2.3.4.1. Quét phổ cực đại hấp thụ của AMB trong methanol và ảnh hưởng của tá dược lipid đến phương pháp đo quang phổ UV - VIS
- Pha dung dịch chuẩn AMB trong methanol có nồng độ 4,6 µg/ml. (dd1)
- Chuẩn bị một mẫu thử hỗn dịch phức hợp lipid chứa AMB: bào chế 1 mẫu phức hợp có tỷ lệ % mol AMB/tổng số mol lipid là 25 mol % (HSPC: DSPG tỷ lệ mol là 7:3). Lấy chính xác 0,5 ml hỗn dịch hòa tan bằng methanol trong bình định mức 25 ml, bổ sung methanol đến vạch. Pha loãng với methanol tới hệ số pha loãng thích hợp để thu được dung dịch có nồng độ AMB là 4,6 µg/ml. (dd2)
- Pha dung dịch 2 tá dược lipid trong methanol có nồng độ tương đương với nồng độ của chúng trong mẫu thử trên. (dd3)
- Tiến hành quét phổ UV – VIS của (dd1) và (dd2) trên trong khoảng bước sóng 200 – 500 nm với mẫu trắng là methanol để xác định cực đại hấp thụ của AMB trong methanol. Đồng thời quét phổ của (dd3) để xác định ảnh hưởng của tá dược lipid tới phương pháp đo quang phổ UV – VIS.
2.3.4.2. Xây dựng đường chuẩn tuyến tính giữa nồng độ AMB và độ hấp thụ quang
- Cân một lượng chính xác AMB, pha trong methanol tạo dung dịch chuẩn gốc nồng độ 50 µg/ml.
- Từ dung dịch chuẩn gốc pha một dãy chuẩn với các nồng độ Ci khác nhau thích hợp. Tiến hành đo độ hấp thụ Ai của dãy chuẩn tại bước sóng 405 nm, và lập đồ thị của Atheo C.
- Lập đồ thì biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ của AMB và độ hấp thu quang A dựa vào các giá trị thu được.
2.3.4.3. Xác định hàm lượng AMB trong hỗn dịch lipid chứa AMB bằng phương pháp đo quang
Điều kiện tiến hành đo quang: - Bước sóng đo quang: 405 nm
- Mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 0,0100 g AMB hòa tan bằng methanol trong bình định mức 50 ml, bổ sung thể tích bằng methanol đến vạch. Tiến hành pha loãng dung dịch trên với methanol tới hệ số pha loãng cuối cùng k1 = 2500.
- Mẫu thử: hút chính xác 0,50 ml hỗn dịch phức hợp lipid chứa AMB, hòa tan bằng methanol trong bình định mức 25 ml, bổ sung thể tích bằng methanol đến vạch. Tiến hành pha loãng với methanol tới hệ số pha loãng cuối cùng bằng hệ số pha loãng của mẫu thử k2 = 2500.
- Hàm lượng AMB trong hỗn dịch phức hợp lipid chứa AMB được xác định theo công thức:
Ct = 𝐴𝑡
𝐴𝑜× 𝑚𝑐
Trong đó:
Ao: độ hấp thụ quang của mẫu chuẩn. At: độ hấp thụ quang của mẫu thử. mc: khối lượng cân của mẫu chuẩn (mg).
2.3.4.4. Phương pháp xác định hiệu suất tạo phức hợp lipid chứa AMB
Định lượng AMB toàn phần: nồng độ AMB trong hỗn dịch phức hợp phức hợp lipid chứa AMB thô.
Hút chính xác 0,5 ml hỗn dịch phức hợp lipid chứa AMB thô, pha loãng mẫu như mô tả ở mục 2.3.4.3. Tiến hành đo quang, thu được độ hấp thụ quang A1.
Định lượng AMB có trong phức hợp lipid chứa AMB: để đánh giá được lượng AMB có trong hệ thống phức hợp lipid chứa AMB cần phải loại bỏ phần AMB tự do.
Tiến hành so sánh hai phương pháp loại bỏ AMB tự do:
- Phương pháp thẩm tích: hút chính xác khoảng 1 ml hỗn dịch phức hợp lipid chứa AMB thô vào túi thẩm tích. Buộc kín hai đầu túi, đặt nhúng chìm túi vào bình chứa 100 ml dung dịch 10% DMSO trong nước. Khuấy từ trong 6h, duy trì nhiệt độ 2 – 8oC. Sau 6h lấy túi thẩm tích ra, hút chính xác 0,50 ml hỗn dịch sau thẩm tích đem hòa tan, pha loãng bằng methanol và tiến hành đo quang như mô tả ở mục 2.3.4.3. Thu được độ hấp thụ quang ATT.
- Phương pháp lọc tiếp tuyến: AMB tự do được tiến hành loại bỏ qua hệ thống lọc tiếp tuyến MicroKros® Filter Modules, màng polysulfone, kích thước lỗ 50kD, diện tích lọc 28cm2 (Spectrumlab, Mỹ).
Hình 2.1. Cơ chế của phương pháp lọc tiếp tuyến áp dụng loại bỏ AMB tự do, DMSO tồn dư
1. Dòng chảy của hỗn dịch phức hợp lipid chứa AMB (10 ml)
2. Dòng chảy của sản phẩm sau LTT.
3. Dòng chảy của dịch thải sau LTT 4. Dòng chảy của dịch rửa là pha
nước đệm phosphat 7,4 (100 ml)
Hình 2.3. Sơ đồ lọc tiếp tuyến hỗn dịch lipid chứa AMB
Hút chính xác 0,50 ml hỗn dịch sau khi lọc tiếp tuyến hòa tan, pha loãng bằng methanol và tiến hành đo quang như mô tả ở mục 2.3.4.1.3. Thu được độ hấp thụ quang ALTT.
Hiệu suất bắt giữ AMB trong phức hợp lipid chứa AMB được xác định bằng công thức:
HTT % = 𝐴𝑇𝑇
𝐴1 × 100% và HLTT % = 𝐴𝐿𝑇𝑇
𝐴1 × 100%
2.3.4.3. Tính ổn định của phức hợp AMB – lipid
Đánh giá KTTP, phân bố KTTP, hiệu suất bắt giữ dược chất trong phức hợp lipid sau khi bảo quản ở 2 – 8o-C sau 3 tuần.