Những phân đoạn qua cột Sephadex G-75 có hoạt tính laccase cao
được đưa tiếp lên cột sắc kí trao đổi ion. Thu 70 phân đoạn, thể tích mỗi phân
đoạn 1ml. Kết quả kiểm tra hoạt tính laccase của các phân đoạn cho thấy, các phân đoạn từ 27-30 có hoạt tính cao hơn hản so với các phân đoạn khác. Các phân đoạn có hoạt tính cao được điện di kiểm tra trên gel 12,5% polyacrylamide. Điện di đồ cho thấy enzyme thu được ở các phân đoạn trên là khá sạch. Các phân đoạn này có duy nhất một loại protein có khối lượng phân tử khoảng 60kDa.
Hình 3.3: Hàm lượng protein và hoạt tính các phân đoạn sau khi qua cột trao đổi ion
Hình 3.4: Điện di đồ sản phẩm tinh sạch laccase từ chủng Cerrena
sp.FBV25 trên gel polyacrymide
L1: dịch enzyme thô;
L2: enzyme cô qua màng lọc tuyến tính 10kDa;
0 10 20 30 40 50 60 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000 0 10 20 30 40 50 60 70 Số phân đoạn
Hoạt tính laccase(U/L) Hoạt 0nh laccase
Nồng độ protein
L3: enzyme tinh sạch qua sắc ký lọc gel G-75; L4: enzyme tinh sạch sau sắc ký trao đổi ion; M: marker protein chuẩn
Enzyme đã tinh sạch có hàm lượng protein 0,05mg/ml, hoạt độ riêng 583U/mg và có độ sạch 130 lần so với dịch enzyme thô ban đầu. Theo các nghiên cứu đã công bố, laccase của nấm thường có trọng lượng phân tử trong khoảng từ 40-60kDa [37] và sự biến động này cũng phụ thuộc vào các hệ sinh thái và môi trường nuôi cấy khác nhau. Kim và cộng sự (2002) đã nghiên cứu laccase tinh sạch từ chủng Cerrena unicolor CFC-120 có kích thước 58kDa [18].