Nghiên cứu s ự ô nhiễm vi khuẩn Escherichia coli và Salmonella ở thịt gà tại một số ch ợ trên địa bàn thành phố Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên.

Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli và Salmonella ở thịt gà tươi tại các chợ trên địa bàn thành phố Thái Nguyên theo thời gian sau giết mổ .... Mức độ ô nhiễm vi khuẩn E.coli và Salmonella trên

NGÔ THỊ THU HOÀI

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU SỰ Ô NHIỄM VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI VÀ SALMONELLA Ở THỊT GÀ TẠI MỘT SỐ CHỢ TRÊN ĐỊA BÀN

THÀNH PHỐ THÁI NGUYÊN, TỈNH THÁI NGUYÊN

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Khoa Chăn nuôi thú y – Trường Đại học Nông Lâm

Thái Nguyên, năm 2014

khoảng thời gian mà mỗi sinh viên chúng ta đều mong đợi Đây là khoảng thời gian để cho tất cả sinh viên có cơ hội đem những kiến thức đã tiếp thu

được trên ghế nhà trường ứng dụng vào thực tiễn sản xuất

Sau gần 6 tháng thực tập tốt nghiệp, em đã hoàn thành bản khoá luận tốt nghiệp Để có được kết quả này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, em luôn nhận được sự giúp đỡ chu đáo, tận tình của nhà trường, các cơ quan, thầy cô, gia đình và bạn bè Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới:

Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Chăn nuôi – Thú y, các thầy giáo, cô giáo đã tận tình dìu dắt em trong suốt quá trình học tại trường

Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của cô giáo

hướng dẫn TS Phan Thị Hồng Phúc đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn để em

hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ban lãnh đạo cùng toàn thể cán bộ nhân viên Trạm Thú y thành phố Thái Nguyên, anh Nguyễn Hồng Quân – học viên cao học K21 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp

Cuối cùng em xin được bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ em hoàn thành tốt việc học tập, nghiên cứu của mình

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày tháng 12 năm 2014

Sinh viên

Ngô Thị Thu Hoài

Bảng 3.1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 16

Bảng 3.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 17

Bảng 3.3 Các dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 17

Bảng 4.1 Thực trạng giết mổ gà trên địa bàn thành phố Thái Nguyên 24

Bảng 4.2 Tình hình kiểm soát giết mổ và kiểm tra vệ sinh thú y trên địa bàn thành phố Thái Nguyên 26

Bảng 4.3 Mức nhiễm vi khuẩn E.coli và Salmonella trên thịt gà tại cơ sở giết mổ trên địa bàn thành phố Thái Nguyên 28

Bảng 4.4 Mức nhiễm vi khuẩn E.coli và Salmonella ở thịt gà trên thị trường thành phố Thái Nguyên 30

Bảng 4.5 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli và Salmonella ở thịt gà tươi tại các chợ trên địa bàn thành phố Thái Nguyên theo thời gian sau giết mổ 31

Bảng 4.6 Kết quả xác định đặc tính sinh hoá của một số chủng E.coli phân lập được từ thịt gà 34

Bảng 4.7 Kết quả xác định đặc tính sinh hoá của một số chủng Salmonella phân lập được từ thịt gà 35

Bảng 4.8 Kết quả xác định độc lực của vi khuẩn E.coli trên chuột bạch 36

Bảng 4.9 Kết quả xác định độc lực của Salmonella trên chuột bạch 37

Bảng 4.10 Kết quả xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn E.coli phân lập được từ thịt gà 38

Bảng 4.11 Kết quả xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập được từ thịt gà 39

E.coli : Escherichia coli

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Mục đích nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa của đề tài 2

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Cơ sở khoa học 3

2.1.1 Thịt và những vi sinh vật thường có trong thịt 3

2.1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thịt gà 3

2.1.3 Đặc điểm chính của vi khuẩn E.coli 4

2.1.4 Đặc điểm chính của vi khuẩn Salmonella 7

2.1.5 Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong sản phẩm thịt chế biến 14

2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 14

2.2.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm trên thế giới 14

2.2.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm ở nước ta……….15

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 16

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

3.1.2 Vật liệu, hóa chất và dụng cụ nghiên cứu 16

3.1.3 Phạm vi nghiên cứu 17

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 18

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 18

3.2.2 Thời gian nghiên cứu 18

3.3 Nội dung nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi 18

3.4 Phương pháp nghiên cứu 18

3.4.1 Phương pháp đánh giá thực trạng giết mổ 18

3.4.4 Phương pháp xác định độc lực của vi khuẩn E.coli 20

3.4.5 Phương pháp xác định vi khuẩn Salmonella trong thịt 20

3.4.6 Phương pháp xác định độc lực của vi khuẩn Salmonella 22

3.4.7 Phương pháp xác định tính mẫn cảm một số loại kháng sinh và hóa dược của vi khuẩn 22

3.4.8 Phương pháp xử lý số liệu 23

Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24

4.1 Thực trạng giết mổ gia cầm trên địa bàn thành phố Thái Nguyên 24

4.1.1 Thực trạng giết mổ gà trên địa bàn thành phố Thái Nguyên 24

4.1.2 Tình hình kiểm soát giết mổ và kiểm tra vệ sinh thú y ở thành phố Thái Nguyên 26

4.2 Mức độ ô nhiễm vi khuẩn E.coli và Salmonella trên thịt gà tại các cơ sở giết mổ và thị trường thành phố Thái Nguyên 27

4.3 Nghiên cứu đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E.coli và Salmonella 33

4.3.1 Kết quả xác định đặc tính sinh hoá của vi khuẩn E.coli phân lập được từ thịt gà 33

4.3.2 Kết quả xác định đặc tính sinh hoá của vi khuẩn Salmonella phân lập được từ thịt gà 34

4.4 Kết quả xác định độc lực của vi khuẩn E.coli và Salmonella phân lập từ thịt gà 35

4.4.1 Kết quả xác định độc lực của vi khuẩn E.coli phân lập được từ thịt gà 36

4.4.2 Kết quả xác định độc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập được từ thịt gà 37

4.5 Kết quả xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn E.coli và Salmonella phân lập được từ thịt gà 38

4.5.2 Kết quả xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn

Salmonella phân lập được từ thịt gà 39

4.6 Đề xuất một số biện pháp hạn chế sự ô nhiễm vi khuẩn E.coli và Salmonella trong thịt gà tại thành phố Thái Nguyên 40

4.6.1 Giải pháp trước mắt 40

4.6.2 Giải pháp lâu dài 42

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43

5.1 Kết luận 43

5.2 Đề nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Nền kinh tế nước ta đang phát triển cùng hội nhập kinh tế toàn cầu, mức sống ngày càng được nâng cao Con người không chỉ được ăn no mặc

ấm mà còn được ăn ngon mặc đẹp và quan trọng hơn hết là sức khỏe con

người đã được bảo vệ tốt hơn Trong những năm gần đây, vấn đề “Bảo đảm chất lượng và an toàn thực phẩm” đang là mối quan tâm đặc biệt ở nước ta và nhiều nơi trên thế giới Thực phẩm an toàn đóng góp to lớn trong việc cải thiện sức khỏe con người, chất lượng cuộc sống

Hiện nay, ngộ độc thực phẩm là một vấn đề nghiêm trọng đối với sức khỏe con người Theo báo cáo của Cục vệ sinh an toàn thực phẩm (2012) [4] cho biết trong những năm gần đây ngộ độc thực phẩm đã xảy ra khá phổ biến trên địa bàn cả nước, trong năm 2012 đã có 168 vụ ngộ độc thực phẩm với 5.541 người mắc và có 34 người tử vong Cũng theo báo cáo của Cục vệ sinh

an toàn thực phẩm (2013) [5] trong 6 tháng đầu năm 2013 cả nước xảy ra 64 vụ ngộ độc thực phẩm với 1.485 người ngộ độc trong đó có 15 người đã tử vong Theo Tô Liên Thu (1999) [17] thực phẩm có nguồn gốc từ động vật,

đặc biệt là thịt gà bán ở một số chợ, cửa hàng không đảm bảo chất lượng (thịt

bị nhiễm bụi bẩn, vi khuẩn do quá trình giết mổ, vận chuyển và bày bán ở chợ) Một trong những nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật

và các độc tố của chúng nhiễm trong thịt, trong đó có vi khuẩn E.coli và vi khuẩn Salmonella Ngộ độc do 2 loại vi sinh vật trên là do ăn, uống phải thức

ăn bị nhiễm vi khuẩn và độc tố của chúng

Thành phố Thái Nguyên là trung tâm văn hóa, chính trị của tỉnh Thái

tích toàn tỉnh, dân số là 279710 người Do đời sống nhân dân ngày càng

được nâng cao nên nhu cầu tiêu thụ các sản phẩm từ thịt, trứng, sữa vào

các bữa ăn hàng ngày, các dịp lễ tết cũng ngày càng tăng Đặc biệt mức tiêu thụ thịt gà là rất lớn Tuy nhiên, việc giết mổ và bán thịt mới chỉ dừng lại ở quy mô tư nhân, chưa có lò mổ tập trung, phương tiện vận chuyển, bán thịt chưa đạt tiêu chuẩn vệ sinh thú y Việc kiểm tra vệ sinh thú y của cán bộ kiểm dịch còn gặp rất nhiều khó khăn, chỉ dừng lại ở mức độ cảm quan để kiểm tra thịt được bày bán Xuất phát từ thực tiễn đời sống và đòi hỏi của xã hội về an toàn thực phẩm, được sự đồng ý của Ban chủ nhiệm

khoa Chăn nuôi – Thú y, chúng em tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu

sự ô nhiễm vi khuẩn Escherichia coli và Salmonella ở thịt gà tại một số chợ trên địa bàn thành phố Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá được mức độ ô nhiễm vi khuẩn E.coli và vi khuẩn Salmonella

trong sản phẩm thịt gà trên địa bàn thành phố Thái nguyên

1.3 Mục đích nghiên cứu

- Xác định hiện trạng vệ sinh của các cơ sở giết mổ gà tại thành phố Thái Nguyên

- Xác định mức độ ô nhiễm vi khuẩn E.coli và Salmonella trên thịt gà

tại các cơ sở giết mổ và trên thị trường thành phố Thái Nguyên

- Xác định đặc tính sinh hóa, độc lực, độc tố và kháng kháng sinh của

vi khuẩn phân lập được từ thịt gà

- Đề xuất một số biện pháp cải thiện chất lượng của thịt, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng

1.4 Ý nghĩa của đề tài

- Ý nghĩa khoa học: Bổ sung thêm những thông tin về tình hình nhiễm

E.coli và Salmonella trên các mẫu thịt gà trên địa bàn thành phố Thái Nguyên,

làm nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu cùng lĩnh vực

- Ý nghĩa thực tiễn: Đánh giá được thực trạng nhiễm E.coli và

Salmonella trên thịt gà tại địa bàn thành phố Thái Nguyên, góp phần làm cơ

sở cho các cơ quan chức năng khắc phục tình trạng ngộ độc thực phẩm

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Cơ sở khoa học

2.1.1 Thịt và những vi sinh vật thường có trong thịt

Thịt là một trong những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao Từ thịt có thể chế biến ra nhiều loại món ăn phục vụ cho đời sống của con người Sản phẩm từ thịt bao gồm các loại thịt chín (trong các cửa hàng, quán cơm bình dân, quán cơm sinh viên ) và thịt chế biến sẵn (xúc xích, lạp xường, dăm bông ,thịt nướng hay các sản phẩm thịt đóng gói trong các siêu thị) Các loại thịt chế biến sẵn thì không nhất thiết là phải gia nhiệt trước khi ăn

Theo CAST (1994) [29] các loại vi khuẩn thường có trong thịt là:

Salmonella, Campylobacter (hay xoắn khuẩn), Coliform, E.coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Clotridium perfringens, Chúng có khả năng

gây ngộ độc cho người Trong số các vi khuẩn trên E.coli và Salmonella là

những nguyên nhân hàng đầu gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm

Với E.coli: Thường thấy có trong thịt, trứng, sữa Khi nhiễm vi khuẩn

này thường bị nôn mửa và có thể ỉa chảy, đau bụng dữ dội

Với Salmonella: Gây ra bệnh thương hàn, khi con người ăn phải thịt nhiễm Salmonella sau 6 - 72 giờ có thể bị nhiễm bệnh với các biểu hiện như

nôn, đau bụng, sốt, ỉa chảy và đau đầu Có tới gần 70% các vụ ngộ độc thực

phẩm là do nhiễm Salmonella

2.1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thịt gà

Ngành chăn nuôi của Việt Nam trong những năm qua vẫn duy trì được

mức tăng trưởng 5 - 6% năm, đáp ứng cơ bản thực phẩm cho nhu cầu trong

nước Có những bước đột phá, áp dụng tiến bộ kỹ thuật vào sản xuất phù hợp trong nền kinh tế thị trường và hội nhập

Tuy nhiên, cho đến nay nhiều tỉnh, thành phố, đặc biệt là các tỉnh phía Bắc vẫn chưa quy hoạch, xây dựng được hệ thống giết mổ tập trung Tại nhiều

địa phương, tình trạng giết mổ lưu động ngay tại hộ chăn nuôi diễn ra phổ biến

gây không ít khó khăn cho công tác quản lý giết mổ gia súc, gia cầm

Tình trạng giết mổ gia súc, gia cầm nói chung và giết mổ gà nói riêng

để tiêu thụ trong thành phố Thái Nguyên cũng không nằm ngoài thực tiễn trên

Các điểm giết mổ diễn ra tràn lan, không quản lý được Trước tình hình đó, ngành thú y đã phối hợp với các cấp, các ngành thực hiện công tác kiểm soát giết mổ, kiểm tra vệ sinh thú y nhưng mới chỉ dừng lại ở hình thức kiểm tra bằng phương pháp cảm quan và lăn dấu trên thân thịt sau khi giết mổ tại các quầy bán trên chợ Việc giết mổ gà vẫn chưa có lò mổ tập trung, chuyên dụng mà chủ yếu vẫn là giết mổ tại các hộ chăn nuôi và các lò mổ tư nhân tự phát

2.1.3 Đặc điểm chính của vi khuẩn E.coli

2.1.3.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn E.coli

nhà vi sinh vật học người Đức Theodor Escherich phân lập vào năm 1885 từ phân trẻ em bị mắc bệnh tiêu chảy Đây là một sự khám phá rất quan trọng đối với sức khoẻ con người

Theo ICMF (1978) [34] Escherichia coli thuộc giống Escherichia, tộc

Escherichieae, họ Enterobacteriaceae Sự có mặt củaE.coli trong thực phẩm là

của thịt trong quá trình giết mổ và chế biến Số lượng lớnE.coli trong thực phẩm

chứng tỏ mối nguy hiểm về khả năng nhiễm vi khuẩn gây bệnh

2.1.3.2 Những đặc tính của vi khuẩn E.coli

* Đặc tính về hình thái:

Theo Nguyễn Như Thanh và cs (2001) [15] vi khuẩn E.coli là những

trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, có lông, di động được, bắt màu gram

âm, thường thẫm hai đầu, ở giữa nhạt Kích thước 2 - 3 x 0,4 - 0,6µm Trong

cơ thể có hình cầu trực khuẩn; đứng riêng rẽ, đôi khi đứng thành chuỗi ngắn

* Đặc tính về nuôi cấy:

thường, là loại vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tuỳ tiện Nhiệt độ thích hợp

thể phát triển trong môi trường pH 5,5 - 5,8

- Nuôi cấy trên môi trường nước thịt: E.coli phát triển nhanh, môi

trường đục đều có cặn màu tro nhạt, trên mặt hình thành màng mỏng dính vào thành ống nghiệm, canh trùng có mùi phân thối

- Trên môi trường thạch thường: Sau 24 giờ vi khuẩn E.coli hình

thành những khuẩn lạc tròn ướt, không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính 2-3 mm Nuôi lâu, khuẩn lạc trở thành màu nâu nhạt và mọc rộng ra, có thể quan sát thấy có cả những khuẩn lạc dạng R (Rough)

và M (Mucoide)

- Môi trường Endo: Hình thành khuẩn lạc có màu đỏ ánh kim

- Trên môi trường Macconkey: Sau 24 giờ vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc màu đỏ

- Trên môi trường thạch Brilliant green: E.coli hình thành khuẩn lạc

dạng S (Smooth) màu vàng nhạt

* Đặc tính sinh hoá học:

men không sinh hơi với Saccarose, Rafinose, Salixin và Glycerol.E.coli di

động, có sinh Indol, không sinh Ureaza, có men Lysindecacboxylaza, không

2.1.3.3 Đặc tính gây bệnh và sức đề kháng của vi khuẩn E.coli

* Đặc tính gây bệnh:

Theo Hoàng Thu Thuỷ (1991) [20]: Những serotype có khả năng gây ngộ độc thức ăn như O26, O56, O86, O111, O119, O125, O126, O127, O157H7

Winkler G Weinberg M D (2002) [41] cho biết: Các nhà vi trùng học đã

1 hay nhiều serotype.E.coli O157H7 được Trung tâm giám sát dịch bệnh của Mỹ

phát hiện đầu tiên vào năm 1975, sau 8 nămE.coli O157H7 mới xác định chắc chắn là nguyên nhân gây bệnh viêm ruột Đặc biệt năm 1982, một số ổ dịch ngộ

độc thực phẩm bao gồm cả trường hợp bị dung huyết dạ dày, ruột Với kết quả

này, người ta xác định rõE.coli O157H7là vi khuẩn gây dung huyết

*Sức đề kháng:

Theo Nguyễn Lân Dũng và cs (1995) [8], E.coli có sức đề kháng kém, bị

diệt ở nhiệt độ 550C trong 1 giờ và ở 600C trong vòng 30 phút Các chất sát trùng thông thường như nước gia ven 0,5%, Phenol 0,5% diệt đượcE.coli sau 2 - 4 phút

2.1.3.4 Độc tố - Yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli

Vi khuẩn E.coli sản sinh 2 loại độc tố: Nội độc tố và ngoại độc tố

trong vòng 10 - 30 phút Dưới tác dụng của Formol và nhiệt, ngoại độc tố chuyển thành giải độc tố Ngoại độc tố có hướng thần kinh và gây hoại tử Hiện nay, việc chiết xuất ngoại độc tố chưa thành công mà chỉ có thể phát hiện trong canh trùng của những chủng mới phân lập

- Nội độc tố là yếu tố gây độc chủ yếu của trực khuẩn đường ruột Chúng có trong tế bào vi khuẩn và gắn với tế bào vi khuẩn rất chặt Nội độc

tố có thể chiết xuất bằng nhiều phương pháp như phá vỡ vỏ tế bào bằng cơ học, chiết xuất bằng axít trichloaxetic, phenol, dưới tác dụng của enzym Nội

độc tố được coi là kháng nguyên hoàn toàn và có tính đặc hiệu cao đối với

các chủng vi khuẩn

2.1.4 Đặc điểm chính của vi khuẩn Salmonella

2.1.4.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Salmonella

* Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, Salmonellosis được nghiên cứu từ lâu Trong 3 năm (1951

- 1953), viện Paster Sài Gòn đã phân lập được 6 chủng Salmonella ở 4 người.

Trần Quang Diên (2001) [7] cho biết, đã xác định thấy tỷ lệ nhiễm

Salmonella ở một số giống gà của các khu vực khác nhau: kết quả cho thấy ở

Hà Nội giống gà AA nhiễm 12,62% giống Avian nhiễm 13,69% giống ISA ở

Hà Tây nhiễm 7,4%, ở Hải Dương nhiễm 5,33%, ở Hòa Bình nhiễm 1,19%

Tác giả cũng thông báo tỷ lệ nhiễm Salmonella theo các lứa tuổi và mùa vụ

Tô Liên Thu (2005) [19] cho biết, khi xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella

của các mẫu thịt gà ở Hà Nội là rất cao chiếm 33% các mẫu lấy tại siêu thị, 40% các mẫu lấy từ chợ Lò mổ là một mắt xích quan trọng có nguy cơ ô

nhiễm Salmonella vào thân thịt sau giết mổ

Theo Võ Thị Bích Thủy và cs (2004) [21] thịt có nguồn gốc tại các chợ

thịt lợn; và 40% với thịt bò

Theo Lưu Quỳnh Hương (2006) [13] tỷ lệ lưu hành của Salmonella trên

thịt gà ở Hà Nội là 48,9%

Võ Thị Trà An (2006) [1] cho biết, tỷ lệ thân thịt nhiễm Salmonella khá cao

với thịt bò, thịt heo, thịt gà ở các tỉnh phía Nam lần lượt là 34,3%, 55,9%, và 64,6%

Theo Võ Ngọc Bảo (2006) [2] tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thân thịt gà

ở thành phố Hồ Chí Minh tại lò mổ lớn là 34,2% và ở lò mổ nhỏ là 48%

Theo nghiên cứu của Trần Thị Hạnh (2004) [11] cho biết tỷ lệ nhiễm

Salmonella trong thực phẩm trên thị trường Hà Nội với thịt bò, thịt lợn, thịt gà

và giò sống lần lượt là 40,5%; 34,62%; 37,50% và 45,45%

* Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Ngày nay các nhà khoa học đã xác định được khoảng trên 2.300 serotype

Salmonella và chia làm 67 nhóm huyết thanh dựa vào cấu trúc kháng nguyên O Salmonellosis là một bệnh truyền nhiễm phức tạp của nhiều loài động vật và

người Bệnh có đặc điểm dịch tễ khác nhau giữa các vùng địa lý, phụ thuộc vào khí hậu, mật độ động vật, tập quán canh tác, kỹ thuật thu hoạch và chế biến

thực phẩm, thói quen tiêu dùng và đặc tính sinh học các chủng Salmonella

Vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra được rất nhiều các nhà

vi sinh vật trên toàn thế giới quan tâm Mục đích của các nghiên cứu này nhằm tìm ra các biện pháp có hiệu quả để góp phần ngăn chặn và đẩy lùi bệnh

do Salmonella gây ra ở động vật và ở người

2.1.4.2 Những đặc tính của vi khuẩn Salmonella

* Đặc tính về hình thái:

Theo Bergeys (1957) [27], vi khuẩn Salmonella là những trực khuẩn

gram âm, hai đầu tròn, kích thước 1-3 x 0,4-0,6µm Vi khuẩn có từ 7- 12 lông

xung quanh thân nên có khả năng di động mạnh, trừ Salmonella pullorum và

Salmonella gallinarum gây bệnh cho gia cầm là không có lông Vi khuẩn Salmonella không hình thành nha bào và không có giáp mô

* Đặc tính nuôi cấy:

Vi khuẩn Salmonella dễ dàng phát triển trên các môi trường dinh

dưỡng thông thường và khó phân biệt được với sự phát triển của các vi khuẩn

đường ruột khác

Theo Michael J G (1981) [37], vi khuẩn Salmonella là loại vi khuẩn

hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và sinh trưởng là 370C và pH thích hợp là 7,2

Theo Vũ Đạt (1995) [9] nuôi cấy trên môi trường nước thịt ở 370C sau

24 giờ những chủng Salmonelladạng S cho kết quả đục đều, có cặn trong

điều kiện phát triển mạnh, khi lắc cặn dễ tan thành canh khuẩn đồng nhất, rất

hiếm khi hình thành màng Sự phát triển của vi khuẩnSalmonella xảy ra nhanh chóng trong khoảng 12- 18 giờ đầu, sau đó giảm ở thời gian 48- 72 giờ Tốc độ phát triển của vi khuẩn Salmonella phụ thuộc vào nhiệt độ

nuôi cấy, pH, nồng độ muối và mức độ dinh dưỡng có trong môi trường

ở biên độ nhiệt độ rộng từ 5 - 470

C

Độ pH thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn Salmonella từ 6,5 -

7,5; Tuy nhiên, nó có thể phát triển với pH biến động từ 4,5 - 9,0

* Đặc tính sinh vật học

Dulcitol, Sorbitol, Rhamnose, Arabinose, Maltose, Xylose và Trehalose Không lên men Lactose, Saccarose, Salicin và Adonitol Urease, Indol, VP âm

Urease và Indol âm tính nhưng trong thực tế chúng ta có thể gặp những chủng không đặc trưng Theo Bulac Burn Ellis (1989) [28], có đến 15,6%

* Khả năng đề kháng của vi khuẩn Salmonella

Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1977) [14] Vi khuẩn Salmonella bị diệt ở

nhiệt độ 600C trong vòng 1 giờ, nếu 750C thì chỉ trong 5 phút Ánh sáng mặt trời chiếu thẳng, diệt vi khuẩn ở nước trong khoảng 5 giờ và nước đục 9 giờ

equi có khả năng sống trong vòng 10 ngày, ở độ sâu 0,5cm sống 2 tháng;

nơi khô ráo, ánh sáng phân tán sống 5 tháng; ở sàn gỗ sống 87 ngày

Trong xác chết, Salmonella có thể tồn tại 100 ngày, trong thịt ướp muối

ở 6-120

trong (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977) [14]

2.1.4.3 Các yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella

* Kháng nguyên O

Theo Mintz C S (1983) [38] Kháng nguyên O là yếu tố độc lực giúp vi khuẩn chống lại khả năng phòng vệ của vật chủ, giúp vi khuẩn phát triển trong tổ chức, chống lại sự thực bào của đại thực bào

Kháng nguyên O kích thích các cơ quan đáp ứng miễn dịch hình thành kháng thể đặc hiệu ngưng kết với kháng nguyên tương ứng Cơ chế phòng vệ này giúp cơ thể vật chủ chống lại quá trình tái xâm nhập của vi khuẩn

* Kháng nguyên K

Theo Evans D G (1973) [32] Bằng phương pháp điện di, người ta đã phát hiện được bản chất hoá học của kháng nguyên K là polysaccharides Vai trò của kháng nguyên K chưa thống nhất Nhiều ý kiến cho rằng kháng nguyên K có ý nghĩa về mặt độc lực vì nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trước các yếu tố phòng vệ của cơ thể, chống lại các hiện tượng thực bào

* Kháng nguyên H (Flagella):

Theo Evans D G (1973) [32], bản chất của kháng nguyên H chính là

có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phòng bệnh, không quyết định yếu tố độc lực và vai trò bám dính của vi khuẩn Tuy vậy, kháng nguyên H có vai trò bảo vệ cho vi khuẩn không bị tiêu diệt bởi quá trình thực bào, giúp vi khuẩn sống và nhân lên trong tế bào đại thực bào cũng như trong các tế bào gan, thận

* Yếu tố bám dính (Fimbriae):

Theo Jones G W (1982) [35], bám dính là một khái niệm chỉ mối quan

hệ của sự liên hệ vững chắc, thuận nghịch giữa bề mặt vi khuẩn và tế bào vật chủ Tất cả các cấu trúc thể hiện chức năng bám dính được gọi là yếu tố bám dính

Khả năng bám dính của vi khuẩn lên tế bào biểu mô ruột đến nay đã

được khẳng định là yếu tố gây bệnh quan trọng, nó giúp cho vi khuẩn xâm

nhập vào cơ thể vật chủ và gây bệnh Những vi khuẩn có độc lực cao có khả năng bám dính tốt hơn là vi khuẩn có độc lực thấp

* Khả năng xâm nhập và nhân lên trong tế bào của vi khuẩn Salmonella

Theo Frost A J và cs (1997) [33], sau khi tiếp cận tế bào vật chủ, vi khuẩnSalmonellatác động làm biến đổi bề mặt màng tế bào bằng cách thay đổi hình dạng các sợi actin dẫn tới hình thành giả túc bao vây tế bào vi khuẩn dưới dạng các không bào chứa vi khuẩn Cơ chế làm biến dạng các sợi actin màng tế bào vật chủ là do tác động của vi khuẩn làm tăng hàm lượng Ca++nội bào, tín hiệu đó hoạt hoá actin depolimerizing enzymes dẫn tới sắp xếp lại cấu trúc sợi actin Sau khi

dưới hình thức hấp thu nội bào Bên trong tế bào vi khuẩn tiếp tục tồn tại trong không bào rồi nhân lên với số lượng lớn và phá vỡ tế bào vật chủ

* Khả năng kháng kháng sinh

Việc sử dụng thường xuyên các loại kháng sinh phòng trị bệnh cho gia cầm là một nguy cơ tồn tại làm tăng khả năng kháng kháng sinh cũng như duy trì bản chất gây bệnh của vi khuẩn đối với sức khoẻ con người và gia súc Theo Phạm Khắc Hiếu, Bùi Thị Tho (1998) [12], những nghiên cứu mới

đây, về tính kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trong thú y cho thấy trong 88

chủng Salmonella khi nghiên cứu về tính kháng thuốc đối với Ampicilin,

Streptomycin và Sulphonamid cho thấy có tới 100% chủng Salmonella kháng với Penicilin và Sulphonamid, chưa có chủng Salmonella nào kháng lại Furazolidon Chỉ có một chủng Salmonella duy nhất kháng lại với Neomycin

2.1.4.4 Độc tố của vi khuẩn Salmonella

Đối với vi khuẩn Salmonella chúng sản sinh ra ít nhất 3 loại độc tố chính đó là:

* Enterotoxins:

Theo Clarker và Gyles (1993) [30] là một loại độc tố thường xuyên

được vi khuẩn tiết vào môi trường nuôi cấy, là thành phần chủ yếu của nhóm

exotoxin của vi khuẩn đường ruột Các enterotoxin củaSalmonella có quan

hệ gần gũi với Toxin Cholera cả về cơ chế tác động và sản sinh nên gọi là Choleratoxin like Enterotoxin - (CT), chúng có cấu trúc chức năng sinh học

và đặc tính kháng nguyên giống với CT và enterotoxin do E.coli sản sinh

Gen di truyền khả năng sản sinh enterotoxin bằng tiếp hợp, có thể truyền

từSalmonella typhimurium sang cho E.coli Enterotoxin tạo ra sự rút nước từ

cơ thể vào lòng ruột gây tiêu chảy

Theo Peterson J W (1980) [40] độc tố enterotoxin của vi khuẩnSalmonella có 2 thành phần chính là độc tố thẩm xuất nhanh (Rapid

permeability factor: RPF) và độc tố thẩm xuất chậm (Delayed permeability factor: DPF)

* Cytotoxins

Thành phần của Cytotoxin không phải là lipopolysaccharide (Non-LPS)

nằm ở màng ngoài vi khuẩn Salmonella Đặc tính chung của Cytotoxin là có

khả năng ức chế tổng hợp protein của tế bào Eukaryotic và làm trương tế bào Theo Clark S và cs (1995) [31], làm tổn thương tế bào biểu mô là đặc tính quan trọng của Cytotoxin

* Endotoxins:

Thành phần chủ yếu của Endotoxins là Lipopolysaccharide Vì vậy, để hiểu cơ chế tác động của độc tố này cần hiểu về cấu trúc phân tử của Lipopolysaccharide

- Cấu tạo phân tử Lipopolysaccharide (LPS): Theo Orskov I và cs

(1977) [39] LPS là một thành phần cơ bản cấu tạo màng ngoài tế bào vi khuẩn

Salmonella Phân tử LPS của vi khuẩn Gram (-) có cấu tạo phân tử lớn gồm 3

vùng riêng biệt với các đặc tính đối lập nhau Vùng thứ nhất là vùng ưa nước,

vùng lõi ở trung tâm và vùng Lipid A Vùng ưa nước bao gồm một chuỗi Polysaccharide chứa các đơn vị cấu trúc kháng nguyên O Vùng lõi có bản chất là Acid heterooligo saccharide nối kháng nguyên O với vùng Lipid A Endotoxins được giải phóng từ tế bào vi khuẩn trong quá trình phát

triển hoặc do tế bào vi khuẩn bị phân giải Chức năng nội độc tố do lipid A

đảm nhận và tính đặc trưng của kháng nguyên O do chuỗi lipopolysaccharide

quy định của vi khuẩn đường ruột

2.1.4.5 Plasmid - Cơ quan di truyền các yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella

Theo Krause M và cs (1995) [36] Plasmid là cơ quan cần thiết di

chứa một số lượng lớn khoảng từ 50 đến 100 Plasmid

typhimurium gây bệnh mang plasmid chứa các đoạn gen qui định độc lực của

độc lực với các chủng không có yếu tố độc lực này cho thấy: Số lượng vi

khuẩn không mang plasmid độc lực ở gan và lách thấp hơn nhiều so với chủng có yếu tố trên Điều đó, đi đến kết luận một số gen trên plasmid quy

định độc lực đảm bảo cho vi khuẩn phát triển ở gan và lách

Tóm lại, do tính chất nguy hiểm của các loài vi khuẩn ô nhiễm và gây ngộ độc thực phẩm, nhiều tác giả trên thế giới đã tập trung nghiên cứu, nhằm mục đích ngăn chặn sự ô nhiễm của chúng đối với bản thân động vật

và con người sử dụng sản phẩm động vật làm thực phẩm, việc nghiên cứu

đã giải quyết các vấn đề như: xây dựng các qui trình phân lập, sơ đồ chuẩn

để khảo sát tỷ lệ mang trùng và xác định serotype vi khuẩn E.coli, Salmonella Ở Việt Nam, các nghiên cứu đã chỉ ra tỷ lệ nhiễm các vi khuẩn E.coli và Salmonella ở thực phẩm là đáng lo ngại Tuy nhiên, các kết quả

nghiên cứu còn thiếu tính hệ thống, chưa xác định được các chủng độc và

khả năng sản sinh độc tố Chính điều này phần nào hạn chế trong công tác

xử lý khi thực phẩm bị nhiễm các loài vi khuẩn này Vì vậy, nghiên cứu

một số vi khuẩn gây ô nhiễm (E.coli, Salmonella ) trên thực phẩm là một

vấn đề rất cần thiết, không những cung cấp nhiều số liệu thực tế về mức độ nhiễm, tìm ra những chủng vi khuẩn độc mà còn cung cấp một phần lý luận

có cơ sở khoa học cho việc tìm biện pháp phòng ngừa, đảm bảo thực phẩm

an toàn cho người tiêu dùng

2.1.5 Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong sản phẩm thịt chế biến

Quy định kỹ thuật theo TCVN 7046: 2002 [23]

Bảng 2.1 Giới hạn cho phép vi sinh vật trong sản phẩm thịt chế biến

6

2 E.coli, số vi khuẩn trong 1 gram sản phẩm 102

3 Salmonella, số vi khuẩn trong 25 gram sản phẩm 0

4 Baccillus, số vi khuẩn trong 1 gram sản phẩm 102

5 Staphylococcus, số vi khuẩn trong 1 gram sản phẩm 102

6 Clostridium perfringens, số vi khuẩn trong 1 gram

có tới 10% dân số bị ngộ độc thực phẩm và mắc bệnh truyền nhiễm qua thực phẩm mỗi năm; với các nước kém phát triển tỷ lệ này cao hơn nhiều Ngộ độc thực phẩm ở Mỹ chiếm 5% dân số/năm (>10 triệu người trên năm), ở Úc là 4,2 triệu ca/năm

Tô Liên Thu (2005) [19] cho biết, năm 2003 tại Bỉ có tới 12.849 trường

hợp ngộ độc do vi khuẩn Salmonella và 6.566 trường hợp nhiễm vi khuẩn

Campylobacter và một số vi khuẩn khác mà nguyên nhân chủ yếu là do chế

biến thực phẩm chưa kỹ trong đó thịt nhiễm bẩn chiếm tới 20%

2.2.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm ở nước ta

Thực trạng vi phạm vệ sinh an toàn thực phẩm ở nước ta rất đáng báo

động Ngộ độc thực phẩm cấp tính trong những năm qua vẫn có chiều hướng

gia tăng cả về số vụ lẫn quy mô mắc

Theo Triệu Nguyên Trung (2011) [22] tình hình ngộ độc thực phẩm trong năm 2010 diễn biến phức tạp, cả nước xảy ra 175 vụ ngộ độc (trong đó có 34

vụ ngộ độc hàng loạt trên 30 người) xảy ra tại 47 tỉnh/thành phố làm 5.664 người mắc và 42 trường hợp tử vong; so sánh với số liệu trung bình/năm của giai đoạn 2006 - 2009, số vụ ngộ độc thực phẩm giảm 9,1%; số mắc giảm 17,6% và số tử vong giảm 19,2% Khu vực miền núi phía Bắc có số vụ ngộ

độc cao nhất (32,6%); tiếp đến là Tây Nguyên (12%); miền Trung (11,4%); Đông Nam Bộ (10,3%); và thấp nhất là Đồng bằng Bắc Bộ (4,6%) Thời gian xảy

ra ngộ độc thực phẩm cao nhất vào mùa Hè (tháng 5 đến tháng 9) chiếm trên 70%

số ca mắc và tử vong do ngộ độc thực phẩm trong cả năm

Cục An toàn Vệ sinh thực phẩm (2012) [4] cho biết: Theo thống kê, trong quý III năm 2012, cả nước ghi nhận 67 vụ ngộ độc thực phẩm, với 2.225 người mắc, trong đó có 15 người chết, số vụ ngộ độc thực phẩm lớn (trên 30 người) là 16 vụ Nguyên nhân gây ngộ độc chính là vi sinh vật chiếm 50,8%; độc tố tự nhiên 27,7%; hóa chất 6,2%

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Thịt gà thu thập từ các chợ trên địa bàn thành phố Thái Nguyên

3.1.2 Vật liệu, hóa chất và dụng cụ nghiên cứu

3.1.2.1 Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu

- Mẫu xét nghiệm: Các mẫu thịt gà tươi lấy tại các chợ trên địa bàn thành phố Thái Nguyên

- Động vật thí nghiệm: Chuột bạch khỏe khối lượng tỷ lệ 18 – 20 g/con

3.1.2.2 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu sử dụng các hóa chất được thống kê dưới bảng 3.1

Bảng 3.1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

- Nước muối sinh lý 0,9%: Dùng để pha loãng mẫu

- Hóa chất để nhuộm Gram: Tím Gientian, hồng Fuchsine, cồn, dung dịch Lugol, nước cất

- Các loại đường để thử phản ứng lên men: glucose, lactose, saccharose

3.1.2.3 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 3.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

3.1.2.4 Các dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 3.3 Các dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

3 Đĩa petri thủy tinh đường kính 90 – 100mm Việt Nam

3.1.3 Phạm vi nghiên cứu

- Trên các mẫu thịt gà thu thập được trên địa bàn thành phố Thái Nguyên

- Các thí nghiệm kiểm tra mức độ nhiễm E.coli và Salmonella được tiến

hành tại phòng thí nghiệm

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm thu thập mẫu: Thịt gà tươi tại các cơ sở giết mổ và trên thị trường thành phố Thái Nguyên

- Địa điểm xét nghiệm mẫu: Phòng nghiên cứu Vi sinh vật, Viện Khoa

học Sự sống – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

3.2.2 Thời gian nghiên cứu

Từ 9/6/2014 đến 24/11/2014

3.3 Nội dung nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi

- Khảo sát thực trạng giết mổ và tiêu thụ thịt gà tại các chợ trên địa bàn thành phố Thái Nguyên

- Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli và Salmonella trong các mẫu thịt

gà thu thập

- Xác định một số đặc tính sinh hóa của các chủng E.coli và Salmonella

đã phân lập được

- Thử độc lực của các chủng vi khuẩn E.coli và Salmonella phân lập

được trên chuột bạch khỏe

- Xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn E.coli và

Salmonella phân lập được

- Đề xuất một số biện pháp hạn chế sự ô nhiễm vi khuẩn E.coli và

Salmonella trong thịt gà tại thành phố Thái Nguyên

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp đánh giá thực trạng giết mổ

- Thực trạng giết mổ trên địa bàn thành phố Thái Nguyên tại 4 cơ sở giết mổ bằng cách kiểm tra trực tiếp tại các cơ sở giết mổ

- Tình hình kiểm soát giết mổ và kiểm tra vệ sinh thú y trên địa bàn thành phố Thái Nguyên được chia làm 4 khu, bao gồm:

Khu Tây gồm các phường, xã: Phúc Xuân, Phúc Trìu, Tân Cương, Thịnh Đức; Khu Nam gồm: Hương Sơn, Cam Vá, Tân Thành, Lương Sơn,

Tích Lương, Phú Xá, Tân Lập, Trung Thành; Khu Bắc gồm: Tân Long, Quán Triều, Phúc Hà, Quyết Thắng, Quang Vinh, Cao Ngạn, Đồng Bẩm; Khu Trung tâm gồm: Hoàng Văn Thụ, Trưng Vương, Đồng Quang, Thịnh Đán, Phan Đình Phùng, Gia Sàng, Túc Duyên, Quang Trung, Tân Thịnh

3.4.2 Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm

- Lấy mẫu theo tiêu chuẩn TCVN 4388-1:2002, TCVN 4388-2:2002, ISO 3100-1:1991 [24] [25]

- Thu thập mẫu theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên từ các hàng quán, khu chợ, quầy bán thịt khu vực thành phố Thái Nguyên

- Lấy mẫu thịt: lau dao bằng cồn 70o, sau đó dùng dao cắt lấy 100 –

200g thịt/mẫu vào túi nilon vô trùng và ghi nhãn có các thông tin cần thiết (số bao gói, tên mẫu, địa chỉ mẫu, lô hãng sản xuất, ngày lấy mẫu, ký hiệu )

- Mẫu sau khi thu được bảo quản một cách độc lập với nhau và được vận chuyển tới phòng xét nghiệm trong hộp xốp, bình cách nhiệt có chứa đá

- Tại phòng xét nghiệm mẫu được tiến hành xét thử nghiệm, với mẫu

phải kiểm tra trong vòng 24 giờ

3.4.3 Phương pháp tính tổng số vi khuẩn E.coli

- Mẫu thịt đã được xử lý, sau đó đem cân 10g mẫu đã nghiền nhỏ vào bình tam giác, thêm nước muối sinh lý vừa đủ 100ml ta được huyễn dịch gốc pha loãng ở nồng độ 10-1

- Tiếp tục pha loãng huyễn dịch gốc tới 10-2, 10-3 bằng cách hút 0,5ml

từ nồng độ 10-1 sang ống đứng 4,5ml nước muối sinh lý được 10-2,

- Từ mỗi nồng độ 10-1,10-2,10-3 hút 0,5ml sang môi trường thạch đĩa

Đọc kết quả: Khuẩn lạc nghi E.coli trên môi trường Macconkey có màu

đỏ cánh sen, tròn, lồi, có vòng mờ xung quanh

- Từ những khuẩn lạc nghi ngờ là E.coli tương ứng với từng nồng độ,

dùng que cấy vô trùng cấy vào môi trường nước thịt 5ml Nuôi cấy ở tủ ấm

– 2 giọt dung dịch Kovacs vào môi trường nước thịt, nếu xuất hiện vòng đỏ trên bề mặt môi trường thì đó là phản ứng sinh Indol dương tính (+)

3.4.4 Phương pháp xác định độc lực của vi khuẩn E.coli

Vi khuẩn E.coli được cấy vào môi trường BHI nuôi ở nhiệt độ 370C trong vòng 24 giờ, đếm số vi khuẩn có trong 1ml canh trùng Tiêm 0,5 ml canh trùng vào phúc mạc hoặc tĩnh mạch của chuột bạch (theo dõi triệu chứng

và thời gian chết của chuột trong vòng 7 ngày) Chuột chết mổ khám kiểm tra bệnh tích rồi tiến hành phân lập lại vi khuẩn

3.4.5 Phương pháp xác định vi khuẩn Salmonella trong thịt

Xác định chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella có trong thịt tươi Bao gồm các

Chọn các khuẩn lạc đặc trưng nghi ngờ Salmonella giám định đặc tính sinh hóa:

lên men đường, H2S, Indole, urease, citrate…

Salmonella dương tính/âm tính

trong 25g mẫu

Bước 1: Lấy mẫu, đồng nhất và tăng sinh lần 1

Lấy thịt gà ngẫu nhiên ở nhiều vị trí khác nhau của mẫu, cho vào cối sứ

vô trùng nghiền nhỏ Cân chính xác trong điều kiện vô trùng 25g mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml môi trường Nutrient Broth, lắc đều trong thời gian nhất định ta được dung dịch mẫu với độ pha loãng 10-1 Để tủ ấm 370C/16 - 24h

Bước 2: Tăng sinh lần 2 mẫu đã đồng nhất (tăng sinh chọn lọc)

Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, sau đó dùng pipet vô trùng hút 1ml mẫu

đã đồng nhất và tăng sinh theo bước 1 cấy vào 10ml môi trường Selenit Broth,

bồi dưỡng ở 430C/24h (ở nhiệt độ này Proteus spp và nhiều vi khuẩn tạp

nhiễm khác bị ức chế không phát triển được)

Bước 3: Phân lập và nhận diện

Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc trên đĩa thạch XLD - một loại môi trường

đọc kết quả

- Salmonella phát triển mạnh, khuẩn lạc tròn, lồi, trong suốt, ở giữa có

tâm đen (do sản sinh H2S), đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm cả khuẩn lạc, không lên men lactose

Bước 4: Giám định đặc tính sinh vật, hóa học

Từ môi trường phân lập, chọn khuẩn lạc nghi Salmonella, kiểm tra hình

thái, kích thước 0,4 - 0,6 × 1 - 3µm, không có giáp mô, không sản sinh nha

bào, di động được do có lông, từ 7 - 12 lông (trừ Salmonella pullorum và

Salmonella gallinarum), bắt màu Gram âm

Các thử nghiệm sinh hóa chính cần thực hiện cho Salmonella là: lên

men đường glucose (+), lactose (-), H2S (+), Indol 370C (-), catalase (+)

- Kiểm tra khả năng sản sinh Indole của vi khuẩn: Lấy khuẩn lạc từ đĩa thạch đã cấy thuần cấy vào môi trường Nutrient Broth, bồi dưỡng trong tủ ấm

+ Phản ứng (-) tính: Không có sự thay đổi màu

- Phản ứng Catalase: Nhỏ một giọt hydrogen peroxidaza (H2O2) lên

vùng có khuẩn lạc Salmonella trên thạch đĩa Phản ứng được cho là dương

tính nếu ngay sau khi nhỏ chất phản ứng, bọt khí được hình thành Ngược lại không có bọt khí hình thành, kết quả âm tính

3.4.6 Phương pháp xác định độc lực của vi khuẩn Salmonella

Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn đã được nuôi cấy và phân lập trên môi trường XLD, cho vào các ống nghiệm chứa môi trường BHI đã pha chế,

đem nuôi trong tủ ấm 370

C/24h

Sau đó tiến hành tiêm xoang bụng chuột bạch với liều 0,5ml canh trùng/con Theo dõi 7 ngày sau khi tiêm Khi chuột chết tiến hành mổ khám bệnh tích và phân lập lại vi khuẩn trên môi trường XLD

Đối với chuột bạch đối chứng: Tiêm phúc mạc với liều lượng 0,5ml/con dung

dịch BHI nguyên chất Theo dõi 7 ngày nếu chuột chết tiến hành mổ và khám bệnh tích rồi phân lập lại trên môi trường XLD

3.4.7 Phương pháp xác định tính mẫn cảm một số loại kháng sinh và hóa dược của vi khuẩn

* Nguyên lý chung:

Các chủng vi khuẩn khác nhau sẽ có độ mẫn cảm khác nhau đối với kháng sinh trị liệu, biểu hiện ở sự khác nhau về đường kính (ф) vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh trên môi trường nuôi cấy

* Mục đích:

Tìm hiểu tính mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh sẽ giúp ích