Nghiên cứu bào chế cao khô và phân lập puerarin từ sắn dây

ĐẶT VẤN ĐỀ Sắn dây là cây họ đậu, trồng rất phổ biến trên khắp nước ta, chủ yếu được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất tinh bột sắn dây và nguyên liệu làm thuốc trong đông y cát căn..

môn Công Nghiệp Dược-Trường Đại học Dược Hà Nội Sự thành công của đề

tài là nhờ có sự hướng dẫn tận tình của các thầy cô giáo và sự động viên, giúp

đỡ của các bạn

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS

Nguyễn Văn Hân–Bộ môn Công Nghiệp Dược-Trường Đại học Dược Hà

Nội là người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện cho tôi

trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới DS Phạm Thị Phương Dung luôn nhiệt

tình giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên trong Bộ môn

Công Nghiệp Dược cùng các bộ môn, phòng ban trong trường đại học Dược

Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong khoảng thời gian thực hiện khóa

luận

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên,

giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2014

Sinh viên

Vũ Văn Tuấn

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Vài nét về sắn dây 2

1.1.1 Tên gọi 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật 2

1.1.3 Bộ phận dùng 2

1.1.4 Thành phần hóa học 3

1.1.5 Tác dụng dược lý 4

1.1.6 Tính vị, công năng 7

1.1.7 Công dụng 7

1.2 Isoflavonoid 7

1.2.1 Công thức hóa học 7

1.2.2 Tính chất lý hóa 8

1.2.3 Tác dụng sinh học 9

1.3 Cao thuốc 12

1.3.1 Khái niệm 12

1.3.2 Phân loại 12

1.3.3 Kỹ thuật điều chế 12

1.3.4 Các chỉ tiêu chất lượng của cao thuốc 13

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2 1 Nguyên vật liệu, thiết bị 15

2.1.1 Nguyên liệu 15

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2.1 Chiết xuất isoflavonoid từ nguyên liệu tươi 17

2.2.2 Tinh chế dịch chiết 17

2 3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp xác định hàm lượng isoflavonoid toàn phần trong sắn dây 17

2.3.2 Phương pháp chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây 19

2.3.3 Phương pháp tinh chế 19

2.3.4 Phương pháp điều chế cao khô 20

2.3.5 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 20

2.3.6 Phương pháp xác định khối lượng cắn trong dịch chiết 21

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3 1 Xác định hàm lượng isoflavonoid toàn phần trong nguyên liệu 22

3.1.1 Xây dựng đường chuẩn 22

3.1.2 Định lượng isoflavonoid toàn phần trong sắn dây tươi 24

3 2 Chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây tươi 25

3 3 Tinh chế dịch chiết 27

3.5 Phân lập puerarin 32

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 36

1 Kết luận 36

2 Đề xuất 36

ER : Thụ thể estrogen (Estrogen Receptor)

EtOH : Ethanol

GOT : Glutamic Oxaloacetic Transaminase

HDL : Lypoprotein tỷ trọng cao (High Density Lypoprotein)

HL.60 : Bạch cầu tủy bào cấp tính ở người (Human promyelocytic leukemia cells)

LDL : Lypoprotein tỷ trọng thấp (Low Density Lypoprotein)

UV-VIS : Tử ngoại-khả kiến

w/v : Khối lượng/thể tích

w/w : Khối lượng/khối lượng

Bảng 3.1: Mật độ quang của dãy dung dịch chất đối chiếu tại bước sóng 250

nm 23 Bảng 3.2: Kết quả định lượng isoflavonoid toàn phần trong sắn dây tươi 24 Bảng 3.3: Hiệu suất và hàm lượng isoflavonoid toàn phần trong dịch chiết 26

Bảng 3 4: Hiệu suất và hàm lượng cao đặc (thu được từ 500 ml dịch chiết, tương ứng khoảng 150 g dược liệu) 28 Bảng 3.5: Số liệu của quá trình điều chế cao 30 Bảng 3.6: Một số chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm 31

Hình 1.1: Sắn dây 2

Hình 1.2: Công thức cấu tạo isoflavon 8

Hình 1.3: Sự tương tự về cấu trúc của isoflavon và estrogen 9

Hình 3 1: Phổ UV-VIS của chất đối chiếu 22

Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa nồng độ puerarin và mật độ quang 23

Hình 3.3: Sơ đồ phương pháp chiết xuất isoflavonoid trong sắn dây tươi 25

Hình 3.4: Hệ thống cô tuần hoàn (bên trái), máy phun sấy (bên phải) 30

Hình 3.5: Bột cao sắn dây phun sấy 31

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sắn dây là cây họ đậu, trồng rất phổ biến trên khắp nước ta, chủ yếu được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất tinh bột sắn dây và nguyên liệu làm thuốc trong đông y (cát căn) Trong thành phần của sắn dây có chứa nhiều isoflavonoid, phần lớn thuộc nhóm isoflavon Tuy nhiên, trong quá trình làm tinh bột sắn dây, hầu hết các isoflavon này hòa tan vào nước và bị loại bỏ

Isoflavonoid có nhiều tác dụng sinh học đáng quý Có thể kể đến như tác dụng kiểu phytoestrogen do có cấu trúc gần với estrogen, tác dụng chống oxy hóa, chống lão hóa, tác dụng chống ung thư, tác dụng trên tim mạch, tuần hoàn não

Các sản phẩm từ isoflavonoid sắn dây đã sớm được đưa vào sử dụng rộng rãi ở Châu Âu, Mỹ, Trung Quốc và Nhật Bản Đặc biệt ở Trung Quốc hiện nay phát triển rất mạnh các sản phẩm thuốc và thực phẩm chức năng từ sắn dây

Ở Việt Nam có một số chế phẩm chứa flavonoid sắn dây Tuy nhiên nguyên liệu cao khô sắn dây sử dụng vẫn phải nhập khẩu từ Trung Quốc với giá cao Nhằm góp phần tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có để sản xuất cao khô dược liệu phục vụ cho sản xuất dược phẩm trong nước, chúng tôi tiến hành thực

hiện đề tài “Nghiên cứu điều chế cao khô sắn dây” với mục tiêu:

1 Điều chế được cao khô sắn dây có hàm lượng isoflavonoid toàn phần trên 10%

2 Phân lập được puerarin từ sắn dây

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vài nét về sắn dây

1.1.1 Tên gọi

Tên khoa học: Pueraria thomsonii Benth Một số

tài liệu Trung Quốc thì ghi loài P lobata (Will) Ohwi

hoặc P pseudohirsuta Tang et Wang [3]

Tên khác: Bạch cát, Khau cáu (Tày), Bẳn mắm

Muốn trồng người ta đào các hố sâu 50 cm, đổ rác và mùn rồi lấp đất xốp lại Đến tháng 1-2, giâm cành vào các hố đó Nhiều nơi ở nước ta thường kết hợp làm giàn lấy bóng mát Cũng có những vùng chuyên trồng để chế tinh bột ví dụ làng Cao Xá thuộc huyện Châu Thành, tỉnh Tây Ninh mỗi năm sản xuất khoảng

20 tấn tinh bột [3]

1.1.3 Bộ phận dùng

Rễ củ thu hoạch từ tháng 10 đến tháng 3 - 4 năm sau

Hình 1.1: Sắn dây

Để chế vị Cát căn thì rửa sạch, bóc bỏ lớp vỏ dày bên ngoài, cắt thành khúc dài 10-15 cm Nếu củ to thì bổ dọc để có những thanh dày khoảng 1 cm, sau đó xông diêm sinh rồi phơi hoặc sấy khô Loại trắng ít xơ là loại tốt

Muốn chế tinh bột sắn dây thì bóc vỏ, đem giã nhỏ hoặc mài trên tấm sắt tây có đục thủng lỗ, hoặc xay bằng máy, cho thêm nước rồi nhào lọc qua rây thưa, loại bã, sau đó lọc lại 1 lần nữa qua rây dày hơn, để lắng gạn lấy tinh bột rồi đem phơi hoặc sấy khô [3]

1.1.4 Thành phần hóa học

Hàm lượng tinh bột trong củ tươi khoảng 12-15% Ngoài tinh bột ra còn có các isoflavonoid Các isoflavonoid chính trong sắn dây là puerarin, daidzin,

daidzein, ngoài ra còn có formonetin, pueraria glycoside 1-6 và puerarol [3]

Trong sắn dây xác định được 7 isoflavonid chính là: 3′-hydroxypuerarin, puerarin, 3′-methoxypuerarin, daidzin, genistin, formononetin-7-glucosid và daidzein [11]

O

O

R3 R2

1.1.5 Tác dụng dược lý

 Tác dụng trên tim mạch

Thử nghiệm tác dụng trên chó bằng cách tiêm flavon toàn phần của sắn dây cho thấy có tác dụng giãn động mạch vành đồng thời giảm lượng tiêu thụ oxy của cơ tim và giảm sức kháng mạch vành Trên chó đã dùng reserpin trước đó để làm tiêu kiệt hết lượng catecholamin trong mô tim, dạng isoflavon toàn phần với liều 30 mg/kg và puerain với liều 20 mg/kg có tác dụng làm tăng lưu lượng mạch vành và giảm sức kháng mạch vành Những kết quả này giống với kết quả thí nghiệm trên chó không dùng reserpin Điều này chứng tỏ hiện tượng làm giãn mạch vành của sắn dây không liên quan tới catecholamin mà là do tác dụng giãn

cơ trực tiếp [4]

 Tác dụng hạ huyết áp của cao sắn dây

Tiêm tĩnh mạch với liều 5-30 mg trên chó, mèo có tác dụng hạ huyết áp Cao sắn dây với liều 750 mg/kg tiêm tĩnh mạch có khả năng đối kháng với tác dụng kích thích tim của isoprenalin, ngoài ra còn làm giảm nhịp tim và gây hạ huyết

áp [4]

 Tác dụng chống loạn nhịp tim

So sánh tác dụng chống loạn nhịp tim của puerarin, daidzein và dạng chiết cồn từ sắn dây trên chuột cống trắng và chuột nhắt trắng cho thấy tác dụng của daidzein tương đối mạnh, cho hiệu quả rõ rệt Dạng chiết cồn có tác dụng giống với daidzein; điều này chứng tỏ daidzein là thành phần chủ yếu có tác dụng chống loạn nhịp tim Puerarin với liều tương đương có tác dụng kháng rõ rệt với

loạn nhịp tim do aconitin và bari clorid gây nên, giảm nhẹ mức độ loạn nhịp do

thiếu máu cơ tim, tác dụng đối kháng với rung thất không bằng daidzein [4]

 Tác dụng đối với tuần hoàn não

Thử nghiệm trên chó gây mê, flavon toàn phần của sắn dây bằng đường tiêm động mạch cảnh với liều 0,1-5,0 mg/kg làm lưu lượng máu qua não tăng 87,7-134%, nếu cho thuốc bằng đường tiêm tĩnh mạch flavon toàn phần với liều 10-30 mg/kg chỉ làm lưu lượng máu qua não tăng 20% Trên bệnh nhân cao huyết áp, flavon toàn phần tiêm bắp với liều 200 mg có 53% bệnh nhân tuần

hoàn não được cải thiện, làm giảm trợ lực mạch máu não [4]

 Tác dụng đối với hệ thần kinh

Dịch chiết sắn dây với liều 2 g/kg cho thẳng vào dạ dày trên thỏ gây sốt bằng vaccin thương hàn có tác dụng hạ nhiệt, bột sắn dây có tác dụng tương tự Nước sắn dây với liều 6 g/kg cho thẳng vào dạ dày trên chuột nhắt trắng, có tác dụng

cải thiện hiện tượng trí nhớ bị tổn thương do scopolamin gây nên [4]

 Tác dụng đối với cơ trơn

Trong các dịch chiết bằng aceton, methanol và nước từ sắn dây thì dạng PA3, PA4 có tác dụng ức chế co bóp hồi tràng cô lập chuột lang kiểu papaverin, dạng PM1, PM3 lại có tác dụng gây co thắt Daidzein có tác dụng giải co thắt đối với ruột non đã cô lập của chuột nhắt trắng, tác dụng này bằng khoảng 1/3 tác

dụng của papaverin [4]

 Tác dung hạ đường huyết và lipid huyết

Nước sắc sắn dây với liều 6-8 g/kg cho thẳng vào dạ dày thỏ bình thường

có tác dụng hạ đường huyết nhưng không thể đối kháng với hiện tượng đường

huyết tăng cao do adrenalin gây nên Puerain với liều 500 mg/kg hoặc dùng liều thấp phối hợp với aspirin 100 mg/kg dùng liên tục trong 9 ngày qua đường dạ dày, có tác dụng làm giảm cholesterol huyết thanh của chuột nhắt trắng đã được gây tăng cholesterol bằng alloxan Aspirin dùng đơn độc không có tác dụng hạ

đường huyết hay lipid huyết [4]

 Tác dụng chống ung thư

Dịch chiết cồn từ sắn dây với liều 10 g/kg trên động vật thí nghiệm có tác dụng ức chế nhất định sự phát triển của tế bào sarcom 180, u báng Ehrlich và tế bào ung thư phổi Lewis Daidzein với nồng độ 14µg/ml có tác dụng ức chế sự

tăng trưởng của tế bào HL.60 [4]

tocopherol acetat với liều 50 mg/kg [4]

 Các tác dụng khác:

Dung dịch puerarin 0,2-1,6% với liều 0,2 ml tiêm dưới da chuột lang theo dõi phản ứng giác mạc và da cho thấy tác dụng gây mê cục bộ Thí nghiệm trên chuột hamster, cao sắn dây có tác dụng chống nghiện rượu, trên chuột cống trắng, daidzein có tác dụng hạ thấp lượng rượu trong máu và rút ngắn thời gian ngủ do rượu gây nên Đối với gan của chuột nhắt trắng gây nhiễm độc bằng

CCI4, isoflavon chiết từ cát căn với liều 250 mg/kg có tác dụng ức chế 30,7%

hoạt độ men GOT [4]

Bột sắn dây được dùng để pha với nước có đường uống vào mùa hè, có tác dụng giải nhiệt, làm mát cơ thể Ngoài ra, nó còn được dùng làm tá dược dính

trong bào chế thuốc [4]

1.2 Isoflavonoid

1.2.1 Công thức hóa học

3 4 5

6 7

Hình 1.2: Công thức cấu tạo isoflavon Isoflavonoid là một phân nhóm của flavonoid, chúng có cấu tạo khung theo kiểu C6-C3-C6 hay nói cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và

B nối với nhau qua một mạch 3 carbon, đồng thời ở nhóm chất isoflavon thì C3thường đóng vòng với vòng A tạo nên dị vòng có oxy C, vòng B gắn với C3 tại

vị trí iso (vị trí số 3-Hình 1.2) trên mạch C3 Dựa trên mức độ oxy hóa của mạch

C3 người ta phân loại flavonoid thành các nhóm: isoflavan, isoflav-3-en, isoflavan-4-ol, isoflavanon, isoflavon, rotenoid, pterocarpan, coumestan, 3-arylcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon, dihydroisochalcon, aryl benzofuran, homoisoflavon Trong đó, isoflavon là nhóm lớn nhất của isoflavonoid Có 364 chất đã biết (năm 1986) Daidzin, daidzein, puerarin và một chất khác có trong sắn dây là ví dụ [3], [9]

1.2.2 Tính chất lý hóa

Các chất thuộc nhóm isoflavon vì không có nối đôi liên hiệp giữa vòng B với nhóm carbonyl nên thường không có màu Độ tan các chất không giống nhau, thường thì dạng glycosid là hợp chất phân cực nên không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu cơ, tan được trong nước, tốt nhất là cồn nước Các aglycon

tan được trong dung môi hữu cơ, không tan trong nước, các dẫn chất isoflavon

có nhóm 7-hydroxy thường dễ tan trong dung dịch kiềm loãng

Isoflavonoid là một phân nhóm của flavonoid vì vậy các chất thuộc phân nhóm này cũng có thể thể hiện các tính chất mà flavonoid có, tùy thuộc vào từng chất cụ thể Có thể kể một vài tính chất của flavonoid như sau:

benzen, các nhóm OH gắn vào đây sẽ thể hiện tính chất của OH phenol Tùy theo nhóm và tùy theo số lượng nhóm OH phenol mà mức độ thể hiện tính chất khác nhau Chúng có thể cho phản ứng với FeCl3, phản ứng với kiềm, phản ứng với chì acetat Các dẫn chất có nhóm OH ở vị trí số 7 có thể phản

ứng với muối diazoni tạo thành chất màu azoic vàng cam đến đỏ

dung dịch NaOH 30% thì sẽ mở vòng C rồi dẫn đến tạo thành dẫn chất acid

thơm và dẫn chất phenol [3]

1.2.3 Tác dụng sinh học

Trong những năm gần đây, isoflavon ngày càng được quan tâm nhiều hơn

do tác dụng kiểu estrogen và kháng estrogen của chúng, các tác dụng này dẫn đến việc giảm tỷ lệ ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt, bệnh tim mạch hay bệnh loãng xương Ngoài ra chúng còn thể hiện nhiều tác dụng tốt khác như tính chống oxy hóa, điều hòa quá trình phiên mã gen và ức chế các enzyme [9]

- Tác dụng kiểu estrogen và kháng estrogen

Hình 1.3: Sự tương tự về cấu trúc của isoflavon và estrogen

Isoflavon có vai trò như một chất chủ vận hay đối kháng estrogen, tùy thuộc vào nồng độ của chúng tại mô đích, lượng estrogen nội sinh, số lượng và chủng loại ER [9], [6] Chúng có thể gắn vào cả hai receptor của estrogen là ERα

và ERβ, nhưng chủ yếu gắn vào ERβ, receptor này có nhiều ở tinh hoàn, các tế bào mô tiết của tuyến tiền liệt, hệ mạch và các tế bào ung thư vú ERβ cũng được tìm thấy ở não, xương, bàng quang, biểu mô mạch

So với estradiol, các tác dụng kiểu estrogen của isoflavon yếu hơn Genistein có hiệu lực bằng 1/3 estradiol khi tương tác với ERβ và 1/1000 khi tương tác với ER [13] Hoạt tính của các phytoestrogen nói chung yếu hơn estrogen 102 đến 105 lần [6], [10] Tuy có hoạt tính thấp nhưng nồng độ trong máu của chúng có thể đạt tới 50-800 ng/ml ở người tiêu thụ lượng thực phẩm chứa khoảng 50 mg isoflavon/ngày, trong khi nồng độ estradiol thường từ 40-80 pg/ml Genistein có tác dụng tương tự như estradiol trên các tế bào ung thư vú, trên buồng trứng, tử cung, tuyến tiền liệt, mạch và xương

Isoflavon còn có tác dụng đối kháng estrogen Ở nồng độ lớn hơn

100-1000 lần so với estradiol, isoflavon được xem là có khả năng cạnh tranh với các estrogen nội sinh và đối kháng với tác dụng kích thích tăng trưởng của estrogen Isoflavon cạnh tranh với estradiol để gắn vào receptor, ngăn cản giải phóng hormone tuyến yên và làm gián đoạn hệ thống điều hòa ngược vùng dưới đồi-tuyến yên [9]

- Tác dụng trên tim mạch

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng isoflavon có nhiều tác dụng tốt trên tim mạch Isoflavon có khả năng làm giảm nồng độ triglycerid huyết tương, giảm cholesterol toàn phần, giảm LDL-cholesterol, tăng HDL, tuy nhiên cơ chế tác dụng của chúng vẫn chưa được làm rõ Ngoài ra isoflavon còn ngăn cản sự hình thành vữa động mạch nhờ khả năng chống oxy hóa các LDL [9], [6]

- Tác dụng trong điều trị ung thư

Nhiều nghiên cứu dịch tễ học cho thấy chế độ ăn giàu isoflavon có thể chống lại một số dạng ung thư, đặc biệt là ung thư phụ thuộc hormon như ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt [9]

- Tác dụng trên hệ miễn dịch

Daidzein làm tăng sự hoạt hóa các tế bào lympho của chuột Khi thử

nghiệm in vivo, daidzein liều cao làm tăng một vài đặc tính miễn dịch [9]

Về lý thuyết, các phytoestrogen được cho là có thể cải thiện chức năng nhận thức, đặc biệt là chức năng ngôn ngữ Các kết quả nghiên cứu trên động vật cho thấy isoflavon có khả năng mang lại những tác dụng có lợi cho trên thần kinh và trí nhớ [9]

Có bằng chứng cho rằng các phytoestrogen đưa vào cơ thể trong chế độ ăn

là có lợi với những người bị bệnh thận mãn tính Tiêu thụ các sản phẩm giàu isoflavon giúp làm chậm sự tiến triển của bệnh Isoflavon tác động theo nhiều cơ chế như điều hòa quá trình tăng trưởng và sinh tế bào, quá trình tổng hợp chất ngoại bào, phản ứng viêm, stress oxy hóa [9]

- Tác dụng làm giảm các triệu chứng mãn kinh

Nghiên cứu cho thấy sự giảm đáng kể các triệu chứng vận mạch và triệu chứng do thiếu estrogen ở 51 bệnh nhân được bổ sung phytoestrogen với liều 17 mgx2 lần/ngày [9]

Cao thuốc được chia làm 3 loại:

Cao lỏng: Là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng

trong đó cồn và nước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo quản hay cả hai) Nếu không có chỉ dẫn khác, quy ước 1 ml cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu dùng để điều chế cao thuốc

Cao đặc: Là khối đặc quánh Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong

cao không quá 20%

Cao khô: Là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm Cao khô

không được có độ ẩm lớn hơn 5% [2]

1.3.3 Kỹ thuật điều chế

Quy trình điều chế cao khô gồm những giai đoạn sau:

 Chuẩn bị dung môi, dược liệu

Dược liệu thường được sấy khô, chia nhỏ đến kích thước thích hợp Một số dược liệu đặc biệt cần diệt enzym hoặc loại chất béo Dung môi điều chế cao thường là nước, ethanol, ete ethylic Để làm tăng độ tan của hoạt chất có thể acid

hóa dung môi bằng acid hydrochloric, acid acetic hoặc kiềm hóa bằng amoniac, natri hydroxyd

 Chiết xuất hoạt chất

Tùy theo bản chất dược liệu và dung môi, tiêu chuẩn chất lượng thành phẩm cũng như điều kiện trang thiết bị và quy mô sản xuất, có thể sử dụng các phương pháp: Ngâm, ngấm kiệt, chiết xuất ngược dòng hay các phương pháp thích hợp khác

 Loại bớt tạp chất

Cần phải loại tạp chất vì chúng thường dễ phân hủy ảnh hưởng đến chất lượng cao thuốc Trường hợp điều chế cao đặc, cao khô, nếu hàm lượng hoạt chất chưa đủ quy định cũng có thể cũng có thể tiến hành loại bớt tạp chất

 Cô đặc và sấy khô

Để điều chế cao thuốc thường phải tiến hành loại dung môi Dịch chiết được cô đặc đến tỷ lệ dung môi quy định, với cao đặc và cao khô thì sau khi cô đặc, sấy đến độ ẩm không quá 20% đối với cao đặc và không quá 5% đối với cao khô

1.3.4 Các chỉ tiêu chất lượng của cao thuốc

Cảm quan: Cao thuốc phải có thể chất, màu sắc, độ đồng nhất theo quy

định

Độ tan: Cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã dùng để điều chế

cao

Mất khối lượng do làm khô: Thông thường cao đặc không quá 20%, cao

khô không quá 5%

Các chỉ tiêu khác: Độ nhiễm khuẩn, giới hạn thuốc bảo vệ thực vật, kim

loại nặng, chất bảo quản, định tính, định lượng… [2]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2 1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

- Củ sắn dây tươi mua tại chợ Trung Tâm-thành phố Việt Trì-Phú Thọ

- Chất đối chiếu: Cao khô sắn dây 82,31% puerarin (Trung Quốc)

- Hóa chất:

Bảng 2.1: Nguồn gốc, tiêu chuẩn hóa chất sử dụng

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

Thiết bị:

 Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H (Đức)

 Máy cất quay Buchi B480 (Thuỵ Sỹ)

 Cân phân tích Mettler Toledo AB204S (Thuỵ Sỹ)

 Cân kỹ thuật Sartorius BP2001S (Đức)

 Máy đo quang HITACHI U-1900

 Máy ảnh Sony Cybershot DSC-W730

 Đèn tử ngoại

 Tủ sấy MEMMERT (Đức)

 Máy xay búa

 Máy xay sinh tố

 Hệ thống lọc hút Buchner

 Cân xác định hàm ẩm nhanh Precisa XM 60 (Thụy Sĩ)

 Máy đo tỷ trọng biểu kiến ERWEKA SVM (Đức)

 Hệ thống phun sấy LPG-5 Centrifugal Spray Dryer (Changzhou Jinqiao, Trung Quốc)

 Bình hút ẩm

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Chiết xuất isoflavonoid từ nguyên liệu tươi

- Xác định hàm lượng isoflavonoid toàn trong sắn dây tươi

- Chiết xuất isoflavonoid từ củ tươi

2.2.2 Tinh chế dịch chiết

- Khảo sát một số phương pháp loại bớt tạp chất: Phương pháp kết tủa tạp chất bằng nhiệt, phương pháp tủa tạp chất bằng ethanol và phương pháp kết hợp nhiệt

độ và ethanol

2.2.3 Điều chế cao khô

- Điều chế cao khô bằng phương pháp phun sấy

- Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng cao khô

2.2.4 Phân lập puerarin

- Phân lập puerarin và chứng minh cấu trúc sản phẩm

2 3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xác định hàm lượng isoflavonoid toàn phần trong sắn dây

- Sử dụng phương pháp đo quang [7], [ 8], [ 14], [ 15], [ 17], [ 18]

Tiến hành:

- Chuẩn bị mẫu thử:

+ Mẫu thử là sắn dây tươi: Cân chính xác khoảng 10 g dược liệu, thêm

100 ml ethanol 70%, xay mịn bằng máy xay sinh tố Chuyển hết vào bình định mức 500 ml, thêm ethanol 70% đến vừa đủ, siêu âm 30 phút trong bể siêu âm Sau đó để lắng 15 phút ở điều kiệ phòng, gạn lấy phần trong Lấy chính xác 5 ml dịch trong vừa gạn vào bình định mức 100 ml, thêm 5 ml ethanol 96% và nước cất vừa đủ, lắc đều

+ Mẫu thử là dịch chiết: Tùy vào loại dịch chiết mà pha loãng đến nồng độ

nằm trong khoảng nồng độ tuyến tính, bước cuối cùng thêm ethanol để được nồng độ ethanol trong mẫu là 10% (như mẫu đối chiếu và mẫu trắng)

+ Mẫu thử là cao khô toàn phần: Cân chính xác khoảng 0,1 g cao cần xác

định hàm lượng, hòa tan bằng ethanol 96%, chuyển vào bình định mức 50

ml, thêm ethanol 96% đến vừa đủ, lắc đều Lấy chính xác 10,0 ml dung dịch vừa pha vào bình định mức 50 ml, thêm cồn 96% đến vừa đủ, lắc đều Lấy chính xác 5,0 ml dung dịch vừa pha vào bình định mức 50 ml, thêm nước cất đến vừa đủ, lắc đều

- Chuẩn bị mẫu đối chiếu:

+ Cân chính xác 12,1 mg puerarin 82,31% (tương đương 10,0 mg puerarin) vào bình định mức 50 ml, hòa tan bằng ethanol 96%, thêm ethanol 96% đến vừa đủ, lắc đều Lấy chính xác 10,0 ml dung dịch vừa pha vào bình định mức 50 ml, thêm cồn 96% đến vừa đủ, lắc đều lấy chính xác 5,0 ml dung dịch vừa pha vào bình định mức 50 ml, thêm nước cất đến vừa đủ, lắc đều

Trong đó:

- X: là hàm lượng isoflavonoid toàn phần trong sắn dây (%)

- AT: là mật độ quang của mẫu thử

- AC: là mật độ quang của mẫu đối chiếu

- CC: là nồng độ chất đối chiếu (mg/ml)

- m: khối lượng mẫu thử cân được (g)

- V: thể tích mẫu thử (ml)

- K: là độ pha loãng của mẫu thử

2.3.2 Phương pháp chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây

Kết hợp quá trình chiết xuất và quá trình thu tinh bột Dựa trên các bước tiến hành làm tinh bột sắn dây để thu lấy dịch chiết nước từ sắn dây

2.3.3 Phương pháp tinh chế

Thực hiện và so sánh 3 phương pháp với lượng mẫu là 500 ml dịch chiết:

 Phương pháp 1 (kết tủa tạp chất bằng nhiệt): Dịch chiết được đun cách thủy 30 phút, để nguội qua đêm Lọc và rửa tủa bằng nước

 Phương pháp 2 (kết tủa tạp chất bằng ethanol): Cô giảm áp đến thể cao mềm, thêm ethanol 96%, để qua đêm Lọc và rửa tủa bằng ethanol 96%

 Phương pháp 3 (kết hợp phương pháp 1 và 2): Đun cách thủy 30 phút, để qua đêm, lọc và rửa tủa bằng nước Dịch lọc và dịch rửa được gộp lại, cô giảm áp đến thể cao mềm, thêm ethanol 96%, để qua đêm Lọc và rửa tủa bằng ethanol 96%