trình bào chế
Bảng 3.7. So sánh các giai đoạn trong quy trình bào chế liposome doxorubicin bằng các phương pháp khác nhau.
Quy trình bào chế liposome dox
Phương pháp pha loãng ethanol
Phương pháp tiến hành trong các nghiên cứu trước
Giai đoạn
Tạo liposome theo quy trình 2.2.1.
Tạo liposome bằng - Hydrat hóa màng film - Bốc hơi pha đảo
Giảm KTTP và đồng nhất hóa bằng siêu âm hoặc nén qua màng polycacbonat có kích thước phù hợp.
Nạp dược chất thông qua tạo chênh lệch pH.
Nạp dược chất thông qua tạo chênh lệch pH.
- Như vậy khi so sánh với các phương pháp bào chế trước đó ta nhận thấy phương pháp pha loãng ethanol không trải qua quá trình làm giảm kích thước tiểu phân nhưng hệ mang thuốc tạo ra vẫn có kích thước nhỏ, đồng nhất, hàm lượng DOX toàn phần và hiệu suất liposome hóa thu được cao (theo kết quả thu được khi đánh giá ảnh hưởng tỷ lệ dung môi, nhiệt độ tới KTTP, chỉ số đa phân tán và hiệu suất liposome hóa).
Tuy nhiên để đánh giá sự cần thiết của quá trình làm giảm KTTP đến quy trình bào chế liposome DOX bằng phương pháp pha loãng ethanol, tiến hành bố trí thí nghiệm như sau:
+ công thức M761 bào chế bằng phương pháp pha loãng ethanol, lọc tiếp tuyến để cô đặc giảm thể tích, không sử dụng các biện pháp làm giảm KTTP, đổi đệm, nạp dược chất, xác định hàm lượng DOX toàn phần và hiệu suất liposome hóa.
+ công thức M762 bào chế bằng phương pháp pha loãng ethanol, lọc tiếp tuyến giảm thể tích, đùn qua màng 200 nm, 100 nm bằng thiết bị extrusion làm giảm KTTP, đổi đệm, nạp dược chất, xác định hàm lượng DOX toàn phần, hiệu suất liposome hóa.
Kết quả - Hình thức:
+ Hệ liposome thu được sau bào chế các mẫu đều thu được hỗn dịch đồng nhất màu trắng đục.
+ Hệ liposome DOX hỗn dịch đục mờ màu đỏ cam, khi để lâu có thể xuất hiện hiện tượng lắng cặn nhưng dễ dàng phân tán đều trở lại khi lắc nhẹ.
- Kết quả KTTP, phân bố KTTP liposome và hiệu suất liposome hóa được trình bày trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của quá trình làm giảm KTTP đến KTTP và hiệu suất liposome hóa.
Công thức
Giai đoạn bào chế liposome chưa mang dược chất
Giai đoạn sau nạp dược chất Sau lọc tiếp tuyến Sau nén qua màng polycacbonat PDI Zaverage (d.nm) PDI Zaverage (d.nm) PDI Zaverage (d.nm) Hàm lượng toàn phần (mg/ml) EE (%) M761 0,183 149,9 - - 0,213 175,1 2,04±0,06 90,52±1,00 M762 0,188 165,9 0,116 142,1 0,205 168,0 2,01±0,04 90,51±1,54 - Nhận xét:
+ Với liposome chưa nạp dược chất, mẫu 2 cho hệ có kích thước nhỏ sau quá trình làm giảm KTTP bằng nén qua màng (Zaverage < 150 nm), hệ đồng nhất với chỉ số đa phân tán PDI nhỏ ( < 0,12). Khi so sánh với mẫu 1 ta nhận thấy: hai hệ đều cho kích thước tương đương nhau, sự khác biệt chỉ thực sự quan sát thấy rõ ở giá trị PDI của hệ. Chứng tỏ mẫu M762 đồng nhất hơn mẫu M761. Có thể dự đoán rằng quá trình làm giảm kích thước tiểu phân chỉ thực sự có ý nghĩa trong việc làm tăng độ đồng nhất của hệ.
+ Hệ liposome DOX thu được sau nạp dược chất không có sự khác biệt nhiều giữa hai mẫu. Cả hai mẫu đều cho kết quả về cảm quan, các số liệu KTTP, PDI, hàm lượng DOX toàn phần và hiệu suất liposome hóa tương đương KTTP < 200 nm, PDI~0,2, hiệu suất liposome hóa > 90%. Như vậy không có sự khác biệt đáng kể ở các liposome DOX có và không trải qua quá trình làm giảm KTTP bằng nén qua màng. Do đó liposome bào chế bằng phương pháp pha loãng ethanol có thể không cần thiết phải trải qua quá trình làm giảm KTTP bằng nén qua màng.
Do vậy lựa chọn quy trình bào chế liposome DOX không trải qua giai đoạn nén qua màng để làm giảm KTTP.
3.2.4. Đề xuất quy trình bào chế và đánh giá một số chỉ tiêu của liposome doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol
3.2.4.1. Quy trình bào chế
Từ quá trình thực nghiệm nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng kết hợp tài liệu tham khảo đề xuất quy trình cụ thể bào chế liposome DOX 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol.
Công thức bào chế
Hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC) 100 mg
Cholesterol 30 mg
Ethanol 7ml
Đệm citrat pH 4 100 ml
Đệm HEPES pH 7,4 vừa đủ
Hình 3.7. Sơ đồ quy trình bào chế liposome doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol
3.2.4.2. Đánh giá một số chỉ tiêu của liposome tạo ra
- Hình thức: liposome DOX thu được sau bào chế bằng phương pháp pha loãng ethanol là hỗn dịch đục mờ màu đỏ cam. Để trong thời gian lâu có xuất hiện lắng cặn tuy nhiên khi lắc nhẹ, hệ dễ dàng phân tán đều trở lại.
- KTTP, phân bố KTTP liposome và liposome DOX, hiệu suất liposome hóa cho bởi bảng 3.9.
Hòa tan HSPC: CHL (tỷ lệ kl 100: 30) trong
7ml ethanol/50oC. Bơm nhanh kết hợp
khuấy trộn tốc độ cao
100ml đệm citrat pH4
Lọc tiếp tuyến giảm thể tích
Đun cách thủy ở 50°C
Đổi đệm bên ngoài liposome bằng lọc tiếp tuyến Nhiệt độ: 60°C. Tốc độ: 4000 v/p Thời gian: 10 phút Màng PS 10kD Diện tich lọc: 28cm2 100ml đệm HEPES pH 7,4
Hòa tan DOX.HCl, ủ 50oC/10p. Bảo quản 2 – 8oC
Bảng 3.9. Kết quả KTTP và hiệu suất liposome hóa
Giá trị
Liposome sau lọc
tiếp tuyến Liposome DOX Hàm lượng
toàn phần (mg/ml) EE (%) PDI Zaverage (d.nm) PDI Zaverage (d.nm) M7611 0,173 140,3 165,4 0,201 2,01 90,08 M7612 0,182 149,7 175,4 0,205 2,07 91 M7613 0,198 139,7 188,7 0,208 2,07 89 Trung bình 0,184 143,2 176,5 0,205 2,05 ± 0,04 90,03 ± 1,00
- Hình dạng cấu trúc liposome đánh giá thông qua hình ảnh chụp TEM cho bởi hình 3.8.
Hình 3.8: Ảnh chụp TEM liposome.
- Nhận xét:
+ Liposome thu được từ các mẫu có KTTP nhỏ (< 150 nm), hệ thu được có độ đồng nhất cao, PDI nhỏ (< 0,3). Liposome sau khi nạp dược chất có kích thước và độ đồng nhất thay đổi không nhiều so với trước khi nạp (Zaverage < 200 nm, PDI~0,2).
+ Hàm lượng DOX toàn phần cho giá trị cao đạt mục tiêu bào chế đặt ra. Hiệu suất liposome hóa các mẫu thu được đều lớn hơn 88%, kết quả định lượng tương đương kết quả thu được từ các nghiên cứu tham khảo trước đó [1], [6].
+ Hình ảnh chụp TEM cho thấy: sau khi lọc tiếp tuyến các liposome thu được có kích thước nhỏ (70 – 120 nm) và khá đồng nhất. Tuy nhiên vẫn còn một số tiểu phân có kích thước khá lớn (300 – 400 nm) nhưng không có liposome nào có kích thước vượt quá 500 nm. Khi quan sát hình ảnh ta cũng nhận thấy một số liposome vẫn chứa thêm cấu trúc đa khoang đa lớp nhưng số khoang số lớp không nhiều (dưới 3 khoang hay lớp trong một liposome). Hiện tượng đa khoang đa lớp có thể ảnh hưởng đến độ ổn định và khả năng mang dược chất của hệ. Khi dựa vào chỉ tiêu đánh giá là hình thái cấu trúc của liposome ta vẫn đề xuất thêm quá trình nén qua màng (extrusion) hoặc đồng nhất hóa dưới áp lực cao để chuyển các liposome này thành các liposome nhỏ đơn lớp. Với liposome tạo thành bằng phương pháp pha loãng ethanol có KTTP nhỏ, đồng nhất, do đó nếu kết hợp thêm giai đoạn làm giảm KTTP bằng nén qua màng vẫn cho thấy những ưu điểm vượt trội trong tiết kiệm chi phí cũng như thời gian quy trình bào chế do chỉ cần nén qua hai màng 200, 100nm, 10 chu kỳ mỗi màng. Quy trình bào chế và đặc tính liposome DOX thu được cho thấy ưu điểm vượt trội của phương pháp pha loãng ethanol và tính khả thi của phương pháp trong nghiên cứu.
3.3. Bàn luận
- Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi: Sau quá trình khảo sát có thể nhận thấy tỷ lệ dung môi chủ yếu ảnh hưởng đến KTTP, phân bố KTTP của liposome và liposome DOX thu được mà ít ảnh hưởng đến hàm lượng DOX toàn phần hay hiệu suất liposome hóa. Giá trị KTTP và chỉ số đa phân tán PDI thu được kể trên là phù hợp với kết quả tham khảo từ các nghiên cứu trước đó cho thấy rằng khi nồng độ phospholipid trong ethanol càng nhỏ, kích thước các tiểu phân của hệ có xu hướng giảm xuống, tức là tỷ lệ ethanol/ nước càng lớn, liposome thu được có kích thước càng nhỏ, hệ càng đồng nhất. Độ lặp lại cao đối với giá trị KTTP, kém hơn ở phân bố KTTP nhưng thể hiện rõ ràng hơn [11]. Tuy nhiên tỷ lệ ethanol sử dụng cũng được
khuyến cáo nhỏ hơn 7,5/100 [17]. Không những thế, lượng ethanol tồn dư trong chế phẩm có thể gây trở ngại cho việc phát triển dạng thuốc tiêm, gây đau, gây hoại tử tại vị trí tiêm [18]. Ngoài yếu tố tỷ lệ dung môi, các nghiên cứu tham khảo trước đó cũng chỉ ra rằng nồng độ phospholipid trong dung dịch ethanol là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến KTTP và chỉ số đa phân tán của hệ thu được. Miquel Pons và cộng sự cho rằng nồng độ phospholipid/ethanol chỉ nên giới hạn dưới 40 mg/ml đảm bảo các liposome tạo ra có kích thước nhỏ, đồng nhất, các tiểu phân kích thước nhỏ chiếm phần lớn thể tích của hệ [17]. Trong phạm vi của nghiên cứu vẫn chưa tiến hành khảo sát được ảnh hưởng của yếu tố nồng độ phospholipid/ethanol.
- Ảnh hưởng của giai đoạn lọc tiếp tuyến: Liposome thu được trước và sau lọc tiếp tuyến cũng nhận thấy có sự khác biệt về KTTP và phân bố KTTP. Điều này có thể lý giải do quá trình lọc tiếp tuyến loại đi lượng ethanol còn tồn dư trong hệ dẫn đến quá trình tái cấu trúc làm thay đổi KTTP và phân bố KTTP của hệ. Nhược điểm của liposome bào chế bằng phương pháp pha loãng ethanol là bị pha loãng nhiều so với liposome bào chế bằng các phương pháp khác do giới hạn về độ tan của phospholipid trong ethanol. Hàm lượng phospholipid có trong 100ml liposome bào chế theo phương pháp này chỉ tương đương với hàm lượng phospholipid có trong 10ml liposome bào chế bằng phương pháp hydrat hóa màng film. Do đó quá trình lọc tiếp tuyến không những có ảnh hưởng đến KTTP, phân bố KTTP mà còn là giai đoạn cần thiết để cô đặc hệ, đạt được nồng độ phospholipid theo yêu cầu. Ngoài ra quá trình lọc tiếp tuyến còn được sử dụng để đổi hệ đệm bên ngoài liposome tạo chênh lệch pH cho quá trình nạp dược chất vào liposome, và tiếp tục loại đi lượng dung môi ethanol còn lại trong hệ. Xét về mặt lý thuyết, ethanol sẽ bị loại đi hoàn toàn sau quá trình loc tiếp tuyến tuy nhiên vẫn cần phải đánh giá lượng ethanol tồn dư để xem xét loại ethanol bằng các biện pháp khác.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ duy trì trong quá trình khuấy trộn khi kết hợp hai pha ảnh hưởng đến độ linh động của phospholipid do đó ảnh hưởng đến khả năng tạo và tái tạo liposome. Xu hướng cho thấy khi nhiệt độ tăng (40oC – 60oC) độ linh động của phospholipid tăng thu được liposome có KTTP nhỏ hơn và đồng nhất hơn
tuy nhiên khi nhiệt độ tăng đến 80oC, liposome thu được lại có KTTP tăng và kém đồng nhất. So với mốc nhiệt độ chuyển pha Tc của phospholipid HSPC (53oC) thấy đặc tính về KTTP và phân bố KTTP của liposome có liên quan tới nhiệt độ này. Do vậy có thể nhận thấy trong quá trình bào chế cần duy trì nhiệt độ cao hơn nhiệt độ chuyển pha của phospholipid nhưng không quá cao tránh làm ảnh hưởng tới KTTP cũng như phân bố KTTP của hệ. Kết quả này là phù hợp với kết quả tham khảo trong các nghiên cứu đã tiến hành trước [25]. Tuy nhiên trong điều kiện giới hạn về thời gian và phương tiện, nghiên cứu chưa thể tiến hành khảo sát được ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ trong khoảng hẹp quanh nhiệt độ chuyển pha của phospholipid tới KTTP và hiệu suất liposome hóa.
- Ảnh hưởng của quá trình làm giảm KTTP bằng nén qua màng:Liposome tạo ra bằng phương pháp pha loãng ethanol chỉ cần trải qua quá trình cô đặc bằng lọc tiếp tuyến đã có thể đạt được KTTP và chỉ số đa phân tán PDI tương đương với liposome bào chế bằng các phương pháp khác sử dụng các biện pháp làm giảm kích thước tiểu phân khác nhau như siêu âm hay nén qua màng với KTTP nhỏ (nằm trong khoảng 150nm), đồng nhất (PDI 0,1-0,2). Tuy nhiên ảnh chụp TEM liposome cho thấy hiện tượng đa khoang đa lớp của các liposome thu được như đã bàn luận ở trên. Do đó vẫn đề xuất bổ sung thêm giai đoạn nén qua màng trong quy trình bào chế.Trong khuôn khổ hạn chế về thời gian, nghiên cứu vẫn chưa thể tiến hành đánh giá ảnh hưởng của giai đoạn nén qua màng tới độ ổn định của chế phẩm. Mặc dù vậy ta có thể nhận thấy nếu kết hợp thêm giai đoạn nén qua màng thì quy trình bào chế vẫn tiêu tốn ít năng lượng và chi phí hơn so với quy trình bào chế đã tiến hành trước đó.
- Về lựa chọn các thông số kỹ thuật trong quy trình bào chế: Quy trình bào chế liposome bằng phương pháp pha loãng ethanol khá đơn giản, cơ chế hình thành liposome chủ yếu trải qua 4 giai đoạn là:
+ Giai đoạn 1: Phospholipid được hòa tan với nồng độ phù hợp và tồn tại ở trạng thái tự do trong ethanol.
+ Giai đoạn 2: dung dịch ethanol được tiêm nhanh vào môi trường nước. Ethanol nhanh chóng bị pha loãng trong dung môi nước, phospholipid được chuyển nhanh
sang pha nước. Trong pha nước để làm giảm sức căng bề mặt các phân tử phospholipid có xu hướng tập hợp tạo thành các lớp kép.
+ Giai đoạn 3: các lớp kép phospholipid lớn dần về kích thước. + Giai đoạn 4: lớp kép đóng vòng tạo liposome.
Mỗi giai đoạn đều có ảnh hưởng quan trọng đến sự hình thành liposome. Bất kỳ một sự thay đổi nào trong các giai đoạn nói trên đều có thể ảnh hưởng đến các đặc tính thu được của liposome. Quá trình nghiên cứu đã tiến hành đánh giá được ảnh hưởng của một số thông số khảo sát và nhận thấy: tỷ lệ dung môi được lựa chọn 7/100 để hạn chế sự tồn dư ethanol trong chế phẩm cuối cùng nhưng vẫn đảm bảo tạo ra liposome có KTTP nhỏ, đồng nhất. Nhiệt độ trong quá trình khuấy trộn hai pha luôn giữ cao hơn nhiệt độ chuyển pha của phospholipd tuy nhiên không nâng quá cao để đảm bảo phospholipid tồn tại ở trạng thái linh động dễ dàng tạo lớp kép và đóng vòng tạo liposome, trong nghiên cứu lựa chọn 60oC. Đồng thời vẫn đề xuất kết hợp thêm quá trình làm giảm KTTP bằng nén qua màng để làm giảm hiện tượng đa khoang đa lớp của các liposome thu được.
- Đánh giá các chỉ tiêu chất lượng của liposome: trong phạm vi thời gian nghiên cứu có hạn cũng như các điều kiện thí nghiệm sẵn có, nghiên cứu chỉ tiến hành lựa chọn đánh giá một số đặc tính của liposome như: KTTP, chỉ số đa phân tán, phân bố KTTP, hình ảnh chụp TEM đánh giá hình thái cấu trúc liposome. Những thông số nói trên là các thông số cơ bản để đánh giá cấu trúc, kích thước nhưng vẫn có khả năng chứng minh được sản phẩm tạo bởi phương pháp nói trên là liposome, và liposome tạo ra có KTTP nhỏ, đồng nhất. Một số chỉ tiêu khác về các đặc tính của liposome như hàm lượng phospholipid, dung môi tồn dư, thế Zeta… được đề xuất đánh giá trong các nghiên cứu tiếp theo, để đánh giá về độ ổn định, khả năng giải phóng dược chất, tác dụng dược lý của các chế phẩm bào chế được. Đồng thời cũng là cơ sở để tiếp tục nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình bào chế liposome DOX bằng phương pháp pha loãng ethanol.
- Về tiềm năng của phương pháp: quy trình bào chế liposome DOX bằng phương pháp pha loãng ethanol được tiến hành nhằm khắc phục những hạn chế của các
phương pháp đã tiến hành trong các nghiên cứu trước đó [1], [5], [6], [7] như thời gian quy trình bào chế dài, nhất thiết phải sử dụng các biện pháp đồng nhất hóa làm giảm KTTP…nhưng vẫn đảm bảo liposome tạo thành đạt được các đặc tính tương