Dịch chiết sau khi cô đặc dƣới áp suất giảm ở 80oC đến tỷ trọng 1,1 g/ml thì tiến hành phun sấy để đƣợc cao khô.
Các điều kiện phun sấy nhƣ sau:
Thiết bị: Hệ thống phun sấy LPG-5 Centrifugal Spray Dryer (Changzhou Jinqiao, Trung Quốc), công suất max 5 L/giờ.
Nhiệt độ gió vào: 180°C. Nhiệt độ gió ra: 85 - 90°C.
Tốc độ phun dịch: 4 lít/giờ. 2.3.5. Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Điều kiện sắn ký lớp mỏng.
Bản mỏng: Silicagel 60F254, hoạt hoá ở 110 oC trong 1 giờ. Dung môi khai triển:
Hệ 1: Cloroform-methanol-nƣớc (7:2,5:0,25). Hệ 2: Cloroform-methanol (7:3).
Dung dịch thử:
- Mẫu thử là dịch chiết: Lấy một thể tích dịch chiết tƣơng đƣơng với 1 mg isoflavonoid toàn phần, cô cách thủy đến cắn. Hoà cắn trong 1 ml ethanol. - Mẫu thử là chất chưa biết: Hòa tan trong EtOH 96% để đƣợc dung dịch
có nồng độ khoảng 1 mg/ml.
Dung dịch đối chiếu: Hòa tan chất đối chiếu trong methanol để có nồng độ puerarin khoảng 1 mg/ml.
Sau khi khai triển sắc ký, lấy bản mỏng ra, để bay hơi dung môi ở nhiệt độ phòng, soi bản mỏng dƣới đèn tử ngoại ở bƣớc sóng 254 nm [2].
2.3.6.Phương pháp xác định khối lượng cắn trong dịch chiết
Lấy chính xác 100 ml dịch chiết, cất quay 95oC đến thể chất cao mềm, cân xác định khối lƣợng cao đƣợc a g. Lấy một phần cao để xác định mất khối lƣợng do làm khô đƣợc kết quả h%, từ đó tính ra khối lƣợng cắn chiết đƣợc theo công thức:
Trong đó:
W: là khối lƣợng cắn chiết đƣợc (g).
a: là khối lƣợng cao mềm tƣơng ứng với 100 ml dịch chiết (g). h: mất khối lƣợng do làm khô của cao mềm (%).
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3. 1. Xác định hàm lƣợng isoflavonoid toàn phần trong nguyên liệu
3.1.1. Xây dựng đường chuẩn
Tiến hành quét phổ UV-VIS dung dịch puerarin nồng độ 8 µg/ml trong vùng bƣớc sóng 200 đến 400 nm, thu đƣợc phổ hấp thụ nhƣ hình 3.1.
Hình 3. 1: Phổ UV-VIS của chất đối chiếu
Nhận xét: Hình dạng phổ phù hợp với kết quả đã đƣợc công bố [11]. Hình ảnh phổ cho thấy có 2 cực đại hấp thụ tại bƣớc sóng 250 nm và 307 nm. Từ kết quả trên và tham khảo các tài liệu [7], [ 8], [ 14], [ 15], [ 17], [ 18] chọn bƣớc sóng 250 nm làm bƣớc sóng để đo quang trong các phép định lƣợng isoflavonoid toàn phần sau này.
Xây dựng đƣờng chuẩn chất đối chiếu Tiến hành:
- Pha dãy dung dịch chuẩn: Cân chính xác 12,1 mg puerarin 82,31% (tƣơng đƣơng 10,0 mg puerarin) vào bình định mức 50 ml, thêm ethanol 96%, lắc tan, thêm ethanol đến vạch, lắc đều đƣợc dung dịch A. lấy chính xác 20,0 ml dung dịch A vào bình định mức 100 ml, thêm ethanol
96% đến vạch, lắc đều đƣợc dung dịch B. Lần lƣợt lấy vào 5 bình định mức 50 ml 2,0; 4,0; 6,0; 8,0; 10,0 ml dung dịch B, và thêm vào đó lần lƣợt 8,0; 6,0; 4,0; 2.0; 0,0 ml ethanol 96%. Sau đó, thêm nƣớc cất đến vạch, lắc đều. Đƣợc dãy dung dịch chuẩn có nồng độ lần lƣợt là 1,6; 3,2; 4,8; 6,4; 8 µg/ml.
- Mẫu trắng: Lấy 10,0 ml ethanol 96% vào bình định mức 50 ml, thêm nƣớc vừa đủ, lắc đều.
- Các mẫu sau khi pha đƣợc lọc qua màng lọc 0.45µm, đo độ hấp thụ tại bƣớc sóng 250 nm, đo lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình để xây dựng đƣờng chuẩn.
Kết quả thu đƣợc nhƣ bảng 3.1:
Bảng 3.1: Mật độ quang của dãy dung dịch chất đối chiếu tại bƣớc sóng 250 nm. Nồng độ puerarin (µg/ml) 1,6 3,2 4,8 6,4 8,0 Độ hấp thụ 0,133 0,289 0,427 0,566 0,715 0,133 0,289 0,427 0,566 0,715 y = 0,0901x - 0,0063 R² = 0,9996 0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 2 4 6 8 10 m ật độ qua ng nồng độ(mg/l)
Theo kết quả thực nghiệm cho thấy, ở bƣớc sóng 250 nm mật độ quang và nồng độ dung dịch puerarin có sự phụ thuộc tuyến tính trong khoảng nồng độ 1,6-8 µg/ml với hệ số tƣơng quan R2=0,9996.
3.1.2. Định lượng isoflavonoid toàn phần trong sắn dây tươi
Sử dụng phƣơng pháp đo quang, tiến hành với 3 mẫu theo mục 2.3.1 kết quả thu đƣợc nhƣ bảng 3.2.
Bảng 3.2: Kết quả định lƣợng isoflavonoid toàn phần trong sắn dây tƣơi.
Mẫu Khối lƣợng mẫu thử (g) Mật độ quang của mẫu thử Mật độ quang của mẫu đối chiếu Hàm lƣợng isoflavonoid toàn phần (%) 1 10,1220 0,534 0,371 0,569 2 10,0652 0,566 0,371 0,606 3 10,1549 0,537 0,371 0,570 Trung bình - - - 0,582 ± 0,021 Nhận xét:
- Hàm lƣợng isoflavonoid toàn phần trong sắn dây là 0,582 ± 0,021%.
- So với hàm lƣợng isoflavon trong đậu nành (0,1-0,3%) [12] thì hàm lƣợng isoflavonoid trong sắn dây cao hơn. Do đó có thể thấy sắn dây là nguồn nguyên liệu isoflavonoid có nhiều tiềm năng.
3. 2. Chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây tƣơi
Rễ củ sắn dây tƣơi chứa hàm lƣợng lớn tinh bột (12-15%) [3] nên đƣợc sử dụng chủ yếu làm nguyên liệu chế tinh bột sắn dây. Tinh bột sắn dây là một sản phẩm có giá trị kinh tế cao từ sắn dây, để tận dụng thu sản phẩm này, chúng tôi kết hợp quá trình chiết xuất với quá trình làm tinh bột sắn dây. Tiến hành theo sơ đồ hình 3.3.
Hình 3.3: Sơ đồ phƣơng pháp chiết xuất isoflavonoid trong sắn dây tƣơi Mô tả các bƣớc tiến hành:
Chuẩn bị nguyên liệu: Sắn dây tƣơi mua về đƣợc xử lý trong vòng 3 ngày, củ đƣợc rửa sạch đất và vỏ đen bên ngoài, cắt bỏ những phần bị hỏng. Để
Dịch gạn sau để lắng
Tinh bột Để lắng qua đêm
- Vắt loại bã xơ.
- Sấy ở 60oC đến khô
Bã khô
Củ tƣơi
Củ tƣơi sau rửa
Dịch sau vắt Bột nhão Bã ƣớt
- Rửa sạch đất, vỏ đen bên ngoài - Để ráo nƣớc
Xay nhỏ
- Hòa vào nƣớc - Vắt loại bã xơ
ráo nƣớc và cân xác định khối lƣợng. Sau đó xay mịn thành bột nhão, trƣớc đó có thể thái thành lát để xay dễ dàng hơn.
Tiến hành chiết xuất: Bột nhão đƣợc hòa vào nƣớc với tỷ lệ bột nhão: nƣớc là 1:2 (w/w) rồi vắt loại bã bằng túi vải. Bã sắn đƣợc rửa lại một lần với lƣợng nƣớc nhƣ lần một. Gộp dịch chiết lại, để lắng qua đêm, gạn lấy phần dịch trong; đây là dịch chiết chứa isoflavonoid.
Phần tinh bột lắng xuống đƣợc rửa bằng cách thêm nƣớc, khuấy đều rồi lại để lắng; rửa đến khi trắng (3-5 lần) thì thu đƣợc tinh bột sắn dây.
Định lƣợng isoflavonoid toàn phần trong dịch chiết theo mục 2.3.1 và xác định cắn chiết đƣợc theo mục 2.3.6. Thực hiện 3 mẫu, kết quả nhƣ bảng 3.3.
Bảng 3.3: Hiệu suất và hàm lƣợng isoflavonoid toàn phần trong dịch chiết
Mẫu 1 2 3 Trung bình Khối lƣợng dƣợc liệu (kg) 2,35 2,15 5,3 - Khối lƣợng tinh bột (kg) 0,55 0,46 1,25 - Thể tích dịch chiết (l) 7,9 7 18 - Nồng độ isoflavonoid trong dịch chiết (mg/ml) 1,66 1,72 1,65 - Khối lƣợng cắn chiết (g) 140,88 135,12 324,69 - Hàm lƣợng isoflavonoid trong cắn (%) 9,32 8,92 9,10 9,12 ± 0,20
Hiệu suất chiết (tính theo hàm lƣợng isoflavonoid) (%)
Nhận xét:
- Hàm lƣợng tinh bột thu đƣợc trung bình là 22,8% cao gần gấp đôi so với công bố trong các tài liệu tham khảo [2], [ 3].
- Hiệu suất chiết trung bình đạt 96,18%. Mặc dù chỉ chiết 2 lần nhƣng hiệu suất tƣơng đối cao, lƣợng isoflavonoid còn lại trong bã là không đáng kể (< 4%).
3. 3. Tinh chế dịch chiết
Hàm lƣợng isoflavonoid toàn phần trong cắn chiết trung bình đạt 9,12%. Hàm lƣợng này chƣa đạt yêu cầu mục tiêu đề ra (>10%). Do vậy, cao thô cần đƣợc tinh chế để tăng hàm lƣợng hoạt chất.
Tiến hành tinh chế dịch chiết nhƣ sau:
Từ dịch gạn của mẫu 3 mục 3.2. Lấy 3 mẫu, mỗi mẫu 500 ml. Tiến hành tinh chế theo 3 phƣơng pháp sau:
Phƣơng pháp 1 (kết tủa tạp chất bằng nhiệt): Lấy 500 ml dịch chiết vào cốc 1000 ml, đun cách thủy 30 phút, để nguội qua đêm. Lọc tủa, rửa tủa 3 lần, mỗi lần 50 ml nƣớc.
Phƣơng pháp 2 (kết tủa tạp chất bằng ethanol): Cô giảm áp đến thể cao mềm, thêm 500 ml ethanol 96%, để qua đêm. Lọc tủa, rửa tủa 3 lần, mỗi lần 50 ml ethanol 96%.
Phƣơng pháp 3 (kết hợp phƣơng pháp 1 và 2): Đun cách thủy 30 phút, để qua đêm, lọc tủa, rửa tủa 3 lần, mỗi lần 50 ml nƣớc. Dịch lọc và dịch rửa đƣợc gộp lại, cô giảm áp đến thể cao mềm, thêm 500 ml ethanol 96%, để qua đêm. Lọc tủa, rửa tủa 3 lần, mỗi lần 50 ml ethanol 96%.
Dịch chiết sau tinh chế đƣợc cô dƣới áp suất giảm, ở 80oC đến thể chất cao đặc. Xác định khối lƣợng cao, mất khối lƣợng do làm khô và hàm lƣợng isoflavonoid toàn phần có cao thu đƣợc. Kết quả thể hiện trong bảng 3.4:
Bảng 3. 4: Hiệu suất và hàm lƣợng cao đặc (thu đƣợc từ 500 ml dịch chiết, tƣơng ứng khoảng 150 g dƣợc liệu) Phƣơng pháp tinh chế 1 2 3 Khối lƣợng cao đặc (g) 7,97 7,35 6,09 Mất khối lƣợng do làm khô 18,24 14,55 14,1 Hàm lƣợng isoflavonoid trong cao đặc (%) 9,19 10,61 11,5
Hiệu suất giai đoạn tinh chế tính
theo hàm lƣợng isoflavonoid (%) 86,67 92,30 82,88
Nhận xét:
Hàm lƣợng isoflavonoid trong cao đặc tinh chế của phƣơng pháp 2 (10,61%) cao hơn phƣơng pháp 1 (9,19%); phƣơng pháp 3 (kết hợp phƣơng pháp 1 và 2) cho hàm lƣợng cao nhất (11,5).
Hiệu suất tinh chế cao nhất là phƣơng pháp 2 (sử dụng ethanol), thấp nhất là phƣơng pháp 3 (2 giai đoạn).
Tinh chế bằng phƣơng pháp 1 (kết tủa tạp chất bằng nhiệt) có hàm lƣợng isoflavonoid toàn phần trong cao đặc tinh chế là 9,19%, tƣơng đƣơng với 11,23% nếu tính theo cao tinh chế đã làm khô. Sử dụng phƣơng pháp 1 là thích hợp, vừa đảm bảo hàm lƣợng hoạt chất, vừa đảm bảo hiệu suất tinh chế đồng thời cũng đơn giản và kinh tế.
Với mục đích sử dụng cao khô để bào chế viên nén, chúng tôi tiến hành điều chế cao khô bằng phƣơng pháp phun sấy, thí nghiệm đƣợc tiến hành tại công ty cổ phần hóa dƣợc phẩm Việt Nam (khu công nghiệp Tiên Sơn, Bắc Ninh).
Quá trình điều chế cao khô gồm 2 giai đoạn nhƣ sau:
Giai đoạn 1: Thực hiện tại bộ môn Công Nghiệp Dƣợc đại học Dƣợc Hà Nội. Sắn dây tƣơi đƣợc rửa sạch đất và vỏ đen bên ngoài, cắt bỏ những phần bị hỏng. Để ráo nƣớc và cân xác định khối lƣợng đƣợc 11 kg. Sau đó xay mịn thành bột nhão, bột nhão đƣợc hòa vào 22 l nƣớc, rồi vắt loại bã bằng túi vải. Bã sắn đƣợc rửa lại một lần với 22 l nƣớc. Gộp dịch chiết lại, để lắng qua đêm, gạn lấy phần dịch trong; thu đƣợc 42 l dịch chiết. dịch chiết đƣợc tinh chế bằng đun nóng ở 90oC trong 30 phút, để nguội qua đêm, gạn lấy dịch trong phía trên. Phần dịch lẫn tủa đƣợc lọc hút qua giấy lọc bằng hệ thống lọc buchner. Tủa đƣợc rửa 3 lần, mỗi lần 2 l nƣớc. Dịch chiết sau tinh chế có thể tích là 46 l.
Tiến hành xác định nồng độ isoflavonoid trong dịch tinh chế theo mục 2.3.1. và xác định khối lƣợng cắn theo mục 2.3.6.
Giai đoạn 2: Thực hiện tại công ty cổ phần hóa dƣợc phẩm Việt Nam (khu công nghiệp Tiên Sơn, Bắc Ninh).
Dịch chiết sau khi tinh chế đƣợc cô đặc bằng hệ thống cô tuần hoàn đến tỷ trọng 1,1 g/ml. Dịch chiết sau khi cô đặc đem lọc qua giấy lọc rồi tiến hành phun sấy. Các điều kiện phun sấy nhƣ trình bày ở mục 2.3.4.
Hình 3.4: Hệ thống cô tuần hoàn (bên trái), máy phun sấy (bên phải)
Bảng 3.5: Số liệu của quá trình điều chế cao
Khối lƣợng sắn dây tƣơi (kg) 11
Thể tích dịch chiết (l) 42
Thể tích dịch tinh chế (l) 46
Nồng độ isoflavonoid trong dịch tinh chế (mg/ml) 1,24 Tỷ lệ cắn khô của dịch tinh chế (mg/ml) 11 Hàm lƣợng isoflavonoid trong cắn tinh chế (%) 11,27 Khối lƣợng cao phun sấy thu đƣợc (g) 450
Hình 3.5: Bột cao sắn dây phun sấy
Một số chỉ tiêu chất lƣợng của sản phẩm cao khô thể hiện trong bảng 3.6
Bảng 3.6: Một số chỉ tiêu chất lƣợng của sản phẩm
Hình thức cảm quan Dạng bột, thể chất tơi xốp, đồng nhất, có màu vàng kem, mùi thơm, vị đắng và hơi ngọt. Khối lƣợng riêng biểu kiến
(g/cm3) 0,52
Kích thƣớc tiểu phân 100% bột qua rây 250 µm Mất khối lƣợng do làm khô
(5g, 105oC, 2 giờ) (%) 2,7
Hàm lƣợng isoflavonoid toàn
phần trong cao (%) 10,78
Nhận xét:
Quá trình cô và phun sấy có hiệu suất 85,04% tính theo isoflavonoid. Hàm lƣợng isoflavonoid trong cắn dịch tinh chế là 11,27%, hàm lƣợng isoflavonoid
trong cao phun sấy là 10,78% tƣơng đƣơng với 11,08% nếu tính theo cao phun sấy đã làm khô. Có thể thấy hàm lƣợng isoflavonoid trong cao phun sấy thấp hơn không đáng kể so với trong cắn dịch tinh chế, do đó có thể thấy quá trình cô đặc và phun sấy rất ít làm phân hủy hoạt chất.
3.5. Phân lập puerarin
Với mục đích phân lập puerarin làm chất đối chiếu, chúng tôi xây dựng phƣơng pháp phân lập puerarin từ sắn dây.
Tiến hành:
10 l dịch chiết củ tƣơi ở mẫu 3 (mục 3.2. Chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây tƣơi) đƣợc tinh chế theo phƣơng pháp 3 (mục 2.3.3). Sau đó cô đặc đến thể tích khoảng 600 ml. Tiến hành theo các bƣớc nhƣ sau:
Bƣớc 1: Chiết xuất isoflavonoid bằng ethyl acetat:
Lấy 150 ml dịch cô đặc ở trên vào bình gạn 500 ml, lắc 3 lần với ethyl acetat, mỗi lần 150 ml, lắc trong 15 phút, gạn lấy pha ethyl acetat ở lớp trên. Sau khi chiết hết 600 ml dịch cô đặc sang ethyl acetat, các phần ethyl acetat đƣợc gom lại, cô giảm áp ở 50oC đến 200 ml.
Bƣớc 2: Chiết isoflavonoid từ ethyl acetat sang pha nƣớc.
Chuyển 200 ml dịch chiết ethyl acetat cô đặc vào bình gạn 500 ml, lắc 3 lần với nƣớc, mỗi lần 150 ml, lắc trong 15 phút, gạn lấy pha nƣớc ở lớp dƣới.
Bƣớc 3: Thu tủa A.
Dịch chiết nƣớc sau khi gạn đƣợc gom lại, cô giảm áp ở 70oC đến khi bắt đầu xuất hiện tủa trắng thì dừng lại, để qua đêm ở điều kiện phòng, lọc tủa, (tủa A). Tủa A đƣợc kết tinh lại trong ethanol 50%.
Dịch lọc sau khi lọc tủa A đƣợc làm lạnh trong tủ lạnh qua đêm, thu đƣợc tủa B. Tủa B đƣợc kết tinh lại trong nƣớc.
Sau khi thu đƣợc các sản phẩm ta tiến hành khai triển sắc ký lớp mỏng với các mẫu thử: dịch chiết sắn dây, tủa A, tủa B theo mục 2.3.5 thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Hình 3.6: Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dƣới đèn tử ngoại 250 nm Chú thích:
Hình 1 khai triển với hệ pha động 1: Cloroform - methanol - nƣớc (7:2,5 0,25). Hình 2 và 3 khai triển với hệ pha động 2: Cloroform – methanol (7: 3).
Trong đó:
A: là tủa A.
B: là tủa B.
C: chất đối chiếu puerarin. T: dịch chiết.
Nhận xét:
- Từ kết quả sắc ký lớp mỏng có thể sơ bộ kết luận tủa B là puerarin.
- Từ 10 l dịch chiết (tƣơng đƣơng với khoảng 2,94 kg sắn tƣơi) phân lập và tinh chế thu đƣợc 3,21 g puerarin.
- Một số phƣơng pháp phân lập puerarin đã đƣợc nghiên cứu và công bố nhƣ: Phân lập puerarin sử dụng sắc ký phân bố ngƣợc dòng (HSCCC) [5], phân lập bằng sắc ký cột với pha tĩnh là β-cyclodextrin và polystyren [16], …
- Phƣơng pháp phân lập puerarin mà chúng tôi xây dựng là một phƣơng pháp mới, đơn giản, không cần sử dụng sắc ký cột, cần đƣợc tiếp tục nghiên cứu để tiến tới áp dụng vào thực tế.
O OH HO O OH HO HO OH 2 3 4 5 6 7 8 9 10 4' 6'' 1' 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' Hình 3.7: Cấu trúc puerarin
Xác một số hằng số vật lý của puerarin thu đƣợc:
Hình thức: bột trắng, hơi vàng. Nhiệt độ nóng chảy: 210oC.
Rf = 0,388 với pha động là Cloroform - methanol - nƣớc (7:2,5:0,25). Rf = 0,589 với pha động là Cloroform – methanol (7:3).
IR (KBr), υmax (cm-1): 3341 (OH); 1635 (C=O); 1513 (C=C thơm). ESI-MS (m/z): 415,08 [M-H]-. 1 H NMR (500 MHz, D2O) (ppm): 3,51 (1H, d); 3,54-3,57 (2H, dd); 3,77-3,80 (1H, dd, H-6”); 3,89-3,93 (1H, dd, H-6”); 4,14 (1H, s, br); 5,11 (1H, d, H-1”); 6,84 (2H, d, H-3’, H-5’); 6,97 (1H, d,