Nghiên cứu bào chế phức hợp lipid chứa amphotericin b

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ MỸ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PHỨC HỢP LIPID CHỨA AMPHOTERICIN B KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ MỸ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PHỨC HỢP LIPID CHỨA AMPHOTERICIN B KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS. Trần Thị Hải Yến Nơi thực hiện: Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới: TS. Trần Thị Hải Yến Là người thầy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các thầy cô, các kỹ thuật viên bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện để em hoàn thành khóa luận này. Nhân đây, em cũng gửi lời cảm ơn các thầy cô trong ban giám hiệu, các phòng ban và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo em suốt 5 năm học tập tại trường. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người đã giúp đỡ, động viên em trong quá trình học tập và làm khóa luận. Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Mỹ MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Amphotericin B 2 1.1.1. Công thức hóa học 2 1.1.2. Đặc tính lý hóa 2 1.1.3. Tác dụng dược lý 3 1.1.4. Dược động học 3 1.1.5. Chỉ định 3 1.1.6. Tác dụng không mong muốn 4 1.1.7. Liều dùng 4 1.1.8. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường 5 1.2. Phức hợp lipid chứa Amphotericin B 5 1.2.1. Khái quát về phức hợp lipid chứa Amphotericin B 5 1.2.2. Cơ chế hình thành 7 1.2.3. Thành phần cấu tạo 8 1.2.4. Độ ổn định của phức hợp lipid chứa AMB 9 1.2.5. Ưu nhược điểm 10 1.3. Một số nghiên cứu về phức hợp lipid chứa AMB 12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu. 14 2.2. Nội dung nghiên cứu 15 2.3. Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1. Phương pháp xác định độ tan của AmB trong dung dịch 10% DMSO trong nước. 15 2.3.2. Phương pháp bào chế phức hợp lipid chứa AMB 16 2.3.3. Phương pháp đánh giá đặc tính về hình thức, phân bố KTTP của phức hợp lipid chứa AMB 17 2.3.4. Phương pháp đánh giá hiệu suất tạo phức hợp lipid chứa AMB 18 2.4. Điều kiện thí nghiệm 21 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1. Độ tan của AMB trong dung dịch 10% DMSO trong nước. 22 3.1.1. Xác định cực đại hấp thụ của AMB trong dung dịch 10% DMSO trong nước 22 3.1.2. Xác định độ tan của AMB trong dung dịch 10% DMSO trong nước 22 3.2. Xây dựng phương pháp định lượng AMB trong hỗn dịch phức hợp lipid chứa AMB bằng phương pháp quang phổ UV - VIS 23 3.2.1. Quét phổ cực đại hấp thụ của AMB trong methanol và ảnh hưởng của tá dược lipid đến phương pháp đo quang phổ UV - VIS 23 3.2.2. Xây dựng đường chuẩn tuyến tính phụ thuộc giữa nồng độ AMB và độ hấp thụ quang 24 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức bào chế đến đặc tính của phức hợp lipid chứa AMB 26 3.3.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược 26 3.3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất/lipid tới công thức. 28 3.3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng lipid sử dụng 30 3.3.4. Tính ổn định của phức hợp lipid chứa AMB 35 3.4. Bàn luận 38 3.4.1. Về phương pháp định lượng AMB 38 3.4.2. Về phương pháp bào chế 38 3.4.6. Về phương pháp đánh giá hiệu suất bắt giữ AMB trong phức hợp lipid chứa AMB 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Viết tắt Từ/cụm từ đầy đủ 1 AMB Amphotericin B 2 HSPC Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (Hydrogenated soy phosphatidylcholine) 3 DSPG Distearoylphosphatidylglycerol 4 KTTP Kích thước tiểu phân 5 NSX Nhà sản xuất 6 PDI Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index) 7 DMPC α – Dimyristoylphosphatidylcholin 8 DMPG 1- α-Dimyristoylphosphatidylglycerol 9 DMSO Dimethyl sufoxide 10 LTT Lọc tiếp tuyến 11 TT Thẩm tích DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường……………………… 5 Bảng 2.1. Nguyên liệu ……………………………………………………… ……14 Bảng 3.1. Mối tương quan giữa nồng độ AMB và độ hấp thụ quang …………… 24 Bảng 3.2. Khảo sát tính lặp lại của hệ thống ………………………………………25 Bảng 3.3. Thành phần các công thức bào chế nhóm thay đổi tỷ lệ tá dược……… 26 Bảng 3.4. KTTP, phân bố KTTP và hiệu suất bắt giữ dược chất của các mẫu nhóm thay đổi tỷ lệ tá dược……………………………………………………………….27 Bảng 3.5. Thành phần các công thức bào chế nhóm thay đổi tỷ lệ AMB………….28 Bảng 3.6. KTTP, phân bố KTTP các công thức nhóm thay đổi tỷ lệ AMB……….29 Bảng 3.7. Thành phần các công thức nhóm C và D……………………………… 30 Bảng 3.8. KTTP, phân bố KTTP, hiệu suất bắt giữ AMB trong phức hợp lipid của các công thức nhóm C, D……………… …………………………………………31 Bảng 3.9. KTTP, phân bố KTTP của các công thức nhóm C và D trước và sau khi lọc tiếp tuyến……………………………………………………………………….32 Bảng 3.10: KTTP, phân bố KTTP và hiệu suất bắt giữ AMB trong phức hợp của các mẫu sau 3 tuần bảo quản………………………………………………………… 36 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Hình dạng cấu trúc ba chế phẩm với lipid của AMB hiện có trên thị trường……………………………………………………………………………… 6 Hình 1.2. Cấu trúc giả định của phức hợp lipid chứa AMB………………… ……8 Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn quy trình bào chế phức hợp lipid chứa AMB…………………………………………………………………………….…17 Hình 2.2. Cơ chế của phương pháp lọc tiếp tuyến áp dụng loại bỏ AMB tự do, DMSO tồn dư… …….……………………………………………………………20 Hình 2.3. Sơ đồ lọc tiếp tuyến hỗn dịch lipid chứa AMB…………………………21 Hình 3.1. Hình 3.1: Phổ UV – VIS của AMB trong dung dịch 10% DMSO trong nước ……………………………………………………………………………….22 Hình 3.2. Phổ hấp thụ UV – VIS…… ……………………………………………23 Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ AMB và độ hấp thụ quang …………………………………………………………………………………… 24 Hình 3.4. Mẫu CT4 và CT5 sau bào chế……………… ………………………….27 Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của các công thức nhóm thay đổi tỷ lệ tá dược…………………………………………………………………….27 Hình 3.6. Mẫu CT7 sau bào chế…… …………………………………………… 29 Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của các công thức nhóm C và D……………………………………………………………………………………31 Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn KTTP các công thức nhóm C và D……………………32 Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn KTTP các mẫu nhóm C, D trước và sau khi lọc tiếp tuyến……………………………………………………………………………… 33 Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn hiệu suất bắt giữ AMB trong phức hợp lipid sau khi loại AMB tự do bằng thẩm tích và lọc tiếp tuyến………………………… ……….34 Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP của các mẫu sau 3 tuần bảo quản…36 Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hiệu suất bắt giữ AMB trong phức hợp lipid của các mẫu sau 3 tuần bảo quản………………………….………………………37 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học và công nghệ, ngày càng có nhiều dạng thuốc mới ra đời với những tính năng vượt trội hơn so với các dạng thuốc quy ước. Amphotericin B là một dược chất thân dầu, có tính lưỡng thân, có tác dụng kháng nấm, được chỉ định trong trường hợp nhiễm nấm nặng toàn thân do hoạt tính kháng nấm mạnh và phổ tác dụng rộng. Tuy nhiên, khả năng hấp thu và hoạt tính sinh học của thuốc trong đường tiêu hóa thấp nên thường được sử dụng dưới dạng tiêm. Dạng chế phẩm tiêm ban đầu của Amphotericin B là dạng micell (chế phẩm Fungizone). Tuy nhiên ở dạng bào chế này, Amphotericin B không bền trong hệ tuần hoàn và nhanh chóng chuyển từ dạng miccell sang dạng lipoprotein gây độc cho tế bào vật chủ, đặc biệt là độc tính trên thận. Tiếp đến, dạng bào chế liposome của Amphotericin B thể hiện nhiều ưu điểm xong hàm lượng Amphotericin B sử dụng thấp, chỉ khoảng 9 mol %. Ngày nay, hướng nghiên cứu bào chế các dạng phức hợp lipid của Amphotericin B với cấu trúc không phải cấu trúc màng như liposome, là kết quả sự phá vỡ của cấu trúc liposome và tiếp đến là sự tái sắp xếp lại của các phân tử lipid và dược chất khi được sử dụng ở hàm lượng cao hơn đang là một hướng đi đầy triển vọng để giảm độc tính của thuốc, cải thiện được hệ số điều trị, tăng được liều sử dụng của Amphorericin B. Để góp phần ứng dụng phức hợp lipid làm chất mang thuốc và giảm độc tính của thuốc, triển khai đề tài “Nghiên cứu bào chế phức hợp lipid chứa Amphotericin B” nhằm mục tiêu: + Bào chế được phức hợp lipid chứa Amphotericin B. + Đánh giá một số đặc tính: kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân và hiệu suất tạo phức hợp lipid của hệ phức hợp lipid chứa Amphotericin B. [...]... 10 B t đông khô 3–5 mg/kg/ ngày Hàm lượng Thành phần Fungizone 50 mg AMB và natri deoxycholat Abelcet 100 mg/20 ml Amphotec Ambisome Dạng cấu trúc Liposome 1.2 Phức hợp lipid chứa Amphotericin B 1.2.1 Khái quát về phức hợp lipid chứa Amphotericin B Ngày nay, nhiều công thức b o chế sử dụng lipid làm chất mang AMB để giảm độc tính của AMB đã được nghiên cứu Những công thức này có khả năng b t giữ AMB... phân tử lipid được xen kẽ vào giữa các phân tử AMB để hình thành cấu trúc phức hợp Một mô hình được đưa ra để mô tả tương tác giữa AMB và lipid trong phức hợp lipid chứa AMB như sau: 8 Hình 1.2 Cấu trúc giả định của phức hợp lipid chứa AMB Sự sắp xếp giữa lipid và AMB này phù hợp với nhiều nghiên cứu đã quan sát được Trong phức hợp, đuôi hydrocacrbon thân dầu của lipid gắn với chuỗi polyen của AMB, gốc... AMB, có thể giải thích do đặc điểm dược động học của phức hợp lipid này: phức hợp lipid chứa 11 AMB nhanh chóng thanh thải khỏi máu và có thể tích phân b lớn Sau khi tiêm, phức hợp lipid chứa AMB nhanh chóng b thực b o và tập trung tại các mô, đặc biệt gan, lách và phổi là những nơi thường b nhiễm nấm Candida và Aspergilus nghiêm trọng [15] Trong ba công thức thương mại phối hợp với lipid của AMB... nguyên liệu Phospholipid có thể lẫn các lysophospholipid hoặc các sản phẩm của quá trình oxy hóa phospholipid [17] 12 1.3 Một số nghiên cứu về phức hợp lipid chứa AMB Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng phức hợp lipid chứa AMB có thể được b o chế b ng các phương pháp tương tự như các phương pháp b o chế liposome đã được nghiên cứu [8] [10] [16] Andrew S.Janoff cùng các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về sự... được: một pic của phức hợp giữa AMB và lipid, một pic của lipid dạng 13 tự do ở nồng độ 5 mol% AMB, xong tại nồng độ 25 và 50 mol% AMB khi tất cả lipid được kết hợp với AMB thì chỉ quan sát được một peak duy nhất [8] M Larabi cùng cộng sự đã tiến hành b o chế một dạng phức hợp mới của lipid và AMB, sử dụng hai lipid DMPC và DMPG ở cùng tỷ lệ mol như trong chế phẩm Abelcet AMB (3,5 mg), DMPC (3,6 mg) và... của nghiên cứu và sử dụng có thể lựa chọn loại phospholipid thích hợp [3] Dược chất AMB 1.2.4 Độ ổn định của phức hợp lipid chứa AMB Với thành phần cấu tạo chính là phospholipid, phức hợp lipid chứa AMB được coi là dạng b o chế kém ổn định cả về mặt vật lí, hóa học và sinh học Sự thay đổi đặc tính lí hóa của phức hợp lipid chứa AMB có thể xảy ra ngay trong quá trình b o chế cũng như trong quá trình b o... phẩm tiêm của AMB trên thị trường B ng 1.1: Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường TT 1 2 3 4 Tên chế phẩm % mol AMB Dạng b o chế Liều dùng Micell 34 B t đông khô 1 mg/kg/ ngày DMPC: DMPG :AMB (tỷ lệ mol 2 lipid là 7:3) Phức hợp lipid 35 50 Hỗn dịch 5 mg/kg/ ngày 50 mg, 100 mg Phức hợp AMB với cholesteryl sulfate Phức hợp lipid 50 B t đông khô 3 -4 mg/kg/ ngày 50 mg HSPC:DSPG: Chol:AMB (tỷ lệ mol... lipid chứa AMB thô, pha loãng mẫu như mô tả ở mục 2.3.4.3 Tiến hành đo quang, thu được độ hấp thụ quang A1 20 Định lượng AMB có trong phức hợp lipid chứa AMB: để đánh giá được lượng AMB có trong hệ thống phức hợp lipid chứa AMB cần phải loại b phần AMB tự do Tiến hành so sánh hai phương pháp loại b AMB tự do: - Phương pháp thẩm tích: hút chính xác khoảng 1 ml hỗn dịch phức hợp lipid chứa AMB thô vào... tử dạng đĩa có 6 chứa AMB, cholesterol sunlfat Abelcet (nghiên cứu và sản xuất b i The Liposome Company Ltd) bao gồm AMB liên kết với hai phospholipid tổng hợp trong một phức hợp có cấu trúc dạng chuỗi có thể dài tới 5 µm [6] [12] Hình 1.1 Hình dạng cấu trúc ba chế phẩm với lipid của AMB hiện có trên thị trường Ba công thức này đều giúp cải thiện được hệ số điều trị của AMB so với dạng thuốc quy ước... thường [18] Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào về phức hợp lipid chứa AMB đã công b 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: phức hợp lipid chứa AMB Nguyên liệu: B ng 2.1 Nguyên liệu STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn 1 Amphotericin B Trung Quốc USP 2 Hydrogenated soy phosphatidylcholine Lipoid . hợp lipid chứa Amphotericin B 1.2.1. Khái quát về phức hợp lipid chứa Amphotericin B Ngày nay, nhiều công thức b o chế sử dụng lipid làm chất mang AMB để giảm độc tính của AMB đã được nghiên. tác giữa AMB và lipid trong phức hợp lipid chứa AMB như sau: 8 Hình 1.2. Cấu trúc giả định của phức hợp lipid chứa AMB. Sự sắp xếp giữa lipid và AMB này phù hợp với nhiều nghiên cứu. trên lipid của AMB như Ambisome, Abelcet [4]. Giảm độc tính của thuốc: trong phức hợp lipid của AMB, phân tử AMB sẽ liên kết chặt chẽ với các phân tử lipid trong phức hợp, do đó không còn AMB