Nghiên cứu bào chế phức hợp lipid chứa amphotericin b

Ngày nay, hướng nghiên cứu bào chế các dạng phức hợp lipid của Amphotericin B với cấu trúc không phải cấu trúc màng như liposome, là kết quả sự phá vỡ của cấu trúc liposome và tiếp đến l

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2014

em hoàn thành khóa luận này

Nhân đây, em cũng gửi lời cảm ơn các thầy cô trong ban giám hiệu, các phòng ban và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo em suốt 5 năm học tập tại trường

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người đã giúp đỡ, động viên em trong quá trình học tập và làm khóa luận

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Nguyễn Thị Mỹ

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Amphotericin B 2

1.1.1 Công thức hóa học 2

1.1.2 Đặc tính lý hóa 2

1.1.3 Tác dụng dược lý 3

1.1.4 Dược động học 3

1.1.5 Chỉ định 3

1.1.6 Tác dụng không mong muốn 4

1.1.7 Liều dùng 4

1.1.8 Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường 5

1.2 Phức hợp lipid chứa Amphotericin B 5

1.2.1 Khái quát về phức hợp lipid chứa Amphotericin B 5

1.2.2 Cơ chế hình thành 7

1.2.3 Thành phần cấu tạo 8

1.2.4 Độ ổn định của phức hợp lipid chứa AMB 9

1.2.5 Ưu nhược điểm 10

1.3 Một số nghiên cứu về phức hợp lipid chứa AMB 12

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Phương pháp xác định độ tan của AmB trong dung dịch 10% DMSO trong nước 15

2.3.2 Phương pháp bào chế phức hợp lipid chứa AMB 16

2.3.3 Phương pháp đánh giá đặc tính về hình thức, phân bố KTTP của phức hợp lipid chứa AMB 17

2.3.4 Phương pháp đánh giá hiệu suất tạo phức hợp lipid chứa AMB 18

2.4 Điều kiện thí nghiệm 21

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3.1 Độ tan của AMB trong dung dịch 10% DMSO trong nước 22

3.1.1 Xác định cực đại hấp thụ của AMB trong dung dịch 10% DMSO trong nước 22

3.1.2 Xác định độ tan của AMB trong dung dịch 10% DMSO trong nước 22

3.2 Xây dựng phương pháp định lượng AMB trong hỗn dịch phức hợp lipid chứa AMB bằng phương pháp quang phổ UV - VIS 23

3.2.1 Quét phổ cực đại hấp thụ của AMB trong methanol và ảnh hưởng của tá dược lipid đến phương pháp đo quang phổ UV - VIS 23

3.2.2 Xây dựng đường chuẩn tuyến tính phụ thuộc giữa nồng độ AMB và độ hấp thụ quang 24

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức bào chế đến đặc tính của phức hợp lipid chứa AMB 26

3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược 26

3.3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất/lipid tới công thức 28

3.3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng lipid sử dụng 30

3.3.4 Tính ổn định của phức hợp lipid chứa AMB 35

3.4 Bàn luận 38

3.4.1 Về phương pháp định lượng AMB 38

3.4.2 Về phương pháp bào chế 38

3.4.6 Về phương pháp đánh giá hiệu suất bắt giữ AMB trong phức hợp lipid chứa AMB 39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường……… 5

Bảng 2.1 Nguyên liệu ……… ……14

Bảng 3.1 Mối tương quan giữa nồng độ AMB và độ hấp thụ quang ……… 24

Bảng 3.2 Khảo sát tính lặp lại của hệ thống ………25

Bảng 3.3 Thành phần các công thức bào chế nhóm thay đổi tỷ lệ tá dược……… 26

Bảng 3.4 KTTP, phân bố KTTP và hiệu suất bắt giữ dược chất của các mẫu nhóm thay đổi tỷ lệ tá dược……….27

Bảng 3.5 Thành phần các công thức bào chế nhóm thay đổi tỷ lệ AMB………….28

Bảng 3.6 KTTP, phân bố KTTP các công thức nhóm thay đổi tỷ lệ AMB……….29

Bảng 3.7 Thành phần các công thức nhóm C và D……… 30

Bảng 3.8 KTTP, phân bố KTTP, hiệu suất bắt giữ AMB trong phức hợp lipid của các công thức nhóm C, D……… ………31

Bảng 3.9 KTTP, phân bố KTTP của các công thức nhóm C và D trước và sau khi lọc tiếp tuyến……….32

Bảng 3.10: KTTP, phân bố KTTP và hiệu suất bắt giữ AMB trong phức hợp của các mẫu sau 3 tuần bảo quản……… 36

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Hình dạng cấu trúc ba chế phẩm với lipid của AMB hiện có trên thị trường……… 6

Hình 1.2 Cấu trúc giả định của phức hợp lipid chứa AMB……… ……8

Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn quy trình bào chế phức hợp lipid chứa AMB……….…17 Hình 2.2 Cơ chế của phương pháp lọc tiếp tuyến áp dụng loại bỏ AMB tự do, DMSO tồn dư… …….………20

Hình 2.3 Sơ đồ lọc tiếp tuyến hỗn dịch lipid chứa AMB………21

Hình 3.1 Hình 3.1: Phổ UV – VIS của AMB trong dung dịch 10% DMSO trong nước ……….22 Hình 3.2 Phổ hấp thụ UV – VIS…… ………23

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ AMB và độ hấp thụ quang

……… 24 Hình 3.4 Mẫu CT4 và CT5 sau bào chế……… ……….27

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của các công thức nhóm thay đổi tỷ lệ tá dược……….27 Hình 3.6 Mẫu CT7 sau bào chế…… ……… 29

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của các công thức nhóm C và D………31

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn KTTP các công thức nhóm C và D………32

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn KTTP các mẫu nhóm C, D trước và sau khi lọc tiếp tuyến……… 33

Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn hiệu suất bắt giữ AMB trong phức hợp lipid sau khi loại AMB tự do bằng thẩm tích và lọc tiếp tuyến……… ……….34

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP của các mẫu sau 3 tuần bảo quản…36

Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hiệu suất bắt giữ AMB trong phức hợp lipid của các mẫu sau 3 tuần bảo quản……….………37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học và công nghệ, ngày càng có nhiều dạng thuốc mới ra đời với những tính năng vượt trội hơn so với các dạng thuốc quy ước

Amphotericin B là một dược chất thân dầu, có tính lưỡng thân, có tác dụng kháng nấm, được chỉ định trong trường hợp nhiễm nấm nặng toàn thân do hoạt tính kháng nấm mạnh và phổ tác dụng rộng Tuy nhiên, khả năng hấp thu và hoạt tính sinh học của thuốc trong đường tiêu hóa thấp nên thường được sử dụng dưới dạng tiêm Dạng chế phẩm tiêm ban đầu của Amphotericin B là dạng micell (chế phẩm Fungizone) Tuy nhiên ở dạng bào chế này, Amphotericin B không bền trong hệ tuần hoàn và nhanh chóng chuyển từ dạng miccell sang dạng lipoprotein gây độc cho tế bào vật chủ, đặc biệt là độc tính trên thận Tiếp đến, dạng bào chế liposome của Amphotericin B thể hiện nhiều ưu điểm xong hàm lượng Amphotericin B sử dụng thấp, chỉ khoảng 9 mol % Ngày nay, hướng nghiên cứu bào chế các dạng phức hợp lipid của Amphotericin B với cấu trúc không phải cấu trúc màng như liposome, là kết quả sự phá vỡ của cấu trúc liposome và tiếp đến là sự tái sắp xếp lại của các phân tử lipid và dược chất khi được sử dụng ở hàm lượng cao hơn đang là một hướng đi đầy triển vọng để giảm độc tính của thuốc, cải thiện được hệ số điều trị, tăng được liều sử dụng của Amphorericin B

Để góp phần ứng dụng phức hợp lipid làm chất mang thuốc và giảm độc tính

của thuốc, triển khai đề tài “Nghiên cứu bào chế phức hợp lipid chứa Amphotericin B” nhằm mục tiêu:

+ Bào chế được phức hợp lipid chứa Amphotericin B

+ Đánh giá một số đặc tính: kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân và hiệu suất tạo phức hợp lipid của hệ phức hợp lipid chứa Amphotericin B

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Amphotericin B

- Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng da cam

- Độ tan: không tan trong nước ở pH từ 6 đến 7, tan trong dimethylsulphoxid (DMSO) 30- 40 mg/ml và propylene glycol, khó tan trong dimethylformamid (2- 4 mg/ml), rất khó tan trong methanol [1]

Hóa tính chính của AMB là của hệ dây nối đôi luân phiên, nhóm amin và nhóm carboxylic tự do, do đó AMB có tính chất như sau:

- Tính lưỡng thân: phân tử AMB có một đầu thân dầu, một đầu thân nước

- Tạo muối hơi tan trong nước khi tác dụng với acid hydrochloric hoặc các dung dịch kiềm

- Dung dịch 0,0005% trong methanol ở vùng sóng từ 300- 450 nm có cực đại hấp thụ ở 362, 381 và 405 nm Tỷ lệ độ hấp thụ ở 362 nm so với 381 nm là 0,57- 0,61, tỷ lệ độ hấp thụ ở 381 nm so với ở 405 nm là 0,87- 0,93 [1]

1.1.3 Tác dụng dược lý

Cơ chế tác dụng: Cơ chế tác dụng của AMB, cũng như của các polyen khác, dựa trên sự liên kết giữa đuôi kỵ nước của AMB với đuôi ergosterol trên màng tế bào nấm, tạo các kênh trên màng tế bào, làm thay đổi tính thấm và tính khử cực của màng tế bào, làm rò gỉ các chất bên trong tế bào ra ngoài và cuối cùng làm chết tế bào nấm AMB cũng có thể liên kết với các cholesterol trên màng tế bào người, điều này là nguyên nhân chính gây tác dụng phụ nghiêm trọng của AMB Ái lực của AMB với ergosterol màng lớn hơn với cholesterol màng nên AMB thể hiện tác dụng chống nấm chủ yếu nhưng vẫn tiềm tàng tác dụng phụ nghiêm trọng, đặc biệt

là tổn thương thận với các biểu hiện: suy thận, tăng creatinin và ure huyết, rối loạn chuyển hoá, tăng kali máu…

AMB có tác dụng kìm nấm đối với một số loại nấm như: Absidia, Aspergillus,

Basidiobolus, Blastomyces dermatitidis, Candida… Nồng độ ức chế tối thiểu đối

với các loại nấm này là 0,03- 1 mcg/ml

Thuốc không có tác dụng với virus, vi khuẩn và ricketsia [2]

1.1.4 Dược động học

- AMB hấp thu rất kém qua đường tiêu hóa, chủ yếu dùng đường tiêm tĩnh mạch để điều trị nhiễm nấm nặng toàn thân, chỉ dùng đường uống để điều trị nhiễm

nấm đường tiêu hóa và niêm mạc miệng

- AMB liên kết với protein ở mức cao Thuốc phân bố rộng rãi trong cơ thể

- AMB bài tiết rất chậm qua thận, 2-5 % liều dùng, bài tiết dưới dạng còn hoạt tính sinh học AMB có nguy cơ gây độc cao với thận, không loại được thuốc ra khỏi

cơ thể bằng thẩm tách máu [2]

1.1.5 Chỉ định

- Thuốc uống (viên, hỗn dịch) dùng tại chỗ để điều trị nhiễm nấm Candida

albicans ở miệng và ở đường tiêu hóa

- Tiêm tĩnh mạch AMB dùng để điều trị nhiễm nấm toàn thân nặng do nhiễm

Aspergillus, Blastomyces, Candida, Coccidiodesimmitis, Cryptococus,

Hitstoplasma, Mucor, Paracoccidioides và Sporotrichum

- Phòng nhiễm nấm cho bệnh nhân sốt kéo dài và giảm bạch cầu trung tính đã điều trị lâu bằng kháng sinh phổ rộng hoặc điều trị ung thư bằng hóa chất

- Dạng liposome hoặc phức hợp lipid: chỉ định cho trường hợp điều trị thất bại bằng AMB thông thường hoặc trong trường hợp AMB có thể gây độc cho thân hoặc gây suy thận [2]

1.1.6 Tác dụng không mong muốn

- Phản ứng chung: sốt, rét run, nôn, đau đầu, đau cơ khi mới tiêm truyền

- Độc với thận: giảm sức lọc cầu thận, hoại tử thận

- Tác dụng không mong muốn khác: thiếu máu, độc với gan tim, giảm K+ và

- AMB dạng liposome: bắt đầu với liều 1 mg/kg/ngày, tăng dần tới 3- 4 mg/kg/ngày

- Dạng phức hợp phospholipid: thường dùng với liều 5 mg/kg/ngày

Đường uống:

- Viên 10 mg hoặc hỗn dịch chứa 100mg/ml

- Nhiễm nấm Candida ở miệng: hỗn dịch dùng 1 ml/lần × 4 lần/ngày, giữ thuốc trong miệng ít nhất 1 phút trước khi nuốt, viên tan trong miệng dùng 4 lần/ngày

- Nhiễm nấm Candida ở ruột: 100- 200 mg/ngày, 4 lần/ngày [2]

1.1.8 Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường

Bảng 1.1: Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường

% mol AMB

Dạng bào chế

Liều dùng

Bột đông khô

1 mg/kg/ ngày

100 mg/20

ml

DMPC:

DMPG :AMB (tỷ lệ mol 2 lipid là 7:3)

Phức hợp lipid

35 -

50

Hỗn dịch

5 mg/kg/ ngày

Phức hợp

Bột đông khô

3 -4 mg/kg/ ngày

HSPC:DSPG:

Chol:AMB (tỷ lệ mol 2:0,8:1:0,4)

Bột đông khô

3 – 5 mg/kg/ ngày

1.2 Phức hợp lipid chứa Amphotericin B

1.2.1 Khái quát về phức hợp lipid chứa Amphotericin B

Ngày nay, nhiều công thức bào chế sử dụng lipid làm chất mang AMB để giảm độc tính của AMB đã được nghiên cứu Những công thức này có khả năng bắt giữ AMB tốt hơn các chất diện hoạt tạo micell và giải phóng từ từ AMB ở dạng monomer do đó giảm được độc tính với tế bào người [12]

Hiện có 3 chế phẩm thương mại khác nhau của AMB trên thị trường Chúng khác nhau về hình thái, thành phần, hoạt tính sinh học: AmBisome (nghiên cứu sản xuất bởi công ty dược phẩm Nexstar) có cấu trúc dạng liposome một lớp, kích thước nhỏ Các dạng cấu trúc khác là có chứa hàm lượng AMB cao hơn: Amphotec (nghiên cứu và sản xuất bởi Liposome Technology Inc.) là các phân tử dạng đĩa có

chứa AMB, cholesterol sunlfat Abelcet (nghiên cứu và sản xuất bởi The Liposome Company Ltd) bao gồm AMB liên kết với hai phospholipid tổng hợp trong một phức hợp có cấu trúc dạng chuỗi có thể dài tới 5 µm [6] [12]

Hình 1.1 Hình dạng cấu trúc ba chế phẩm với lipid của AMB hiện có trên thị

trường

Ba công thức này đều giúp cải thiện được hệ số điều trị của AMB so với dạng thuốc quy ước (Fungizone) xong giá thành đắt, do đó khó tiếp cận được ở các nước đang phát triển Bên cạnh đó, AmBisome với kích thước tiểu phân nhỏ, có thời gian lưu trong hệ tuần hoàn kéo dài xong hàm lượng AMB nạp được trong liposome là tương đối thấp, chỉ 5 - 10 mol % AMB/tổng mol lipid Dạng phức hợp lipid Abelcet

có sử dụng hàm lượng AMB cao hơn (35 – 50 mol %) xong kích thước phân tử lớn nên bị thanh thải nhanh trong quá trình điều trị, làm hạn chế tác dụng của thuốc [12]

Cấu trúc dạng chuỗi được hình thành bởi phức hợp giữa DMPC, DMPG với AMB được gọi là phức hợp lipid chứa AMB

Phức hợp lipid chứa AMB là một trong những dạng bào chế mới của AMB nhằm giảm độc tính của thuốc Phức hợp này được chỉ định thuốc lựa chọn thứ hai

cho điều trị nhiễm nấm toàn thân trên những bệnh nhân kháng thuốc hoặc không dung nạp thuốc, suy giảm chứa năng thận, có các chống chỉ định khác với AMB Ở một vài quốc gia, phức hợp lipid chứa AMB được chỉ định là thuốc lựa chọn hàng đầu cho điều trị nhiễm nấm Candida nghiêm trọng [15]

Ngày nay, các nhà khoa học hướng tới nghiên cứu bào chế các dạng kết hợp với lipid của AMB có thể sản xuất bằng các phương pháp thông thường Họ muốn tạo ra các phân tử lipid vừa có khả năng bắt giữ AMB với hàm lượng cao và vừa có kích thước nhỏ [12]

1.2.2 Cơ chế hình thành

Phân tử AMB có tính lưỡng thân: một đầu thân nước, một đầu thân dầu Trong môi trường nước, khi nồng độ AMB dưới nồng độ tạo micelle tới hạn, sự phối hợp giữa AMB với phospholipid tạo liposome, sự xâm nhập của các monomer AMB vào lớp lipid của liposome dường như là khó khăn do phần chuỗi polyhydroxy thân nước trong cấu tạo của phân tử Do đó các phân tử AMB bị giới hạn ở mặt trung gian giữa hai màng lipid

Khi AMB ở nồng độ lớn hơn, AMB có thể chèn vào, gây phá vỡ cấu trúc màng kép lipid của liposome AMB sẽ tự kết tụ với nhau, các phân tử lipid được xen kẽ vào giữa các phân tử AMB để hình thành cấu trúc phức hợp

Một mô hình được đưa ra để mô tả tương tác giữa AMB và lipid trong phức hợp lipid chứa AMB như sau:

Hình 1.2 Cấu trúc giả định của phức hợp lipid chứa AMB

Sự sắp xếp giữa lipid và AMB này phù hợp với nhiều nghiên cứu đã quan sát được Trong phức hợp, đuôi hydrocacrbon thân dầu của lipid gắn với chuỗi polyen của AMB, gốc phosphat của phân tử lipid hướng về phía gốc amin của phân tử AMB, hình thành một hình trụ tròn Các hình trụ nhỏ này xếp cạnh nhau kéo dài cấu trúc chuỗi Khó có thể nói chính xác khoảng kích thước độ dài chuỗi này Độ dày của phức hợp này bằng một nửa độ dày của màng kép lipid thông thường [9] [16] [21]

1.2.3 Thành phần cấu tạo

Phospholipid

Là thành phần cơ bản cấu tạo nên tiểu phân phức hợp lipid, là những phân tử lưỡng thân, vừa thân dầu, vừa thân nước, cấu tạo từ khung phân tử glycerol gắn với các nhóm phân cực và các acid béo Nhóm phân cực có thể tích điện âm, dương, có thể không tích điện, các acid béo có thể no hoặc không no [3]

Phân loại phospholipid:

Phospholipid tự nhiên: Hay dùng nhất là phosphatidylcholin (PC) từ lecitin của trứng hoặc đậu tương, ngoài ra còn có phosphatidylethanolamin (PE), phosphatidyl serin (PS), phosphatidylglycerol (PG)…

Phospholipid tổng hợp: disteroyl phosphatidylcholin (DSPC), dioleyl phosphatidylcholin (DOPC), dioleyl phosphatidylethanolamin (DOPE), dipalmitoyl phosphatidylcholin (DPPC)…

Khi lựa chọn phospholipid cần lưu ý đến:

Mức độ bão hòa: có phospholipid không no (như phosphatidylcholin lòng đỏ

phosphatidylcholin, dipalmitidyl phosphatidic…) Các phospholipid không no dễ bị oxy hóa dẫn đến hỏng phức hợp ảnh hưởng đến độ ổn định của phức hợp lipid Khả năng tích điện: một số phospholipid tích điện dương (stearylamin), còn một số tích điện âm (như acid phosphatidic, phosphatidylserin…) Phospholipid tích điện tạo ra lực đẩy tĩnh điện tạo ra liên kết tĩnh điện với dược chất tích điện Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sự thay đổi điện tích trên bề mặt liposome cũng như phức hợp lipid có thể làm thay đổi đặc tính dược động học và sự phân bố của liposome, phức hợp lipid trong cơ thể

Mức độ tinh khiết: hiện các phospholipid dùng bào chế liposome cũng như bào chế phức hợp lipid được bán sẵn trên thị trường Tuy nhiên sản phẩm của các nhà sản xuất khác nhau có mức độ tinh khiết khác nhau Tùy theo mục đích của nghiên cứu và sử dụng có thể lựa chọn loại phospholipid thích hợp [3]

Dược chất AMB

1.2.4 Độ ổn định của phức hợp lipid chứa AMB

Với thành phần cấu tạo chính là phospholipid, phức hợp lipid chứa AMB được coi là dạng bào chế kém ổn định cả về mặt vật lí, hóa học và sinh học Sự thay đổi đặc tính lí hóa của phức hợp lipid chứa AMB có thể xảy ra ngay trong quá trình bào chế cũng như trong quá trình bảo quản

Về mặt hóa học: sự kém ổn định về mặt hóa học của phức hợp lipid chứa là do quá trình oxy hóa chuỗi acid béo không no của phân tử phospholipid và quá trình thủy phân của phospholipid tạo ra các lysophospholipid Quá trình oxy hóa tăng nhanh do tác động của các yếu tố: nhiệt độ, ánh sáng, chiếu xạ…[3]

Về mặt vật lí: sự kém ổn định về mặt vật lí của phức hợp lipid chứa AMB có thể là do sự có mặt của các thành phần tích điện trên bề mặt gây ra hiện tượng kết tụ tiểu phân trong quá trình bảo quản Khi sử dụng các phospholipid có nhiệt độ chuyển pha thấp có thể gây ra hiện tượng chuyển pha (từ gel có cấu trúc bền chặt sang dạng lỏng liên kết lỏng lẻo) cũng có thể là một yếu tố ảnh hưởng tới đặc tính vật lí của phức hợp Trạng thái vật lí của phức hợp lipid chứa AMB có thể được đánh giá thông qua các chỉ số: kích thước tiểu phân và thế Zeta [3]

1.2.5 Ưu nhược điểm

có thể tăng hiệu lực của thuốc Thêm nữa, hệ phức hợp lipid có thể giảm độc tính của nhiều loại thuốc bằng cách thay đổi sự phân bố sinh học của thuốc, tránh các tổ chức nhạy cảm Việc giảm được độc tính cho phép nhiều dược chất có thể sử dụng được hơn và là nền tảng cho sự thành công của một số chế phẩm dựa trên lipid của AMB như Ambisome, Abelcet [4]

Giảm độc tính của thuốc: trong phức hợp lipid của AMB, phân tử AMB sẽ liên kết chặt chẽ với các phân tử lipid trong phức hợp, do đó không còn AMB tương tác với cholesterol trên màng tế bào – tương tác gây nên độc tính của AMB trên người, đặc biệt trên thận Dù có sự liên kết chặt chẽ với lipid trong phức hợp xong phức hợp với lipid này vẫn giữ được tác dụng chống nấm của AMB Điều này được giải thích là do sự giải phóng chọn lọc và từ từ AMB ra khỏi phức hợp [14] [15]

Phức hợp lipid chứa AMB cho phép cải thiện khả năng dung nạp AMB, có thể giải thích do đặc điểm dược động học của phức hợp lipid này: phức hợp lipid chứa

AMB nhanh chóng thanh thải khỏi máu và có thể tích phân bố lớn Sau khi tiêm, phức hợp lipid chứa AMB nhanh chóng bị thực bào và tập trung tại các mô, đặc biệt gan, lách và phổi là những nơi thường bị nhiễm nấm Candida và Aspergilus nghiêm trọng [15]

Trong ba công thức thương mại phối hợp với lipid của AMB hiện có trên thị trường, chỉ phức hợp lipid chứa AMB mới đạt được nồng độ AMB trong phổi cao hơn so với dạng AMB quy ước Trong khi đó, phổi được biết đến là đường vào của nhiều loại nấm gây bệnh, nồng độ AMB cao hơn trong phổi ít nhất về mặt lý thuyết

là sẽ giảm được sự phân bố, xâm nhập của các tác nhân này vào đường máu [13].Phức hợp lipid của AMB liều đơn giúp cho việc sử dụng thuốc đơn giản hơn, tránh phải sử dụng nhiều lần Trong điều trị nấm Candida, việc sử dụng phức hợp lipid chứa AMB dùng liều đơn cho phép đạt hiệu quả tương đương hoặc tốt hơn so với sử dụng AMB đa liều thông thường, giảm được nguy cơ xảy ra các tác dụng không mong muốn do giảm được lượng AMB cần phải sử dụng và giảm được chi phí điều trị so với chi phí khi sử dụng AMB đa liều thông thường với thời gian điều trị kéo dài [5]

Chi phí điều trị nhiễm nấm với phức hợp lipid chứa AMB thấp hơn so với điều trị với dạng liposome của AMB [15] [20]

1.2.5.2 Nhược điểm

Đa số phương pháp bào chế phức hợp lipid giống với các phương pháp bào chế liposome là có sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan lipid, do đó có thể gây tác

động bất lợi đến sức khỏe người sử dụng cũng như môi trường [19]

Phospholipid không bền về mặt hóa học nên tuổi thọ của dạng bào chế phức hợp lipid ngắn Các phospholipid sử dụng đa số được chiết từ nguồn nguyên liệu tự nhiên, do đó rất khó kiểm soát mức độ tinh khiết của nguyên liệu Phospholipid có thể lẫn các lysophospholipid hoặc các sản phẩm của quá trình oxy hóa phospholipid [17]

1.3 Một số nghiên cứu về phức hợp lipid chứa AMB

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng phức hợp lipid chứa AMB có thể được bào chế bằng các phương pháp tương tự như các phương pháp bào chế liposome đã được nghiên cứu [8] [10] [16]

Andrew S.Janoff cùng các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về sự liên kết giữa AMB với lipid Họ đã chỉ ra rằng liên kết giữa AMB và lipid tạo ra nhiều dạng cấu trúc khác nhau: cấu trúc liposome và các cấu trúc không phải liposome được gọi là các chuỗi Họ đã nghiên cứu bào chế các chế phẩm phức hợp lipid chứa AMB có sử dụng hai lipid DMPC: DMPG (tỉ lệ mol 7:3), cho hàm lượng AMB thay đổi Tiến hành phân tích hình ảnh kính hiển vi điện tử đông khô các mẫu chứa 0, 5, 25, 50 mol % AMB cho thấy: ở nồng độ 5 mol % AMB, cấu trúc liposome kích thước nhỏ được hình thành Khi hàm lượng AMB tăng lên 25 mol%, cấu trúc liposome cơ bản

là biến mất, được thay thế bằng các cấu trúc dạng chuỗi liên kết chặt chẽ Ở nồng độ AMB lớn hơn 50 mol%, các cấu trúc chuỗi tiếp tục xuất hiện, tuy nhiên không còn liên kết chặt chẽ [7] [8] [10]

Trong một nghiên cứu khác, Andrew S.Janoff cùng các cộng sử dụng các phương pháp phân tích thích hợp chỉ ra các đặc tính của phức hợp lipid chứa AMB

Họ sử dụng loại kính hiển vi điện tử thích hợp quan sát cho thấy dạng cấu trúc liposome được tạo ra ở các nồng độ 0 và 5 mol % AMB, nhưng tạo ra các các phức hợp không phải liposome ở 25 và 50 mol % AMB; định lượng thể tích được bắt giữ chỉ ra không có thể tích nào được bắt giữ, do đó không phải là cấu trúc liposome; phân tích nhiệt vi sai (DSC) cho thấy không có một cấu trúc màng kép lipid nào trước và trong quá trình chuyển pha [10]

Andrew S.Janoff và các cộng sự khi phân tích nhiệt vi sai (DSC) của chế phẩm liposome và phức hợp lipid chứa AMB có tỉ lệ dược chất thay đổi cho thấy: xuất hiện các pic đặc trưng tại nồng độ 5 mol% AMB trong khi không quan sát được tại nồng độ 25 mol% AMB Tại 25 mol% AMB, tất cả lipid đã liên kết với AMB Dữ liệu đó được xác nhận khi dữ liệu li tâm theo tỷ trọng cũng đã chỉ ra hai pic quan sát được: một pic của phức hợp giữa AMB và lipid, một pic của lipid dạng

tự do ở nồng độ 5 mol% AMB, xong tại nồng độ 25 và 50 mol% AMB khi tất cả lipid được kết hợp với AMB thì chỉ quan sát được một peak duy nhất [8]

M Larabi cùng cộng sự đã tiến hành bào chế một dạng phức hợp mới của lipid

và AMB, sử dụng hai lipid DMPC và DMPG ở cùng tỷ lệ mol như trong chế phẩm Abelcet AMB (3,5 mg), DMPC (3,6 mg) và DMPG (1,5 mg) được hòa tan trong 15

ml methanol Phối hợp pha hữu cơ trên vào 15 ml pha nước Bốc hơi, cô đặc thể tích dưới áp suất giảm đến thể tích 5 ml Kết quả cho thấy các tiểu phân tạo ra có hình dạng và kích thước khác với các tiểu phân trong Abelcet Các tiểu phân có kích thước khoảng 250 ± 50 nm, chỉ số đa phân tán PDI = 0,12; sử dụng các phương pháp phân tích thích hợp đi đến kết luận là các cấu trúc dạng đĩa mỏng Trong khi

đó Abelcet là các cấu trúc dạng chuỗi dài, kích thước có thể lên đến 5 µm [11] Thomas J.Walsh và cộng sự đã nghiên cứu về tác dụng của phức hợp lipid chứa AMB trên 556 trường hợp nhiễm nấm xâm lấn kháng thuốc hoặc không đáp ứng với điều trị thông thường Trong suốt liệu trình điều trị, nồng độ creatinin giảm một cách đáng kể so với ban đầu Trong đó, 162 bệnh nhân có nồng độ creatinin tại điểm khởi đầu giai đoạn điều trị với phức hợp lipid chứa AMB là ≥ 2.5 mg/dL Nồng độ creatinin tại tuần thứ 6 giảm đáng kể so với tuần đầu tiên (P ≤ 0.003) Trong 291 trường hợp được xác nhận có thể đánh giá được đáp ứng điều trị có 167 trường hợp đáp ứng hoàn toàn hoặc đáp ứng một phần với phức hợp lipid chứa AMB bao gồm: 55/130 (42%) ca nhiễm Aspergillosis, 28/42 (67%) ca nhiễm Candidiasis, 17/24 (71%) ca nhiễm Zygomycosis và 9/11 (82%) ca nhiễm Fusariosis Những nghiên cứu đó hỗ trợ cho việc sử dụng phức hợp lipid chứa AMB trong điều trị nhiễm nấm trên những bệnh nhân kháng thuốc hoặc không có đáp ứng với phương pháp điều trị thông thường [18]

Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào về phức hợp lipid chứa AMB đã công

bố

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: phức hợp lipid chứa AMB

Nguyên liệu:

Bảng 2.1 Nguyên liệu

- Phương tiện nghiên cứu:

 Hệ thống thiết bị phân tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Malvern – Anh)

 Thiết bị lọc tiếp tuyến MicroKros® Filter Modules, màng polysulfone 50

kD, diện tích lọc 28 cm2 (Spectrumlab, Mỹ)

 Túi thẩm tích Spectrumlab/Por4, MWCO: 12- 14kD (Spectrum Labs – Mỹ)

 Bể siêu âm Ultrasonic LC 60H

 Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) JEOL 1010 (Nhật Bản)

 Cân phân tích Satorius BP121S

 Máy đo pH InoLap

 Máy đo quang UV-VIS U1800 HITACHI (Nhật)

 Cân kỹ thuật Sartorius TE412 (Đức)

 Tủ sấy, tủ lạnh, các dụng cụ thủy tinh…

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Xây dựng phương pháp định lượng AMB trong hỗn dịch phức hợp lipid chứa AMB

- Xác định độ tan bão hòa của AMB trong dung dịch 10% DMSO trong nước

- Xây dựng quy trình bào chế phức hợp lipid chứa AMB

- Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức đến đặc tính của phức hợp lipid chứa AMB

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xác định độ tan của AmB trong dung dịch 10% DMSO trong nước

2.3.1.1 Xác định cực đại hấp thụ của AMB trong dung dịch 10% DMSO trong nước

Cân chính xác khoảng 0,0010 g AMB hòa tan bằng dung dịch 10% DMSO trong nước trong bình định mức 50 ml, bổ sung dung dịch 10% DMSO trong nước đến vạch Tiến hành quét phổ hấp thụ của mẫu trên trong khoảng bước sóng 200 –

500 nm, mẫu trắng là dung dịch 10% DMSO trong nước Xác định các cực đại hấp thụ

2.3.1.2 Xác định độ tan của AMB trong dung dịch 10% DMSO trong nước

- Cân một lượng dư AMB (khoảng 0,1 g AMB), cho vào bình nón 250 ml, thêm

100 ml môi trường khảo sát, khuấy từ liên tục trong 24h, ở nhiệt độ phòng (khoảng

25oC)

- Sau 24h, hút khoảng 5ml dịch đem ly tâm ở tốc độ 12 000 v/p, nhiệt độ phòng, trong 30 phút để loại AMB không tan Lấy phần dịch phía trên, đem lọc qua màng celulose acetat 0,45 µm

- Tiến hành pha loãng với dung dịch 10% DMSO trong nước tới nồng độ thích hợp,

đo độ hấp thụ A tại bước sóng cực đại hấp thụ của AMB trong dung dịch 10% DMSO trong nước, mẫu trắng là dung dịch 10% DMSO trong nước

- Xác định độ tan của AMB trong môi trường khảo sát ở nhiệt độ phòng bằng phương pháp so sánh độ hấp thụ quang A với dung dịch AMB chuẩn pha trong môi trường thử có nồng độ Co, độ hấp thụ quang Ao xác định:

Ci = 𝐴𝑖

𝐴𝑜× 𝐶𝑜 × 𝑘 Trong đó:

k: là hệ số pha loãng của mẫu thử

- Đặt mẫu sau khuấy từ 24h ở trên vào tủ lạnh, nhiệt độ 8oC, sau 24h lấy mẫu ra, hút khoảng 5 ml dịch đem tiến hành ly tâm và định lượng như trên, xác định được độ

2.3.2 Phương pháp bào chế phức hợp lipid chứa AMB

Nghiên cứu tiến hành phương pháp kết tụ nano bào chế phức hợp lipid chứa AMB

Quy trình bào chế phức hợp lipid chứa AMB như sau:

- Cân và hòa tan AMB trong 2,0 ml DMSO

- Cân và hòa tan HSPC, DSPG trong 10 ml cloroform

- Phối hợp 2 dung dịch trên, khuấy trộn trên máy khuấy từ để thu được dung dịch đồng nhất

- Tiêm 20 ml dung dịch đệm phosphat pH 7,4 vào dung dịch trên kết hợp khuấy từ

- Khuấy từ 24h ở điều kiện nhiệt độ phòng để bốc hơi hết dung môi cloroform

- Phức hợp lipid chứa AMB được đóng trong lọ thủy tinh, đậy kín, bọc giấy bạc, tránh ánh sáng và bảo quản ở 2 – 8oC

Quy trình bào chế được trình bày trong sơ đồ:

Hình 2.1: Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn quy trình bào chế phức hợp lipid chứa AMB

2.3.3 Phương pháp đánh giá đặc tính về hình thức, phân bố KTTP của phức

hợp lipid chứa AMB

- Về hình thức: là hỗn dịch đục, màu vàng nhạt, không có lắng cặn tinh thể, không có các tiểu phân có kích thước lớn có thể quan sát bằng mắt thường

- Đánh giá KTTP, phân bố KTTP bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động với thiết bị Zetasizer ZS 90 Pha loãng 100 lần hệ phức hợp lipid chứa AMB với nước tinh khiết đã lọc qua màng cellulose acetat 0,2 µm, tiến hành đo KTTP Thiết bị cũng cho giá trị về chỉ số đa phân tán PDI của hệ

HSPC, DSPG/ CHCl3

Phối hợp được pha hữu cơ

Dung dịch đệm

Khuấy từ bốc hơi dung môi

- Đánh giá kết quả: Zaverage, PDI (đánh giá phân bố KTTP theo Intensity) Trong đó, chỉ số Zaverage (đơn vị đo “d.nm”: số nanomet đường kính tiểu phân) gần tương đương với KTTP trung bình của mẫu khi giá trị PDI nhỏ ( <0,5) và dùng để

so sánh về kích thước giữa các mẫu phức hợp lipid chứa AMB khác nhau Khi PDI lớn (> 0,5) thì chỉ số Zaverage không có ý nghĩa, khi đó dựa vào các peak trên đồ thị phân bố KTTP để so sánh kích thước giữa các mẫu

2.3.4 Phương pháp đánh giá hiệu suất tạo phức hợp lipid chứa AMB

2.3.4.1 Quét phổ cực đại hấp thụ của AMB trong methanol và ảnh hưởng của

tá dược lipid đến phương pháp đo quang phổ UV - VIS

- Pha dung dịch chuẩn AMB trong methanol có nồng độ 4,6 µg/ml (dd1)

- Chuẩn bị một mẫu thử hỗn dịch phức hợp lipid chứa AMB: bào chế 1 mẫu phức hợp có tỷ lệ % mol AMB/tổng số mol lipid là 25 mol % (HSPC: DSPG tỷ lệ mol là 7:3) Lấy chính xác 0,5 ml hỗn dịch hòa tan bằng methanol trong bình định mức 25

ml, bổ sung methanol đến vạch Pha loãng với methanol tới hệ số pha loãng thích hợp để thu được dung dịch có nồng độ AMB là 4,6 µg/ml (dd2)

- Pha dung dịch 2 tá dược lipid trong methanol có nồng độ tương đương với nồng

độ của chúng trong mẫu thử trên (dd3)

- Tiến hành quét phổ UV – VIS của (dd1) và (dd2) trên trong khoảng bước sóng

200 – 500 nm với mẫu trắng là methanol để xác định cực đại hấp thụ của AMB trong methanol Đồng thời quét phổ của (dd3) để xác định ảnh hưởng của tá dược lipid tới phương pháp đo quang phổ UV – VIS

2.3.4.2 Xây dựng đường chuẩn tuyến tính giữa nồng độ AMB và độ hấp thụ quang

- Cân một lượng chính xác AMB, pha trong methanol tạo dung dịch chuẩn gốc nồng

độ 50 µg/ml

- Từ dung dịch chuẩn gốc pha một dãy chuẩn với các nồng độ Ci khác nhau thích hợp Tiến hành đo độ hấp thụ Ai của dãy chuẩn tại bước sóng 405 nm, và lập đồ thị của Atheo C

- Lập đồ thì biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ của AMB và độ hấp thu quang

A dựa vào các giá trị thu được

2.3.4.3 Xác định hàm lượng AMB trong hỗn dịch lipid chứa AMB bằng

phương pháp đo quang

Điều kiện tiến hành đo quang:

- Bước sóng đo quang: 405 nm

- Mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 0,0100 g AMB hòa tan bằng methanol trong bình định mức 50 ml, bổ sung thể tích bằng methanol đến vạch Tiến hành pha loãng dung dịch trên với methanol tới hệ số pha loãng cuối cùng k1 = 2500

- Mẫu thử: hút chính xác 0,50 ml hỗn dịch phức hợp lipid chứa AMB, hòa tan bằng methanol trong bình định mức 25 ml, bổ sung thể tích bằng methanol đến vạch Tiến hành pha loãng với methanol tới hệ số pha loãng cuối cùng bằng hệ số pha loãng của mẫu thử k2 = 2500

- Hàm lượng AMB trong hỗn dịch phức hợp lipid chứa AMB được xác định theo công thức:

Ct = 𝐴𝑡

𝐴𝑜× 𝑚𝑐 Trong đó:

Ao: độ hấp thụ quang của mẫu chuẩn

At: độ hấp thụ quang của mẫu thử

mc: khối lượng cân của mẫu chuẩn (mg)

2.3.4.4 Phương pháp xác định hiệu suất tạo phức hợp lipid chứa AMB

Định lượng AMB toàn phần: nồng độ AMB trong hỗn dịch phức hợp phức hợp lipid chứa AMB thô

Hút chính xác 0,5 ml hỗn dịch phức hợp lipid chứa AMB thô, pha loãng mẫu như mô tả ở mục 2.3.4.3 Tiến hành đo quang, thu được độ hấp thụ quang A1