịch đệm đến enzyme Laccase, dung dịch đệm PBS 1X có pH= 7.4 làm hoạt tính enzyme giảm đi rất nhiều chỉ còn khoảng 10% vì thế hiệu suất cố định cũng rất thấp, còn dung dịch Natri Acetate 20mM có pH= 5.5 nằm trong khoảng pH tối ưu của enzyme nên không làm
ảnh hưởng đến hoạt tính đồng thời giá trị pH =5.5 cao hơn giá trị pI của enzyme Laccase tại điểm đẳng điện là 4.7-4.9 nên tại pH này enzyme Laccase sẽ mang điện tích âm và tương tác tĩnh điện với nano chitosan mang điện tích dương vì thế khả năng gắn kết được tăng lên rõ rệt.
Hình ảnh phản ứng màu của sản phẩm với ABTS
Hình 3.8. Hình ảnh phản ứng màu của laccace với ABTS
1: Mẫu enzyme Laccase tự do
2: Mẫu phức hệ nano chitosan – Laccase sử dụng đệm Natri acetate 3: Dịch nổi
4: Mẫu nano chitosan
Mẫu enzyme tự do có màu xanh đặc trưng của sản phẩm phản ứng của
enzyme laccase với ABTS. Mẫu phức hệ nano chitosan - laccase cũng có màu xanh đậm thể hiện hiệu suất cốđịnh enzyme laccase lên nano chitosan cao.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Đề tài đã hoàn thành được các mục tiêu đề ra:
−Tinh sạch được enzyme laccase có độ tinh sạch tương đối cao: độ tinh sạch 130 lần. Enzyme laccase tinh sạch được có khối lượng phân tử 60 kDa và có hoạt độ riêng 584.9 U/mg
−Chế tạo được nano chitosan theo phương pháp tạo gel ion. Hệ nano chitosan tương đối ổn định và các hạt nano chitosan có kích thước trung bình khoảng 40 nm.
−Bước đầu cố định thành công enzyme laccase lên nano chitosan, hiệu suất cố định đạt 92,78%.
KIẾN NGHỊ
Do thời gian và điều kiện tiến hành còn hạn chế, chúng tôi mới chỉ dừng lại ở
việc tinh sạch enzyme laccase và cố định lên hạt nano chitosan, bước đầu
đánh giá các tính chất của hạt nano chitosan và xác định hiệu suất của quá trình cố định enzyme. Chúng tôi kiến nghị trong thời gian tới cần:
−Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình cố định enzyme laccase lên phức hệ nano chitosan và đánh giá tính chất của hạt nano chitosan - laccase.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT:
1. Nguyễn Minh Đức, Trương Công Trị (2010), Tiểu phân nano - Kỹ thuật bào chế, phân tích tính chất ứng dụng trong ngành Dược, NXB Y học.
2. Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzyme, NXB Đại học quốc gia TP HCM.
3. Đặng Văn Luyến (1995), "Chitin/Chitosan các bài giảng và báo cáo chuyên đề", 2, 27-35.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH:
4. Adinarayana Kunamneni Susana Camarero, Carlos García-Burgos, Francisco J. Plou, Antonio Ballesteros, Miguel Alcalde (2008), "Engineering and Applications of fungal laccases for organic synthesis", Microbial Cell Factories, 20, 7-32.
5. Alain Givaudan Aline Effosse, Denis Faure, Patrick Potier, Marie- Louise Bouillant, René Bally (1993), "Polyphenol oxidase in Azospirillum lipoferum isolated from rice rhizosphere: Evidence for laccase activity in non- motile strains of Azospirillum lipoferum", FEMS Microbiology Letters, 108(2), 205-210.
6. Bourbonnais R. Paice M.G. (1990), "Oxidation of non-phenolic substrates. An expanded role for laccase in lignin biodegradation", FEBS Letters, 267(1), 99-102.
7. Calvo P Remuñán López C, Vila Jato J, Alonso M. (1997), "Novel hydrophilic chitosan polyethylene oxide nanoparticles as protein carriers",
Journal Applied Polymer Science, 63(1), 125-132.
8. Christian G. Bauer Andrea Kühn, Nenad Gajovic, Olga Skorobogatko, Peter-John Holt, Neil C. Bruce, Alexander Makower, Christopher R. Lowe,
Frieder W. Scheller (1999), "New enzyme sensors for morphine and codeine based on morphine dehydrogenase and laccase", Fresenius' Journal of Analytical Chemistry, 364(1-2), 179-183.
9. Curotto E. Aros F. (1993), "Quantitative determination of chitosan and the percentage of free amino groups", Analytical Biochemistry, 211(2), 240- 241.
10. Daphne Vivienne Gnanasalomi V and J. Joel Gnanadoss (2013), "Laccases from Fungi and Their Applications: Recent Developments", Asian J. Exp. Biol. Sci., 4(4), 581-590.
11. Freire RS Duran N, Wang J, Kubota LT. (2002), "Laccase-based screen printed electrode for amperometric detection of phenolic coumpounds",
Analytical Letters, 35, 29-38.
12. Gomes S.A. Nogueira J.M., Rebelo M.J. (2004), "An amperometic biosensor for polyphenolic coumpounds in red wine", Biosens Bioelectron, (20), 1211-1216.
13. Guo-Qing Zhang et al. (2011), "A laccase with anti-proliferative activity against tumor cells from a white root fungus Abortiporus biennis", Process Biochemistry, 46, 2336-2340.
14. Guo-Qing Zhang et al. (2011), "A Laccase with Antiproliferative and HIV-I Reverse Transcriptase Inhibitory Activities from the Mycorrhizal Fungus Agaricus placomyces", Process Biochemistry, 46, 2336-2340.
15. H. Yoshida (1883), "Chemistry of lacquer (urushi)", Journal Chemical Science, 43, 472-486.
16. Han M.J. Choi H.T., Song H.G. (2005), "Purification and Characterization of Laccase from the White rot fungus Trametes versicolor",
The Journal of Microbiology, 43(6), 555-560.
production of novel laccase from Melanocarpus albomyces", Doctor Thesis, Helneski University of Technology.
18. Kim Y. Cho N.S., Eom T.J., Shin W. (2002), "Purification and characterization of a laccase from Cerrena unicolor and its reactivity in lignin degradation", Bulletin of Korean Chemical Society, 23(7), 985-989.
19. Kunamneni A. Plou F.J., Ballesteros A., Alcalde M. (2008), "Laccases and their applications: a patent review.", Recent Patents on Biotechnology, 2, 10-24.
20. Liliana Gianfredaa Feng Xub, Jean-Marc Bollag (1999), "Laccases: A Useful Group of Oxidoreductive Enzymes", Bioremediation Journal, 3(1), 1- 26.
21. Michniewicz A. Ullrich R., Ledakowicz S., Hofrichter M. (2005), "The white-rot fungus Cerrena unicolor strain 137 produces two laccase isoforms with different physico-chemical and catalytic properties", Applied Microbiologe and Biotechnology, 69(6), 1-7.
22. Moghaddam FA Atyabi F, Dinarvand R. (2009), "Preparation and in vitro evaluation of mucoadhesion and permeation enhancement of thiolated chitosan-pHEMA core-shell nanoparticles", Nanomedicine, 5(2), 208-215. 23. Palmieri G. Giardina P., Bianco C., Scaloni A., Capasso A., Sannia G. (1997), "A novel white laccase from Pleurotus ostreatus", Journal Biology Chemistry, 272(50), 31301-31307.
24. Perry C.R. Matcham S.E., Wood D.A., Thurston C.F. (1993), "The structure of laccase protein and its synthesis by the commercial mushroom
Agaricus bisporus", Journal of General Microbiology, 139, 171-178.
25. Q.Gan T.Wang (2007), "Chitosan nanoparticle as protein delivery carrier- Systematic examineation of fabrication conditions for efficient loading and release", Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 59, 24-34
26. R. A. Simkus V. Laurinavicius, L. Boguslavsky, T. Skotheim, S. W. Tanenbaum, J. P. Nakas, D. J. Slomczynski (1996), "Laccase Containing Sol- Gel Based Optical Biosensors", Analytical Letters, 29(11), 1907-1919.
27. Riva Sergio (2006), "Laccases: Blue enzymes for green chemistry",
Trends in Biotechnology, 24(5), 219-226.
28. Rogovina S.Z. Vikhoreva G.A, Akopova T.A., Gorbacheva I.N. (2000), "Investigation of Interaction of Chitosan with Solid Organic Acids and Anhydrides under Coditions of Shear Deformation", Journal Applied Polymeric Science, 70, 927-933.
29. S.A Agnihotri N. Mallikarjuna, T.M. Amineabhavi (2004), "Recent advances on chitosan-based micro - and nanoparticles in drug delivery",
Journal of Controlled Released, 100, 5-28
30. Shahua Qian Ganquan Huang, Jianshen Jiang, Fei He, Yuting Wang (2000), "Studies of adsorption Behavior of Crosslinked chitosan for Cr(VI), Se(VI)", Journal of Applied Polymer Science, 77, 3216-3219.
31. Shleev S.V. Morozova O.V., Nikitina O.V., Gorshina E.S., Rusinova T.V., Serezhenkov V.A., Burbaev D.S., Gazaryan I.G., Yaropolov A.I. (2004), "Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes", Biochimie, 86, 693-703.
32. Stahl P. Kissau L., Mazitschek R., Giannis A., Waldmann H. (2002), "Natural product derived receptor tyrosin kinase inhibitors: Identification of IGF1R-, Tie-2 and VEGFR3 inhibitors", Angewandte Chemie - International Edition, 41, 1174-1178.
33. T M D'Souza K Boominathan and C A Reddy (1996), "Isolation of laccase gene-specific sequences from white rot and brown rot fungi by PCR",
Applied Environmental of Microbiology, 63, 3739-3744.
Microbiology, 140, 19-26.
35. Timothy P.Ruggaber Jeffrey W. Talley (2006), "Enhancing Bioremediation with enzymatic Processes", Practice periodical of hazadous, toxic, and radioactive waste management.
36. W. Tiyaboonchai (2003), "Chitosan Nanoparticles: A promising System for Drug Delivery", Narasuan University Journal, 11(3), 51-66.
37. Zhang G.Q. Wang Y.F., Zhang X.Q., Ng T.B., Wang H.X. (2010), "Purification and characterization of a novel laccase from the edible mushroom Clitocybe maxima", Processes Biochemistry, 45(5), 627-633. 38. Zhang Y. Hou C., Chen A. (1997), "In vitro experimental study of adriamycin-loaded chitosan drug delivery system", Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, 11(5), 309-311.
39. Zhen-Xing Tang Jun-Qing Qian, Lu-E Shi (2007), "Characterizations of