Nguyên tắc:
Trong dịch chiết thô thu được ngoài protein enzyme còn có các protein tạp, các chất cao phân tử khác như polysaccharid, acid nucleic và các chất phân tử nhỏ như đường monose, các chất lipid, muối khoáng. Mục đích của việc tinh chế enzyme là thu được enzyme dạng tinh sạch không chứa tạp chất và có hoạt độ cao.
− Khi cho protein qua cột sắc kí lọc gel Sephadex, các chất có kích thước phân tử nhỏ sẽ bị giữ lại bởi các hạt gel Sephadex, các chất có kích thước phân tử lớn trong cột sẽ chảy nhanh hơn và ra ngoài trước.
− Cơ sở của phương pháp sắc kí trao đổi ion là dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của các enzyme, hay phản ứng trao đổi ion giữa các enzyme với chất trao đổi ion. Enzyme khi đưa lên cột sắc ký trao đổi ion sẽ bị các tác nhân trao đổi ion giữ lại do điện tích trái dấu. Khi thôi mẫu, các phân tử protein enzyme nào có tổng số điện tích nhỏ hơn sẽ bị đẩy ra trước do lực liên kết với chất trao đổi ion yếu.
Tiến hành:
Dịch enzyme thô thu từ chủng Cerrena sp. FBV25 được ly tâm 4,000xg trong 15 phút ở 4ºC được cô đặc bằng màng lọc tiếp tuyến 10kDa. Dịch enzyme sau khi cô được đưa lên cột sắc kí lọc gel Sephadex G-75 với thế tích 2ml/lần. Cột có kích thước 1.2x50cm được cân bằng với đệm 20mM sodium acetate, pH 5.5, tốc độ dòng chảy là 20ml/giờ. Thu 40 phân đoạn, thể
tích mỗi phân đoạn 1ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme được xác
định trong mỗi phân đoạn.
Dịch enzyme sau khi qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G-75, chọn những phân
đoạn có hoạt tính laccase cao được đưa tiếp lên cột sắc ký trao đổi ion Q – anion với tổng thể tích là 10 ml. Cột có kích thước 2,5x7cm được cân bằng với đệm 20mM natri acetate pH 5.5. Thôi mẫu bằng nồng độ muối NaCl từ
0,05-0,35M, bước nhảy giữa các nồng độ là 0.05; mỗi nồng độ thu 10 phân
đoạn với thể tích 1ml/phân đoạn. Tốc độ dòng chảy là 1ml/phút khi cân bằng cột và nạp mẫu, 1.5ml/ phút khi thôi mẫu. Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme được xác định ở mỗi phân đoạn.