Xác định chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella có trong thịt tươi. Bao gồm các bước sau:
Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh Nutrient Broth. Bồi dưỡng ở 370C/16 - 24h
Cấy 1ml dịch sang 10ml môi trường tăng sinh chọn lọc Selenit Broth. Bồi dưỡng
ở 430C/24h
Phân lập khuẩn lạc đơn trên môi trường chọn lọc đặc biệt (XLD, HE, SS…). Bồi dưỡng 370C/24h
Chọn các khuẩn lạc đặc trưng nghi ngờ Salmonella giám định đặc tính sinh hóa: lên men đường, H2S, Indole, urease, citrate…
Salmonella dương tính/âm tính
Bước 1: Lấy mẫu, đồng nhất và tăng sinh lần 1
Lấy thịt gà ngẫu nhiên ở nhiều vị trí khác nhau của mẫu, cho vào cối sứ vô trùng nghiền nhỏ. Cân chính xác trong điều kiện vô trùng 25g mẫu cho vào bình tam giác chứa 225ml môi trường Nutrient Broth, lắc đều trong thời gian nhất định ta được dung dịch mẫu với độ pha loãng 10-1. Để tủấm 370C/16 - 24h.
Bước 2: Tăng sinh lần 2 mẫu đã đồng nhất (tăng sinh chọn lọc)
Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, sau đó dùng pipet vô trùng hút 1ml mẫu đã đồng nhất và tăng sinh theo bước 1 cấy vào 10ml môi trường Selenit Broth, bồi dưỡng ở 430C/24h (ở nhiệt độ này Proteus spp và nhiều vi khuẩn tạp nhiễm khác bịức chế không phát triển được).
Bước 3: Phân lập và nhận diện
Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc trên đĩa thạch XLD - một loại môi trường phân lập đặc trưng cho vi khuẩn Salmonella. Sau đó bồi dưỡng ở 370C/24h rồi đọc kết quả.
- Salmonella phát triển mạnh, khuẩn lạc tròn, lồi, trong suốt, ở giữa có tâm đen (do sản sinh H2S), đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm cả khuẩn lạc, không lên men lactose.
Bước 4: Giám định đặc tính sinh vật, hóa học
Từ môi trường phân lập, chọn khuẩn lạc nghi Salmonella, kiểm tra hình thái, kích thước 0,4 - 0,6 × 1 - 3µm, không có giáp mô, không sản sinh nha bào, di động được do có lông, từ 7 - 12 lông (trừ Salmonella pullorum và
Salmonella gallinarum), bắt màu Gram âm.
Các thử nghiệm sinh hóa chính cần thực hiện cho Salmonella là: lên
men đường glucose (+), lactose (-), H2S (+), Indol 370C (-), catalase (+). - Kiểm tra khả năng sản sinh Indole của vi khuẩn: Lấy khuẩn lạc từđĩa thạch đã cấy thuần cấy vào môi trường Nutrient Broth, bồi dưỡng trong tủấm
ở 370C trong 18 - 24h, vi khuẩn sẽ sinh trưởng, phát triển và sản sinh Indole (nếu có). Tiến hành kiểm tra bằng cách nhỏ 2 - 3 giọt dung dịch Kovac’s vào ống nghiệm.
+ Phản ứng (+) tính: Trên bề mặt môi trường xuất hiện một vòng nhẫn màu đỏ tím hay màu hồng (đó là phản ứng kết hợp giữa Kovacs màu cafe và Indole không màu).
+ Phản ứng (-) tính: Không có sự thay đổi màu.
- Phản ứng Catalase: Nhỏ một giọt hydrogen peroxidaza (H2O2) lên vùng có khuẩn lạc Salmonella trên thạch đĩa. Phản ứng được cho là dương tính nếu ngay sau khi nhỏ chất phản ứng, bọt khí được hình thành. Ngược lại không có bọt khí hình thành, kết quả âm tính.