ĐẶT VẤN ĐỀHiện nay, liposome là lĩnh vực nghiên cứu được đẩy mạnh ứng dụng trong nhiều ngành nghề khoa học khác nhau như sinh học, hóa sinh, dược phẩm, mỹ phẩm, hóa trị liệu ung thư, enzym trị liệu đặc biệt trong lĩnh vực đưa thuốc tới đích. Trong bào chế hiện đại, liposome thu hút được rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới với những ưu điểm nổi bật như: khả năng hướng đích thụ động đối với các tếbào ung thư, tăng hiệu quả điều trị và khoảng điều trị, tăng khả năng ổn định của dược chất được bao gói, tránh tác dụng trên các tế bào lành, cải thiện dược động học, giảm chuyển hóa và tăng thời gian tuần hoàn, bắt cặp linh động với các vị trí phối tử đặc biệt để đạt tác dụng hướng đích…Trên thế giới liposome được bào chế bằng nhiều phương pháp khác nhau, được đưa vào sản xuất với nhiều chế phẩm sử dụng rộng rãi trên thị trường dưới dạng thuốc tiêm liposome doxorubicin. Trong nước các nghiên cứu về liposome hiện nay còn nhiều hạn chế, chưa có chế phẩm nào được đưa vào sản xuất. Các nghiên cứu vềliposome ở Việt Nam hiện nay chủ yếu sử dụng phương pháp hydrat hóa film, tuy nhiên phương pháp này hiện có nhiều nhược điểm như: liposome thu được không đồng nhất, kích thước lớn và đa lớp, sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại với môi trường, thời gian quy trình bào chế kéo dài (12 – 14h), khó áp dụng được trên quy mô công nghiệp…Yêu cầu đặt ra cần có một phương pháp bào chế mới thay thế và hạn chế các nhược điểm của phương pháp nói trên. Do vậy đề tài “Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin 2mgml bằng phương pháp pha loãng ethanol” được tiến hành nhằm mục đích:1. Bào chế liposome doxorubicin 2mgml bằng phương pháp pha loãng ethanol.2. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của liposome tạo ra.
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU TRANG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME DOXORUBICIN 2MG/ML BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG ETHANOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU TRANG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME DOXORUBICIN 2MG/ML BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG ETHANOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn Ths. Nguyễn Văn Lâm Nơi thực hiện Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể Ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội và bộ môn Bào chế đã tạo điều kiện cho em được làm khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong trường đã dìu dắt giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập trong suốt 5 năm qua. Với tình cảm chân thành, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến ThS. Nguyễn Văn Lâm Là người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế, trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu. Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè những người đã quan tâm động viên, khích lệ giúp em hoàn thành khóa luận. Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thu Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 6 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU 7 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ 8 ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Doxorubicin 2 1.1.1. Đại cương về doxorubicin 2 1.1.2. Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường 3 1.2. Đại cương về liposome 4 1.2.1. Khái niệm 4 1.2.2.1. Ưu điểm 4 1.2.2.2. Nhược điểm 5 1.2.3. Phân loại 6 1.2.3.1. Theo kích thước và số lớp 6 1.2.3.2. Theo cấu trúc lớp vỏ 6 1.2.4. Phương pháp bào chế 7 1.2.4.1. Phương pháp Batzri và Korn 7 1.2.4.2. Phương pháp Bangham 8 1.2.4.3. Phương pháp Deamer và Bangham 8 1.3. Bào chế liposome bằng phương pháp pha loãng ethanol 9 1.4. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin 11 1.4.1. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin trên thế giới 11 1.4.2. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin tại Việt Nam 12 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu 14 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 14 2.1.2. Nguyên vật liệu 14 2.1.3. Phương tiện nghiên cứu 14 2.2. Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1. Phương pháp bào chế liposome doxorubicin 15 2.2.2. Phương pháp đánh giá liposome doxorubicin 15 2.2.2.1. Phương pháp đánh giá hình thức, kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân 15 2.2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng doxorubicin toàn phần và hiệu suất liposome hóa 16 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu 17 2.2.4. Điều kiện thí nghiệm 17 Chương 3. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 18 3.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn 18 3.2. Xây dựng quy trình bào chế liposome doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol 19 3.2.1. Quy trình bào chế chung 19 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật trong quy trình bào chế đến kích thước tiểu phân và hiệu suất liposome hóa 20 3.2.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi 20 3.2.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ 24 3.2.3. Đánh giá vai trò của giai đoạn làm giảm kích thước tiểu phân trong quy trình bào chế 27 3.2.3. Đề xuất quy trình bào chế và đánh giá một số chỉ tiêu của liposome doxỏubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol 29 3.2.3.1. Quy trình bào chế 29 3.2.3.2. Đánh giá một số chỉ tiêu của liposome tạo ra 30 3.3. Bàn luận 32 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Viết tắt Từ/cụm từ đầy đủ 1 CHL Cholesterol 2 HSPC Phosphatidyl dầu đậu nành đã hydrogen hóa 3 SPC Phosphatidylcholin dầu đậu nành 4 HEPES Dung dịch đệm N-2-hydroxy ethyl piperazin – N – 2 – ethan sulfonic acid 5 PDI Chỉ số đa phân tán 6 DOX Doxorubicin 7 DOX.HCl Doxorubicin hydroclorid 8 KTTP Kích thước tiểu phân 9 TCCS Tiêu chuẩn cơ sở 10 TKKH Tinh khiết hóa học 11 USP Dược điển Mỹ 12 DĐVN Dược điển Việt Nam 13 TMT-LS Liposome tác động vào khối u di căn 14 EE Hiệu suất liposome hóa 15 PEG Polyethylen glycol DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Số hiệu Tên bảng biểu Trang Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu được sử dụng. 14 Bảng 3.1 Kết quả đo mật độ quang các mẫu dung dịch doxorubicin ở bước sóng 233 và 481 nm (pH 4). 18 Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi đến KTTP và hiệu suất liposome hóa. 20 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến KTTP, phân bố KTTP liposome. 21 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến KTTP và hiệu suất liposome hóa. 23 Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến KTTP và hiệu suất liposome hóa. 25 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến KTTP và hiệu suất liposome hóa 25 Bảng 3.7 So sánh các giai đoạn trong quy trình bào chế liposome doxorubicin bằng các phương pháp khác nhau 27 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của quá trình làm giảm KTTP đến KTTP và hiệu suất liposome hóa 28 Bảng 3.9 Kết quả KTTP và hiệu suất liposome hóa 31 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ Số hiệu Tên các hình vẽ, đồ thị Trang Hình 1.1 Công thức hóa học của doxorubicin hydroclorid. 2 Hình 1.2 Cấu trúc liposome. 4 Hình 1.3 Kích thước một số loại liposome. 6 Hình 1.4 Sơ đồ hệ thống kim phun tạo dòng. 9 Hình 3.1 Mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ doxorubicin. 18 Hình 3.2 Liposome doxorubicin bào chế theo các tỷ lệ dung môi khác nhau. 21 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi PDI (A) và KTTP (B) theo tỷ lệ dung môi. 21 Hình 3.4 Đồ thị phân bố KTTP theo thể tích các mẫu trước (A) và sau (B) lọc tiếp tuyến. 24 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP, PDI (A) và hiệu suất liposome hóa (B) theo tỷ lệ dung môi. 23 Hình 3.6 Đồ thị biểu diến sự thay đổi KTTP, PDI (A) và hiệu suất liposome hóa (B) theo nhiệt độ. 26 Hình 3.7 Sơ đồ quy trình bào chế. 30 Hình 3.8 Ảnh chụp TEM liposome. 31 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, liposome là lĩnh vực nghiên cứu được đẩy mạnh ứng dụng trong nhiều ngành nghề khoa học khác nhau như sinh học, hóa sinh, dược phẩm, mỹ phẩm, hóa trị liệu ung thư, enzym trị liệu đặc biệt trong lĩnh vực đưa thuốc tới đích. Trong bào chế hiện đại, liposome thu hút được rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới với những ưu điểm nổi bật như: khả năng hướng đích thụ động đối với các tế bào ung thư, tăng hiệu quả điều trị và khoảng điều trị, tăng khả năng ổn định của dược chất được bao gói, tránh tác dụng trên các tế bào lành, cải thiện dược động học, giảm chuyển hóa và tăng thời gian tuần hoàn, bắt cặp linh động với các vị trí phối tử đặc biệt để đạt tác dụng hướng đích… Trên thế giới liposome được bào chế bằng nhiều phương pháp khác nhau, được đưa vào sản xuất với nhiều chế phẩm sử dụng rộng rãi trên thị trường dưới dạng thuốc tiêm liposome doxorubicin. Trong nước các nghiên cứu về liposome hiện nay còn nhiều hạn chế, chưa có chế phẩm nào được đưa vào sản xuất. Các nghiên cứu về liposome ở Việt Nam hiện nay chủ yếu sử dụng phương pháp hydrat hóa film, tuy nhiên phương pháp này hiện có nhiều nhược điểm như: liposome thu được không đồng nhất, kích thước lớn và đa lớp, sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại với môi trường, thời gian quy trình bào chế kéo dài (12 – 14h), khó áp dụng được trên quy mô công nghiệp… Yêu cầu đặt ra cần có một phương pháp bào chế mới thay thế và hạn chế các nhược điểm của phương pháp nói trên. Do vậy đề tài “Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol” được tiến hành nhằm mục đích: 1. Bào chế liposome doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol. 2. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của liposome tạo ra. 2 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Doxorubicin 1.1.1. Đại cương về doxorubicin Hình 1.1. Công thức hóa học của doxorubicin hydroclorid - Tên khoa học: (8S, 10S)-10-((3-amino-2, 3, 6-trideoxy-α-L-lyxo-hexopyranosyl) oxy) -7, 8, 9, 10-tetrahydro-6, 8, 11- tri hydroxyl-8-(2-hydroxy acetyl)-1-methoxy-5, 12-napthacenedion [22]. - Tính chất: điều kiện thường tồn tại ở dạng tinh thể hay bột vô định hình màu vàng cam không mùi, tan trong nước, methanol, acetonotril, tetrahydrofuran. Không tan trong chloroform, aceton, ethyl ether, benzen [22]. - Doxorubicin bền trong dung dịch có pH gần 4 [10]. - Doxorubicin là chất nhạy cảm với ảnh sáng ở nồng độ thấp, tuy nhiên ở nồng độ điều trị doxorubicin được cho là không bị phân hủy đáng kể bởi ánh sáng, không nhất thiết phải có biện pháp riêng để bảo vệ. Thực tế dung dịch doxorubicin trong NaCl 0,9% có thể ổn định trong 24 ngày khi bảo quản trong lọ PVC ở 25 o C, lâu hơn khi bảo quản trong xylanh làm bằng polypropylen ở 4 o C [22]. - Cơ chế tác dụng: doxorubicin gắn vào DNA làm ức chế các enzym cần thiết để sao chép và phiên mã DNA, đặc biệt gây gián đoạn mạnh chu kỳ phát triển tế bào ở giai đoạn phân bào S và giai đoạn gián phân [2]. - Dược động học: sau khi tiêm tĩnh mạch, doxorubicin nhanh chóng phân bố đến các mô phổi, gan, tim, lách, thận, bị chuyển hóa ở gan tạo thành doxorubicinol. - Công thức phân tử: C 27 H 29 NO 11 . HCl. - Khối lượng phân tử: 579,99. [...]... độ khảo sát từ 1µg /ml đến 20µg /ml Như vậy có thể áp dụng phương pháp đo quang ở khoảng nồng độ khảo sát để định lượng và xác định hiệu suất liposome hóa cho liposome DOX 3.2 Xây dựng quy trình bào chế liposome doxorubicin 2mg/ ml bằng phương pháp pha loãng ethanol 3.2.1 Quy trình bào chế chung Quy trình bào chế liposome DOX được tiến hành theo các bước đã nêu trong mục 2.2.1: - Pha ethanol: hòa tan 100mg... của liposome không khác nhau nhiều giữa hai loại dược chất Từ đó cho thấy phương pháp tiêm ethanol phù hợp cao hơn với việc liposome hóa dược chất thân dầu [15] Bên cạnh đó, phương pháp pha loãng ethanol còn tồn tại nhiều hạn chế như: giới hạn về độ tan của phospholipid trong ethanol (40mM đối với phosphatidylcholin) và tỷ lệ thể tích ethanol /pha đệm (≤ 7,5 v/v) do đó liposome thu được thường bị pha. .. loãng; hiệu suất liposome hóa thấp đặc biệt với các dược chất thân nước, dung môi ethanol tồn dư cần được loại bỏ bằng phương pháp thẩm tách…[4], [17], [19] Phương pháp pha loãng ethanol hiện được ứng dụng nhiều trên thế giới, được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu bào chế liposome Năm 2008, Johnston Micheal J W và cộng sự đã nghiên cứu bào chế liposome DOX bằng phương pháp pha loãng ethanol Các lipid... Phương pháp dùng chất diện hoạt - Phương pháp màng tiếp hợp - Phương pháp phun hỗn hợp chất lỏng hòa tan trong khí siêu tới hạn - Phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn 9 1.3 Bào chế liposome bằng phương pháp pha loãng ethanol So với các phương pháp bào chế trước đây, phương pháp pha loãng ethanol có ưu điểm nổi bật với quy trình bào chế đơn giản, dễ thực hiện, tạo ra các liposome có kích thước nhỏ, tương... có thể dùng isopropanol để thay thế cho ethanol trong sản xuất liposome [12] 1.4 Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin 1.4.1 Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin trên thế giới Trong những năm gần đây trên thế giới, liposome DOX vẫn thu hút được nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học Zhaohui Wang và cộng sự (năm 2012) đã nghiên cứu bào chế liposome miễn dịch gắn peptid hướng đích... Siêu lọc để loại ethanol và tinh chế liposome [3], [4], [11], [19] Phương pháp pha loãng ethanol hiện nay được cải tiến bằng cách sử dụng hệ thống kim phun nhằm khắc phục hạn chế, nâng cao quy mô bào chế Pha nước, pha ethanol được làm nóng tới 55oC Pha nước được bơm liên tục nhờ bơm nhu động từ (2) sang (3), quay trở lại (2), trong quá trình bơm khi pha nước đi qua hệ thống kim phun, pha ethanol có hòa... (Hitachi-Nhật Bản) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp bào chế liposome doxorubicin 2.2.1.1 Bào chế liposome trắng chưa mang dược chất Được tiến hành theo các nghiên cứu đã tham khảo trước đó [5]: - Cân phosphatidylcholin và cholesterol (100: 30 kl/kl) hòa tan hoàn toàn trong thể tích ethanol phù hợp - Chuẩn bị dung dịch đệm citrat 300mM pH 4 - Phối hợp pha ethanol vào pha nước bằng loại bơm tiêm... Hàm lượng DOX tự do của mẫu liposome doxorubicin (mg /ml) CC: Nồng độ DOX trong dung dịch chuẩn (mg /ml) K: Hệ số pha loãng - Hiệu suất liposome hóa (hàm lượng DOX được gắn vào liposome) Tính theo công thức: H= CTP.V0 – CN.VN CTP.V0 (%) H: Hiệu suất liposome hóa CN, CTP: Hàm lượng DOX tự do và DOX toàn phần (mg /ml) VN, V0: Thể tích dung dịch DOX tự do và toàn phần (ml) 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu:... 1.2.3 Phân loại 1.2.3.1 Theo kích thước và số lớp [11] Gồm các loại: Liposome đa lớp đồng trục (MLV), liposome kép (liposome trong liposome – MVV), Liposome đơn lớp lớn (LUV), Liposome đơn lớp nhỏ (SUV), Liposome đơn lớp khổng lồ (GUV), Liposome đa lớp nhỏ (OLV)… Hình 1.3 Kích thước một số loại liposome [5] 1.2.3.2 Theo cấu trúc lớp vỏ - Liposome quy ước: cấu tạo gồm có vỏ lipid và nhân nước Nhược điểm:... quy trình bào chế liposome DOX bằng phương pháp pha loãng ethanol, tiến hành bố trí thí nghiệm như sau: + công thức M761 bào chế bằng phương pháp pha loãng ethanol, lọc tiếp tuyến để cô đặc giảm thể tích, không sử dụng các biện pháp làm giảm KTTP, đổi đệm, nạp dược chất, xác định hàm lượng DOX toàn phần và hiệu suất liposome hóa + công thức M762 bào chế bằng phương pháp pha loãng ethanol, lọc tiếp . có một phương pháp bào chế mới thay thế và hạn chế các nhược điểm của phương pháp nói trên. Do vậy đề tài Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin 2mg/ ml bằng phương pháp pha loãng ethanol . hạn. - Phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn. 9 1.3. Bào chế liposome bằng phương pháp pha loãng ethanol So với các phương pháp bào chế trước đây, phương pháp pha loãng ethanol có. loãng ethanol 9 1.4. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin 11 1.4.1. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin trên thế giới 11 1.4.2. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin tại Việt Nam