Tiến hành quét phổ UV-VIS dung dịch puerarin nồng độ 8 µg/ml trong vùng bƣớc sóng 200 đến 400 nm, thu đƣợc phổ hấp thụ nhƣ hình 3.1.
Hình 3. 1: Phổ UV-VIS của chất đối chiếu
Nhận xét: Hình dạng phổ phù hợp với kết quả đã đƣợc công bố [11]. Hình ảnh phổ cho thấy có 2 cực đại hấp thụ tại bƣớc sóng 250 nm và 307 nm. Từ kết quả trên và tham khảo các tài liệu [7], [ 8], [ 14], [ 15], [ 17], [ 18] chọn bƣớc sóng 250 nm làm bƣớc sóng để đo quang trong các phép định lƣợng isoflavonoid toàn phần sau này.
Xây dựng đƣờng chuẩn chất đối chiếu Tiến hành:
- Pha dãy dung dịch chuẩn: Cân chính xác 12,1 mg puerarin 82,31% (tƣơng đƣơng 10,0 mg puerarin) vào bình định mức 50 ml, thêm ethanol 96%, lắc tan, thêm ethanol đến vạch, lắc đều đƣợc dung dịch A. lấy chính xác 20,0 ml dung dịch A vào bình định mức 100 ml, thêm ethanol
96% đến vạch, lắc đều đƣợc dung dịch B. Lần lƣợt lấy vào 5 bình định mức 50 ml 2,0; 4,0; 6,0; 8,0; 10,0 ml dung dịch B, và thêm vào đó lần lƣợt 8,0; 6,0; 4,0; 2.0; 0,0 ml ethanol 96%. Sau đó, thêm nƣớc cất đến vạch, lắc đều. Đƣợc dãy dung dịch chuẩn có nồng độ lần lƣợt là 1,6; 3,2; 4,8; 6,4; 8 µg/ml.
- Mẫu trắng: Lấy 10,0 ml ethanol 96% vào bình định mức 50 ml, thêm nƣớc vừa đủ, lắc đều.
- Các mẫu sau khi pha đƣợc lọc qua màng lọc 0.45µm, đo độ hấp thụ tại bƣớc sóng 250 nm, đo lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình để xây dựng đƣờng chuẩn.
Kết quả thu đƣợc nhƣ bảng 3.1:
Bảng 3.1: Mật độ quang của dãy dung dịch chất đối chiếu tại bƣớc sóng 250 nm. Nồng độ puerarin (µg/ml) 1,6 3,2 4,8 6,4 8,0 Độ hấp thụ 0,133 0,289 0,427 0,566 0,715 0,133 0,289 0,427 0,566 0,715 y = 0,0901x - 0,0063 R² = 0,9996 0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 2 4 6 8 10 m ật độ qua ng nồng độ(mg/l)
Theo kết quả thực nghiệm cho thấy, ở bƣớc sóng 250 nm mật độ quang và nồng độ dung dịch puerarin có sự phụ thuộc tuyến tính trong khoảng nồng độ 1,6-8 µg/ml với hệ số tƣơng quan R2=0,9996.