Nghiên cứu bào chế cao khô và phân lập puerarin từ sắn dây

       2014        TS. Nguyễn Văn Hân DS. Phạm Thị Phương Dung  Bộ môn Công nghiệp Dược  2014 LI C Đề tài “Nghiên cứu điều chế cao khô Sắn dây” đƣợc thực hiện tại bộ môn Công Nghiệp Dƣợc-Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. Sự thành công của đề tài là nhờ có sự hƣớng dẫn tận tình của các thầy cô giáo và sự động viên, giúp đỡ của các bạn. Trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguy  –Bộ môn Công Nghiệp Dƣợc-Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội là ngƣời thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới DS. Phm Th  luôn nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên trong Bộ môn Công Nghiệp Dƣợc cùng các bộ môn, phòng ban trong trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong khoảng thời gian thực hiện khóa luận. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian qua. Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2014 Sinh viên n MC LC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1.  s 2 1.1.1. Tên gọi 2 1.1.2. Đặc điểm thực vật 2 1.1.3. Bộ phận dùng 2 1.1.4. Thành phần hóa học 3 1.1.5. Tác dụng dược lý 4 1.1.6. Tính vị, công năng 7 1.1.7. Công dụng 7 1.2. Isoflavonoid 7 1.2.1. Công thức hóa học 7 1.2.2. Tính chất lý hóa 8 1.2.3. Tác dụng sinh học 9 1.3. Cao thuc 12 1.3.1. Khái niệm 12 1.3.2. Phân loại 12 1.3.3. Kỹ thuật điều chế 12 1.3.4. Các chỉ tiêu chất lượng của cao thuốc 13 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 t liu, thit b 15 2.1.1. Nguyên liệu 15 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 15 2.2. Nu 17 2.2.1. Chiết xuất isoflavonoid từ nguyên liệu tươi 17 2.2.2. Tinh chế dịch chiết 17 2.2.3. Điều chế cao khô 17 2.2.4. Phân lập puerarin 17 u 17 2.3.1. Phương pháp xác định hàm lượng isoflavonoid toàn phần trong sắn dây 17 2.3.2. Phương pháp chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây 19 2.3.3. Phương pháp tinh chế. 19 2.3.4. Phương pháp điều chế cao khô. 20 2.3.5. Phương pháp sắc ký lớp mỏng 20 2.3.6. Phương pháp xác định khối lượng cắn trong dịch chiết 21 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 u 22 3.1.1. Xây dựng đường chuẩn 22 3.1.2. Định lượng isoflavonoid toàn phần trong sắn dây tươi 24 3. 2. Chit xut isoflavonoid t s 25 3. 3. Tinh ch dch chit 27 p puerarin 32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 36 1. Kt lun 36  xut 36  ER : Thụ thể estrogen (Estrogen Receptor). EtOH : Ethanol. GOT : Glutamic Oxaloacetic Transaminase HDL : Lypoprotein tỷ trọng cao (High Density Lypoprotein). HL.60 : Bạch cầu tủy bào cấp tính ở ngƣời (Human promyelocytic leukemia cells) LDL : Lypoprotein tỷ trọng thấp (Low Density Lypoprotein). UV-VIS : Tử ngoại-khả kiến. w/v : Khối lƣợng/thể tích. w/w : Khối lƣợng/khối lƣợng.  Bảng 2. 1: Nguồn gốc, tiêu chuẩn hóa chất sử dụng 15 Bảng 3.1: Mật độ quang của dãy dung dịch chất đối chiếu tại bƣớc sóng 250 nm. 23 Bảng 3.2: Kết quả định lƣợng isoflavonoid toàn phần trong sắn dây tƣơi. 24 Bảng 3.3: Hiệu suất và hàm lƣợng isoflavonoid toàn phần trong dịch chiết 26 Bảng 3. 4: Hiệu suất và hàm lƣợng cao đặc (thu đƣợc từ 500 ml dịch chiết, tƣơng ứng khoảng 150 g dƣợc liệu) 28 Bảng 3.5: Số liệu của quá trình điều chế cao 30 Bảng 3.6: Một số chỉ tiêu chất lƣợng của sản phẩm 31  Hình 1.1: Sắn dây 2 Hình 1.2: Công thức cấu tạo isoflavon 8 Hình 1.3: Sự tƣơng tự về cấu trúc của isoflavon và estrogen. 9 Hình 3. 1: Phổ UV-VIS của chất đối chiếu 22 Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa nồng độ puerarin và mật độ quang 23 Hình 3.3: Sơ đồ phƣơng pháp chiết xuất isoflavonoid trong sắn dây tƣơi 25 Hình 3.4: Hệ thống cô tuần hoàn (bên trái), máy phun sấy (bên phải) 30 Hình 3.5: Bột cao sắn dây phun sấy 31 1  Sắn dây là cây họ đậu, trồng rất phổ biến trên khắp nƣớc ta, chủ yếu đƣợc sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất tinh bột sắn dây và nguyên liệu làm thuốc trong đông y (cát căn). Trong thành phần của sắn dây có chứa nhiều isoflavonoid, phần lớn thuộc nhóm isoflavon. Tuy nhiên, trong quá trình làm tinh bột sắn dây, hầu hết các isoflavon này hòa tan vào nƣớc và bị loại bỏ. Isoflavonoid có nhiều tác dụng sinh học đáng quý. Có thể kể đến nhƣ tác dụng kiểu phytoestrogen do có cấu trúc gần với estrogen, tác dụng chống oxy hóa, chống lão hóa, tác dụng chống ung thƣ, tác dụng trên tim mạch, tuần hoàn não Các sản phẩm từ isoflavonoid sắn dây đã sớm đƣợc đƣa vào sử dụng rộng rãi ở Châu Âu, Mỹ, Trung Quốc và Nhật Bản. Đặc biệt ở Trung Quốc hiện nay phát triển rất mạnh các sản phẩm thuốc và thực phẩm chức năng từ sắn dây. Ở Việt Nam có một số chế phẩm chứa flavonoid sắn dây. Tuy nhiên nguyên liệu cao khô sắn dây sử dụng vẫn phải nhập khẩu từ Trung Quốc với giá cao. Nhằm góp phần tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có để sản xuất cao khô dƣợc liệu phục vụ cho sản xuất dƣợc phẩm trong nƣớc, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “u ch với mục tiêu: 1. Điều chế được cao khô sắn dây có hàm lượng isoflavonoid toàn phần trên 10%. 2. Phân lập được puerarin từ sắn dây. 2  1.1.  s 1.1.1. Tên gọi Tên khoa học: Pueraria thomsonii Benth. Một số tài liệu Trung Quốc thì ghi loài P. lobata (Will) Ohwi hoặc P. pseudohirsuta Tang et Wang [3]. Tên khác: Bạch cát, Khau cáu (Tày), Bẳn mắm kéo (Thái). Tên nước ngoài: Kudzu bean, Kudzu vine (Anh), Koudzou (Pháp). Họ: Đậu (Fabaceae). 1.1.2. Đặc điểm thực vật Sắn dây là loài dây leo, dài có thể đến 10m, lá kép gồm 3 lá chét. Cuống lá chét giữa dài, cuống lá chét 2 bên ngắn. Lá chét có thể phân thành 2-3 thùy. Về mùa hạ trổ hoa màu xanh tím, mọc thành chùm ở kẽ lá. Quả loại đậu có nhiều lông. Củ dài to, nặng có thể tới 20kg, nhiều xơ. Muốn trồng ngƣời ta đào các hố sâu 50 cm, đổ rác và mùn rồi lấp đất xốp lại. Đến tháng 1-2, giâm cành vào các hố đó. Nhiều nơi ở nƣớc ta thƣờng kết hợp làm giàn lấy bóng mát. Cũng có những vùng chuyên trồng để chế tinh bột ví dụ làng Cao Xá thuộc huyện Châu Thành, tỉnh Tây Ninh mỗi năm sản xuất khoảng 20 tấn tinh bột [3]. 1.1.3. Bộ phận dùng Rễ củ thu hoạch từ tháng 10 đến tháng 3 - 4 năm sau. Hình 1.1: Sắn dây [...]... dễ phân hủy ảnh hƣởng đến chất lƣợng cao thuốc Trƣờng hợp điều chế cao đặc, cao khô, nếu hàm lƣợng hoạt chất chƣa đủ quy định cũng có thể cũng có thể tiến hành loại bớt tạp chất  Cô đặc và sấy khô Để điều chế cao thuốc thƣờng phải tiến hành loại dung môi Dịch chiết đƣợc cô đặc đến tỷ lệ dung môi quy định, với cao đặc và cao khô thì sau khi cô đặc, sấy đến độ ẩm không quá 20% đối với cao đặc và không... chia làm 3 loại: Cao lỏng: Là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trƣng của dƣợc liệu sử dụng trong đó cồn và nƣớc đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo quản hay cả hai) Nếu không có chỉ dẫn khác, quy ƣớc 1 ml cao lỏng tƣơng ứng với 1 g dƣợc liệu dùng để điều chế cao thuốc Cao đặc: Là khối đặc quánh Hàm lƣợng dung môi sử dụng còn lại trong cao không quá 20% Cao khô: Là khối hoặc bột khô, đồng nhất... thƣờng đƣợc thực hiện ở cuối giai đoạn cô đặc [1] 1.3.4 Các chỉ tiêu chất lượng của cao thuốc 14 Cảm quan: Cao thuốc phải có thể chất, màu sắc, độ đồng nhất theo quy định Độ tan: Cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã dùng để điều chế cao Mất khối lượng do làm khô: Thông thƣờng cao đặc không quá 20%, cao khô không quá 5% Các chỉ tiêu khác: Độ nhiễm khuẩn, giới hạn thuốc bảo vệ thực vật, kim... pháp phun sấy - Đánh giá một số chỉ tiêu chất lƣợng cao khô 2.2.4 Phân lập puerarin - Phân lập puerarin và chứng minh cấu trúc sản phẩm 2 3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp xác định hàm lượng isoflavonoid toàn phần trong sắn dây - Sử dụng phƣơng pháp đo quang [7], [ 8], [ 14], [ 15], [ 17], [ 18] Tiến hành: - Chuẩn bị mẫu thử: + Mẫu thử là sắn dây tươi: Cân chính xác khoảng 10 g dƣợc liệu, thêm... isoflavonoid Các isoflavonoid chính trong sắn dây là puerarin, daidzin, daidzein, ngoài ra còn có formonetin, pueraria glycoside 1-6 và puerarol [3] Trong sắn dây xác định đƣợc 7 isoflavonid chính là: 3′-hydroxypuerarin, puerarin, 3′-methoxypuerarin, daidzin, genistin, formononetin-7-glucosid và daidzein [11] R3 R2 O R4 R1 O R5 Một số isoflavonoid trong sắn dây R1 Puerarin Daidzin Daidzein Genistein R2 R3... sắn dây là 0,582 ± 0,021% - So với hàm lƣợng isoflavon trong đậu nành (0,1-0,3%) [12] thì hàm lƣợng isoflavonoid trong sắn dây cao hơn Do đó có thể thấy sắn dây là nguồn nguyên liệu isoflavonoid có nhiều tiềm năng 25 3 2 Chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây tƣơi Rễ củ sắn dây tƣơi chứa hàm lƣợng lớn tinh bột (12-15%) [3] nên đƣợc sử dụng chủ yếu làm nguyên liệu chế tinh bột sắn dây Tinh bột sắn dây. .. thể chất cao đặc Xác định khối lƣợng cao, mất khối lƣợng do làm khô và hàm lƣợng isoflavonoid toàn phần có cao thu đƣợc Kết quả thể hiện trong bảng 3.4: Bảng 3 4: Hiệu suất và hàm lƣợng cao đặc (thu đƣợc từ 500 ml dịch chiết, tƣơng ứng khoảng 150 g dƣợc liệu) Phƣơng pháp tinh chế 1 2 3 Khối lƣợng cao đặc (g) 7,97 7,35 6,09 Mất khối lƣợng do làm khô 18,24 14,55 14,1 Hàm lƣợng isoflavonoid trong cao đặc... khô: Là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhƣng rất dễ hút ẩm Cao khô không đƣợc có độ ẩm lớn hơn 5% [2] 1.3.3 Kỹ thuật điều chế Quy trình điều chế cao khô gồm những giai đoạn sau:  Chuẩn bị dung môi, dƣợc liệu Dƣợc liệu thƣờng đƣợc sấy khô, chia nhỏ đến kích thƣớc thích hợp Một số dƣợc liệu đặc biệt cần diệt enzym hoặc loại chất béo Dung môi điều chế cao thƣờng là nƣớc, ethanol, ete ethylic Để làm tăng độ... mạch vành Những kết quả này giống với kết quả thí nghiệm trên chó không dùng reserpin Điều này chứng tỏ hiện tƣợng làm giãn mạch vành của sắn dây không liên quan tới catecholamin mà là do tác dụng giãn cơ trực tiếp [4]  Tác dụng hạ huyết áp của cao sắn dây Tiêm tĩnh mạch với liều 5-30 mg trên chó, mèo có tác dụng hạ huyết áp Cao sắn dây với liều 750 mg/kg tiêm tĩnh mạch có khả năng đối kháng với tác... 1.2.2 Tính chất lý hóa Các chất thuộc nhóm isoflavon vì không có nối đôi liên hiệp giữa vòng B với nhóm carbonyl nên thƣờng không có màu Độ tan các chất không giống nhau, thƣờng thì dạng glycosid là hợp chất phân cực nên không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu cơ, tan đƣợc trong nƣớc, tốt nhất là cồn nƣớc Các aglycon 9 tan đƣợc trong dung môi hữu cơ, không tan trong nƣớc, các dẫn chất isoflavon có nhóm . ml cao lỏng tƣơng ứng với 1 g dƣợc liệu dùng để điều chế cao thuốc. Cao đặc: Là khối đặc quánh. Hàm lƣợng dung môi sử dụng còn lại trong cao không quá 20%. Cao khô: Là khối hoặc bột khô, . flavonoid sắn dây. Tuy nhiên nguyên liệu cao khô sắn dây sử dụng vẫn phải nhập khẩu từ Trung Quốc với giá cao. Nhằm góp phần tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có để sản xuất cao khô dƣợc liệu. với mục tiêu: 1. Điều chế được cao khô sắn dây có hàm lượng isoflavonoid toàn phần trên 10%. 2. Phân lập được puerarin từ sắn dây. 2  1.1. 