Tình hình nhiễm Enterococcus Faecalis trên bệnh nhân có hội chứng tiết dịch ở âm đạo đến khám tại Bệnh viện Da liễu Trung ương từ 10-2014 - 3- 2015

faecalis là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ra nhiễm trùng bệnh viện [1], chúng gây nhiễm trùng đường tiết niệu sinh dục, nhiễm khuẩnhuyết, viêm nội tâm mạc…Tại Việt Nam, theo m

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hội chứng tăng tiết dịch âm đạo là tình trạng âm đạo tăng tiết dịch do sựphát triển quá mức của các loại vi sinh vật có trong âm đạo Hội chứng này dorất nhiều nguyên nhân gây ra, nhưng được biết đến với ba nguyên nhân chính

là vi khuẩn, vi rút và kí sinh trùng Trong số những nguyên nhân kể trên cómột nguyên nhân mà ít được biết đến nhưng gây hậu quả không kém phần

quan trọng, đó là do loài vi khuẩn Enterococcus faecalis (E faecalis) gây nên.

E faecalis trước đây được phân loại vào nhóm liên cầu D, là một vi

khuẩn bắt màu Gram dương, thuộc họ vi khuẩn chí bình thường của đường

ruột E faecalis là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ra nhiễm trùng

bệnh viện [1], chúng gây nhiễm trùng đường tiết niệu sinh dục, nhiễm khuẩnhuyết, viêm nội tâm mạc…Tại Việt Nam, theo một nghiên cứu tại bệnh việnquân y 103, trong vòng 3 năm, trên tổng số 49 bệnh nhân nhiễm trùng đường

tiết niệu, tỉ lệ E faecalis phân lập được là 55,1 % [2].

Ở phụ nữ nhiễm E faecalis đường sinh dục gây hội chứng tiết dịch âm

đạo, bệnh nhân có biểu hiện tăng tiết dịch âm đạo, gây cảm giác ngứa ngáykhó chịu, ảnh hưởng tới chất lượng cuộc sống và nếu điều trị không đúngcách thì bệnh có thể để lại di chứng nặng nề, chẳng hạn vô sinh, tăng nguy cơchửa ngoài tử cung, viêm vùng chậu dai dẳng nếu bệnh nhân không được pháthiện sớm và điều trị kịp thời [3] Bệnh nhân có thể dễ dàng được điều trị bệnhbằng cách sử dụng các loại kháng sinh như penicillin, ampicillin, vàvancomycin Tuy nhiên có một điều đáng lo ngại là gần đây số lượng các

chủng E faecalis kháng với các loại kháng sinh này ngày càng tăng, đặc

biệt là kháng vancomycin khiến cho việc điều trị bệnh gặp nhiều khó khăn[4] Để góp phần vào chẩn đoán và điều trị bệnh hiệu quả hơn, giúp cho

bệnh nhân cải thiện và nâng cao chất lượng cuộc sống, chúng tôi thực hiện

nghiên cứu: “Tình hình nhiễm Enterococcus Faecalis trên bệnh nhân có hội chứng tiết dịch ở âm đạo đến khám tại Bệnh viện Da liễu Trung ương từ 10/2014 - 3/2015” Với mục tiêu:

1 Xác định tỷ lệ nhiễm Enterococcus faecalis trên bệnh nhân có hội

chứng tiết dịch âm đạo đến khám và điều trị tại Bệnh viện Da liễu Trung ương từ 10/2014 -03/2015.

2 Đánh giá sự kháng kháng sinh của các chủng Enterococcus faecalis

phân lập được.

3.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Liên cầu khuẩn:

1.1.1 Lịch sử về liên cầu khuẩn:

Liên cầu được Billroth mô tả lần đầu tiên vào năm 1874 từ mủ của cáctổn thương viêm quầng và các vết thương bị nhiễm trùng

Năm 1880, Pasteur phân lập được liên cầu ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết.Sau đó Ogston (1881), Rosenbach (1884) đã nghiên cứu kỹ về tổ chứcbệnh lý

Năm 1919, Brown đã xếp loại liên cầu theo những hình thái tan máukhác nhau khi chúng phát triển trên môi trường thạch máu:

+ Tan máu (β): vòng tan máu trong suốt, hồng cầu bị phá hủy hoàn toàn.): vòng tan máu trong suốt, hồng cầu bị phá hủy hoàn toàn.Hình thái tan máu này gặp chủ yếu ở liên cầu nhóm A, ngoài ra còn có thểgặp ở các nhóm B, C, G, F

+ Tan máu (α): tan máu không hoàn toàn, xung qunh khuẩn lạc có vòng): tan máu không hoàn toàn, xung qunh khuẩn lạc có vòngtan máu màu xanh, thường gặp ở liên cầu viridans

+ Tan máu (γ): xung quanh khuẩn lạc không nhìn thấy vòng tan máu.): xung quanh khuẩn lạc không nhìn thấy vòng tan máu.Hồng cầu trong thạch vẫn giữ màu hồng nhạt, thường gặp đối với liên cầunhóm D

Năm 1930, Lancefield dựa vào kháng nguyên C (Carbohydrat) của vách

tế bào vi khuẩn để xếp liên cầu thành các nhóm A, B, C, … R

Sherman dựa vào tính chất sinh hóa xếp liên cầu thành các nhóm:

+ Streptococcus pyogenes.

+ Streptococcus viridans.

+ Streptococcus faecalis (hiện nay là Enterococcus faecalis).

1.1.2 Tình hình nhiễm E faecalis và sự kháng kháng sinh của E faecalis trên thế giới.

1.1.2.1 Tình hình nhiễm E faecalis trên thế giới

Trong một cuộc khảo sát được thực hiện tại Hoa Kỳ từ năm 1986 đến

năm 1997, E faecalis xuất hiện ở vị trí thứ hai trong danh sách năm tác nhân gây bệnh hàng đầu [5] E faecalis gây ra 80-90% trường hợp nhiễm khuẩn

đường ruột [6]

1.1.2.2 Tình hình kháng kháng sinh của E faecalis trên thế giới

Enterococci là vi khuẩn đề kháng tự nhiên với nhiều loại kháng sinh như

các kháng sinh thuộc phân nhóm cephalosporin, các kháng sinh nhómaminoglycoside (trừ các aminoglycoside có nồng độ cao), clindamycin và co-trimoxazol nên hiệu quả lâm sàng của các kháng sinh này trong việc điều trị

nhiễm khuẩn do Enterococci là kém, mặc dù kết quả kháng sinh đồ trên

Vancomycin là thuốc được lựa chọn để thay thế khi bệnh nhân bị dị ứng

với penicillin trong điều trị nhiễm trùng E faecalis, tuy nhiên hiện nay tình hình E faecalis kháng vancomysin đang đến mức báo động Kể từ khi báo cáo đầu tiên vào năm 1988, tỉ lệ Enterococci kháng vancomycin đã tăng từ

0,3% chủng trong 1989-1993 đến 12% trong 1998-2002 [7], dữ liệu gần đây

cho thấy rằng có đến 3% của E faecalis kháng vancomycin [8], đặt ra thách

thức trong điều trị

1.1.3 Tình hình nhiễm E faecalis và sự kháng kháng sinh của E faecalis tại Việt Nam.

1.1.3.1 Tình hình nhiễm E faecalis tại Việt Nam

Nghiên cứu tại bệnh viện quân y 103, trong số 31 trường hợp nhiễmtrùng tiết niệu có liên quan đến gia cầm, đã phát hiện 7 trường hợp (23%)

dương tính với E faecalis [9] Cũng một nghiên cứu khác được thực hiện tại đây, trong tổng số 49 bệnh nhân nhiễm trùng đường tiết niệu, E faecalis là

nguyên nhân gây ra 55,1% số ca nhiễm khuẩn [1]

1.1.3.2 Tình hình kháng kháng sinh của E faecalis tại Việt Nam

Theo một nghiên cứu tại bệnh viện Hoàn Mỹ, Đà Nẵng, thì oxacillin và

azithromycin đều bị kháng ở các mẫu thử nghiệm với Enterococci, các kháng sinh còn hiệu lực tốt với Enterococci là ofloxacin, piperacillin/tazobactam,

vancomycin và teicoplanin: nhạy cảm 100%; cefoperazon/sulbactam vàmoxifloxacin: nhạy cảm 75% Còn lại các kháng sinh thường dùng khác đều

bị đề kháng từ 33-50% [10]

1.1.4 Đặc điểm sinh học

1.1.4.1 Hình thể và tính chất bắt màu

Hình 1.1 Vi khuẩn E faecalis nhuộm Gram

E faecalis là những cầu khuẩn bắt màu Gram dương, xếp thành chuỗi

dài ngắn khác nhau, không di động, đôi khi có vỏ, đường kính 0,6 – 1 μm m

1.1.4.2 Tính chất nuôi cấy

E faecalis là những vi khuẩn hiếu kỵ khí tùy tiện Môi trường nuôi cấy cần nhiều chất dinh dưỡng như máu, huyết thanh, đường,vv E faecalis phát

triển thuận lợi trong khí trường có oxy hoặc có 5 – 10 % CO2.

Nhiệt độ thích hợp cho E faecalis sinh trưởng và phát triển là 30 - 35oC

E faecalis có thể sống sót trên các môi trường: pho mát- 180 ngày, đất lên

đến 77 ngày Chúng không chịu được sự thanh trùng, ở môi trường có pH <

6,3, chất kháng sinh, chất sát trùng E faecalis không tạo độc tố, lên men

glucose, sinh acid làm giảm pH môi trường

Hình 1.2 Khuẩn lạc của E faecalis trên thạch máu

Sau khi nuôi cấy trong môi trường thạch máu 24h, E faecalis tạo thành

những khuẩn lạc có đường kính từ 1-2mm mặc dù cũng xuất hiện nhiều kích

cỡ nhỏ hơn E faecalis gây tan máu beta trên thạch máu.

Trên môi trường lỏng, E faecalis phát triển hình thành các chuỗi đến khi

đủ lớn thì tạo thành những hạt nhỏ hoặc những hạt như bông rồi lắng xuốngđáy ống Vì vậy, sau 24h nuôi cấy, môi trường phía trên trong suốt, đáy ống

có nhiều hạt lắng cặn

Các môi trường được sử dụng để nuôi cấy E faecalis hiện được sử dụng là: thạch máu, môi trường giàu dinh dưỡng (môi trường Columbia, môi trường Todd – Hewitt), môi trường chứa kháng sinh chọn lọc vi khuẩn và các loại môi trường chọn lọc giàu chất dinh dưỡng (môi trường selective LIM, môi trường selective Todd – Hewitt).

1.1.4.3 Tính chất hóa sinh học

E faecalis không có men catalase, chúng có khả năng phát triển trong

môi trường có mật, muối mật hoặc ethyl – hydrocuprein

1.1.4.4 Cấu trúc kháng nguyên

E faecalis là liên cầu có cấu trúc kháng nguyên phức tạp.Vì vậy ở đây

chỉ đề cập đến những kháng nguyên quan trọng liên quan đến độc lực, cơ chếgây bệnh của liên cầu

Kháng nguyên C: đặc hiệu nhóm

Đây là kháng nguyên nằm ở vách tế bào vi khuẩn Dựa vào carbohydrate

C, Lancefield xếp liên cầu thành các nhóm từ A đến R

Kháng nguyên M: đặc hiệu typ

Kháng nguyên M cũng nằm ở vách tế bào vi khuẩn Dựa vào kháng nguyênnày, Lancefield xếp liên cầu nhóm A thành 80 type huyết thanh khác nhau

Protein M nằm rải rác trên bề mặt tế bào, gắn ở rìa tế bào nên dễ dàng kếthợp với kháng thể kháng protein M thậm chí ngay cả khi có mặt của acidhyaluronic

Ngoài ra, protein M có khả năng chống lại thực bào, vì vậy nó có liênquan trực tiếp tới độc lực của liên cầu.Kháng nguyên M bị thủy phân bởi mentrypsin hoặc pepsin

Những kháng nguyên khác của liên cầu

Kháng nguyên T: là protein của vách tế bào vi khuẩn, bị phá hủy bởinhiệt độ ở PH acid

Kháng nguyên P: bản chất là nucleoprotein Kháng nguyên này có phảnứng chéo với nucleoprotein của tụ cầu

Kháng nguyên R: bản chất là protein, nằm ở vách tế bào vi khuẩn Khángnguyên R có ở các typ M 2, 3, 28, 33, 43 và 48 của liên cầu nhóm A giống

như một số typ huyết thanh của nhóm khác như: nhóm B, G, C, L chúng cóphản ứng chéo giữa các typ huyết thanh hoặc giữa các nhóm.

Kháng nguyên R đề kháng với trypsin

Glycerol teichoic acid: chiếm xấp xỉ 1% trọng lượng khô của tế bào, làkháng nguyên đặc hiệu của nhóm D và N, không có ở các nhóm khác

Streptodornase

Tillett đã mô tả enzyme treptodornase có 4 loại A, B, C, D và 4 loại này

là những kháng nguyên khác nhau, có khả năng kích thích cơ thể hình thànhkháng thể đặc hiệu Streptodornase có khả năng phân hủy AND, do đó làmlỏng mủ, nhưng nó chỉ có tác dụng khi có mặt của ion Mg

Hyaluronidase

Thủy phân acid hyaluronic của tổ chức, tạo điều kiện cho vi khuẩn lantràn sâu rộng vào các mô Enzym này là một kháng nguyên có khả năng kíchthích cơ thể hình thành kháng thể antistreptohyaluronidase

DPNase

Được tìm thấy ở liên cầu nhóm A, C, G, là enzym có khả năng diệt bạchcầu.Enzym này có khả năng kích thích cơ thể hình thành kháng thể

Proteinase

Có khả năng thủy phân protein và có khả nang kích thích cơ thể hìnhthành kháng thể.

Dung huyết tố

Liên cầu tan máu β): vòng tan máu trong suốt, hồng cầu bị phá hủy hoàn toàn có khả năng hình thành hai loại dung huyết tố:

Streptolysin O: dễ bị mất hoạt tính bởi oxy, vì thế trên môi trường nuôicấy, chúng gây tan máu ở phía sâu trong thạch Độc tố này mang tất cả cáctính chất của một ngoại độc tố: đặc biệt là có tính kháng nguyên mạnh, vì thế

có khả năng kích thích cơ thể hình thành kháng thể (antistreptolysin O).Trong chẩn đoán bệnh thấp tim và viêm cầu thận cấp, việc định lượng khángthể kháng streptolysin O là rất có giá trị

Streptolysin S: có vai trò gây tan máu ở bề mặt của môi trường nuôi cấy.Độc tố này không bị mất hoạt tính bởi oxy, tính kháng nguyên kém, vì vậykhông kích thích cơ thể hình thành kháng thể

Độc tố hồng cầu

Bản chất là protein gây phát ban trong bệnh tinh hồng nhiệt

Cơ chế hoạt động của độc tố chưa rõ rang, nhưng khi tiêm vào trong dacủa trẻ em dễ mẫn cảm, có thể gây nên phản ứng ban đỏ tại chỗ, phản ứng đạtcao nhất 24h sau khi tiêm Khi bệnh nhân có kháng độc tố thì phản ứng ở da

âm tính (Disk test) Phản ứng Schultz – Charton: tiêm trong da một lượngkháng độc tố tương ứng lúc cao điểm của bệnh tinh hồng nhiệt thì chỗ tiêmmất ban đỏ

1.1.5 Khả năng gây bệnh

E faecalis là vi khuẩn sống trong vi hệ bình thường của người, chúng là

một trong những nguyên nhân gây các nhiễm trùng cơ hội, đặc biệt là ở ngườicao tuổi, bệnh nhân có các bệnh nặng và suy giảm miễn dịch, bệnh nhân nhậpviện trong thời gian dài, bệnh nhân được điều trị với thiết bị xâm lấn, hoặc

được điều trị với các kháng sinh phổ rộng Các vi sinh vật này bắt đầu đượccông nhận là nguyên nhân của nhiễm khuẩn bệnh viện với tần số lớn vào cuối

năm 1970, E faecalis đã nổi lên như là một trong những thách thức hàng đầu

trong điều trị khi nó kết hợp với các nhiễm trùng nghiêm trọng hơn đe dọa tới

tính mạng con người E faecalis đã trở thành nguyên nhân xếp hàng thứ hai,

hoặc thứ ba của các nhiễm khuẩn bệnh viện đường tiết niệu, gây nhiễm trùng vếtthương (chủ yếu là phẫu thuật, vết loét và vết bỏng), và nhiễm khuẩn huyết [11]

1.1.6 Cơ chế bệnh sinh

Âm đạo là một xoang mở của cơ thể, chứa dịch tiết của đường sinh dụcnên trở thành môi trường sống lý tưởng của các vi sinh vật bao gồm cả cácloại vi khuẩn của da và các vi sinh vật từ đường ruột Mỗi ml dịch âm đạochứa 108 -109 vi khuẩn bao gồm các vi khuẩn thường trú không gây bệnh và

những vi sinh vật cơ hội Các tác nhân cơ hội (E faecalis) sẽ gây bệnh khi

chúng hiện diện với số lượng cao và hoặc khi có đường vào Các vi sinh vậtgây bệnh khi xâm nhập sẽ luôn gây ra tổn thương Để tự bảo vệ, ngoài sự bềnvững của biểu mô vẩy, âm đạo còn cần có sự hiện diện và phát triển ưu thếcủa chủng vi khuẩn bảo vệ là Lactobacilli (khoảng 7 loại, là trực khuẩn Gramdương hiếu khí có nguồn gốc từ đường ruột)

Dưới tác dụng của estrogen trong lứa tuổi sinh đẻ, biểu mô âm đạo pháttriển với sự hình thành thêm lớp tế bào trung gian và lớp tế bào bề mặt chứanhiều glycogen Khi tế bào bề mặt bong ra, Lactobacilli sử dụng nguồnglycogen này và chuyển hóa thành acid lactic, làm cho môi trường âm đạo có

PH = 3,8 – 4,7 Ngoài nồng độ PH thấp giúp ngăn cản sự phát triển của các visinh vật gây bệnh, trong âm đạo còn có những loại Lactobacilli tạo ra H2O2

góp phần tiêu diệt các tác nhân gây bệnh khác Thói quen thụt rửa âm đạo vớidung dịch sát khuẩn hoặc tự ý dung thuốc đặt âm đạo sẽ phá hủy phổ vi trùng

bình thường, tạo điều kiện cho các tác nhân gây bệnh phát triển

Lượng Lactobacilli trong âm đạo của phụ nữ mang thai nhiều hơn phụ nữkhông mang thai Tuy nhiên, sự cung cấp máu cho âm đạo tăng khi mang thailàm tăng sự thẩm thấu của huyết thanh, kết quả là khí hư sinh lý cũng nhưtính acid của âm đạo tăng lên Ngoài ra, thai phụ có những thay đổi sinh lýkhác như tình trạng ức chế miễn dịch và nồng độ progesterone tăng làm tăngkhả năng kết dính của các tác nhân gây bệnh vào tế bào biểu mô âm đạo

1.1.7 Chẩn đoán Enterococcus faecalis trong phòng thí nghiệm

Chẩn đoán E faecalis gây hội chứng tiết dịch âm đạo là phát hiện hình

thể của vi khuẩn, nuôi cấy phân lập và phát hiện kháng nguyên, kháng thể

Các phương pháp chẩn đoán E faecalis trong phòng thí nghiệm được sử

dụng hiện nay bao gồm: nhộm soi, nuôi cấy phân lập, miễn dịch và sinh họcphân tử, cụ thể là:

+ Nhuộm Gram: Trên tiêu bản nhuộm Gram, vi khuẩn có hình cầu bắtmàu Gram dương, xếp thành chuỗi

+ Nuôi cấy phân lập: Bệnh phẩm dịch tiết âm đạo được cấy vào môi

trường thạch máu, sau 24h, E faecalis tạo thành những khuẩn lạc có đường kính từ 1-2mm E faecalis gây tan máu beta trên thạch máu.

+ Thử nghiệm Catalase: giúp phân biệt với Staphylococci (cũng là cầu

khuẩn Gram dương)

+Thử nghiệm Bile Esculin: dương tính

+ Phản ứng ngưng kết Latex hoặc thử nghiệm huỳnh quang miễn dịch: để

định nhóm liên cầu khuẩn theo phân loại Lancefield

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng

Là 510 bệnh nhân có hội chứng tiết dịch âm đạo đến khám tại bệnh viện

Da liễu Trung Ương từ 10/2014 – 3/2015

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn

Tất cả các bệnh nhân nữ có hội chứng tiết dịch âm đạo đến khám vàđồng ý tham gia nghiên cứu và thực hiện đúng quy trình nghiên cứu

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ

- Đang dùng thuốc kháng sinh trước thời điểm lấy bệnh phẩm ít hơn 7ngày

- Bệnh nhân HIV- AIDS có hội chứng tiết dịch âm đạo

- Bệnh nhân đang hành kinh, rong kinh, rong huyết, xuất huyết âm đạo

- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.4 Vi khuẩn nghiên cứu

Vi khuẩn gây hội chứng tiết dịch âm đạo được đề cập đến trong nghiên

cứu là vi khuẩn Enterococcus faecalis.

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Trang thiết bị - dụng cụ - hóa chất – sinh phẩm

2.2.1.1 Dụng cụ:

- Bàn khám phụ khoa

- Săng phụ khoa

- Bộ thuốc nhuộm Gram.

- Các khoanh giấy kháng sinh

Hình 2.1 Trang thiết bị, dụng cụ và sinh phẩm sử dụng cho

chẩn đoán E faecalis.

Bảng 2.1 Các khoanh giấy kháng sinh

STT Kháng sinh Kí hiệu Nồng độ (µg) Hãng sản xuất

Strep A Grouping Latex (DR0701G)

Strep B Grouping Latex (DR0702G)

Strep C Grouping Latex (DR0703G)

Strep D Grouping Latex (DR0704G)

Strep F Grouping Latex (DR0705G)

Strep G Grouping Latex (DR0706G)

Sáu chai nhỏ giọt, mỗi loại đặc trưng cho mỗi nhóm A, B, C, D, F và G,mỗi chai chứa hạt latex xanh nhạy cảm với kháng thể IgG của thỏ, hiệu quảcho 60 test, với 0,098% sodium azide và 0,05% chất bảo quản ProClin 300.Bảo quản 2 - 80C; ổn định cho đến ngày hạn sử dụng ghi trên nhãn Trước khidùng, hòa tan các hạt bằng cách vortex nhẹ nhàng chai hoặc bằng cách trộnđảo ngược

Hai chai chứa 10ml dung dịch trung hòa không màu với 0,098%sodium azide như là chất bảo quản Giữ thẳng đứng và vặn chặt nắp; ổn định

ở nhiệt độ phòng (15-300C) cho đến hạn sử dụng ghi trên nhãn

2.2.2 Môi trường phân lập vi khuẩn Enterococus faecalis

E faecalis là các vi khuẩn hiếu kỵ khí tùy tiện Các môi trường để nuôi cấy E faecalis ủ ở 370C ở tủ ấm bình thường hoặc tủ ấm có 5 – 10 % CO2

- Môi trường thạch máu

- Môi trường Uriselect 4

- Canh thang Todd – Hewitt

2.2.3 Môi trường xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh

Môi trường Mueller – Hinton

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp mô tả cắt ngang

xoay nhẹ tăm bông để 5-10 giây cho dịch thấm vào tăm bông, dàn mỏng bệnhphẩm lên tiêu bản

- Hai bên tuyến Skène và tuyến Bartholin: Lấy bệnh phẩm bằng que cấyhoặc tăm bông vô trùng rồi dàn đều bệnh phẩm lên tiêu bản

Chú ý khi lấy bệnh phẩm:

Đối với bệnh nhân chưa có gia đình hoặc bệnh nhân có thai không nên đặt

mỏ vịt mà chỉ dùng que cấy hoặc tăm bông lấy bệnh phẩm ở thành âm đạo

Ở những phụ nữ đã cắt bỏ tử cung, mẫu được lấy ở cùng đồ sau của âm đạo

2.3.5 Xác định vi khuẩn E faecalis

- Kỹ thuật nhuộm Gram [12]

(1) Dàn bệnh phẩm lên trên lam kính sạch

(2) Cố định bằng cách hơ qua trên ngọn lửa đèn cồn Để nguội

(3) Nhuộm:

Nhỏ dung dịch tím gentian, phủ kín nơi dàn đồ phiến, duy trì 1 phút

Đổ dung dịch tím gentian, rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ

Nhỏ dung dịch lugol, để 30 giây

Đổ dung dịch lugol, rủa nước

Tẩy màu: nhỏ vài giọt cồn 90% lên tiêu bản, nghiêng đi nghiêng lại đểcho cồn chảy từ cạnh nọ sang cạnh kia Khi thấy màu tím trên lam kính vừaphai thì rửa nước ngay

Nhỏ dung dịch đỏ fuchsin, để 1 phút

Rửa nước kỹ, để tiêu bản khô, soi kính hiển vi

- Kỹ thuật nuôi cấy và phân lập vi khuẩn:

Lấy bệnh phẩm như đối với kỹ thuật lấy bệnh phẩm nhuộm soi trực tiếp

• Cấy bệnh phẩm trên môi trường thạch máu bằng kỹ thuật cấy phânvùng hoặc cấy theo đường zíc zắc

• Để đĩa thạch vào tủ ấm ở nhiệt độ 35-360C, khí trường 3-10% CO2,độ

- Phản ứng xác định nhóm liên cầu khuẩn

Nguyên lý của kỹ thuật: Trong quy trình PathoDxtra, kháng thể đặc hiệu

trên các hạt latex phản ứng với kháng nguyên nhóm liên cầu khuẩn được chiếtxuất từ thành tế bào vi khuẩn và xảy ra ngưng kết Trong trường hợp có mặtkháng nguyên liên cầu khuẩn, các hạt nhạy cảm tạo thành một khối ngưng kếthạt riêng biệt và có thể đọc được rõ ràng, ngược lại sự xuất hiện một màutrắng đục đều là phản ứng âm tính

Các bước tiến hành:

- Quá trình chọn khuẩn lạc có thể được xem là đủ khi lượng khuẩn lạc cómặt đáp ứng được yêu cầu thử nghiệm (4 khuẩn lạc cho mỗi nhóm thuốc thửhoặc 20 khuẩn lạc cho toàn bộ nhóm)

- Dùng tăm lấy mẫu 4 khuẩn lạc phân lập được (lấy nhiều hơn 4 khuẩnlạc nếu lượng khuẩn lạc ít hoặc ít hơn 18h nuôi cấy)

- Dàn trải toàn bộ khuẩn lạc vào trung tâm của vòng tròn trên thanhPathoDxtra

- Lặp lại bước 1, 2 cho mỗi thuốc thử được sử dụng

- Thêm 1 giọt Strep A Latex bằng cách bóp nhẹ vào chai theo vị trí thẳngđứng vào ô tròn đầu tiên, sau đó nhỏ 1 giọt Strep B Latex vào ô thứ hai Tiếptục tương tự, thêm Strep C, D, F, G Latex vào 4 ô còn lại.

- Trộn đều latex bằng một thanh que trộn, và sau đó làm sạch xungquanh các ô tròn

- Giữ thanh PathoDxtra dưới ánh sáng thích hợp và di chuyển nhẹ nhàngqua lại Phản ứng ngưng kết với thuốc thử latex thường xảy ra trong thời giankhoảng 10 giây Dừng lại khi có phản ứng rõ ràng xảy ra mà ta có thể quansát được và ghi lại kết quả Không di chuyển thanh PathoDxtra dưới ánh sáng

+ Ngưng kết xấp xỉ bằng với hơn một loại thuốc thử latex (hiếm có

trường hợp hơn hai) Giải thích: hai nhóm streptococcal với hình thái tương

tự và có khả năng tán huyết β): vòng tan máu trong suốt, hồng cầu bị phá hủy hoàn toàn.-haemolysis cùng xuất hiện trên đĩa cấy Kiểmtra lại, sử dụng khuẩn lạc tinh khiết sau khi phân lập lại

+ Có hơn một nhóm kháng nguyên có mặt trong thử nghiệm

- Ngưng kết không đặc hiệu: Có ít nhất hai loại ngưng kết không đặchiệu có thể quan sát trong thử nghiệm latex.

Một vài chủng vi khuẩn có bao nhầy có thể không ngưng kết đặc hiệutrên latex, có thể do bẫy vật lý của các hạt trong nguyên liệu được chiết xuất.Điều này liên quan nhiều hơn khi sử dụng khuẩn lạc trực tiếp

Các tiêu chuẩn chẩn đoán xác định vi khuẩn E faecalis:

- Nhuộm soi: bằng phương pháp nhuộm Gram, trên tiêu bản nhuộm, vi

khuẩn có hình cầu bắt màu Gram dương, xếp thành chuỗi

- Nuôi cấy: Sau 18-24 giờ nuôi cấy, E faecalis tạo thành những khuẩn

lạc màu tro xám, có đường kính khoảng 1 mm, dạng S, tròn, lồi, nhẵn, bóng

E faecalis gây tan máu beta trên thạch máu Lấy khuẩn lạc nhuộm soi thấy

cầu khuẩn xếp chuỗi, bắt màu Gram dương Trên môi trường thạch Uriselect 4,

E faecalis cho khuẩn lạc màu xanh nhạt

Hình 2.2 Vi khuẩn E faecalis trên môi trường thạch Uriselect 4.

 Mục đích: xác định khả năng thủy giải glucoside esculin thành esculetin

và glucose khi có sự hiện diện của muối mật

 Môi trường Bile Esculine Agar

Hình 2.3 Khuẩn lạc E faecalis trên môi trường Bile Esculine Agar.

Đủ những tiêu chuẩn trên kết luận: E faecalis (+).

Kỹ thuật kháng sinh đồ [12]

Nguyên lý: Kháng sinh được thấm vào những khoanh giấy tròn, thường

có đường kính là 6 mm, được đặt tại một điểm trên mặt đĩa thạch Kháng sinh

từ khoanh giấy khuếch tán ra xung quanh Độ khuếch tán phụ thuộc vào tínhchất từng loại kháng sinh và độ dày của môi trường.Vì vậy, càng xa nơi đặtkhoanh giấy nồng độ kháng sinh càng thấp và ngược lại, càng gần nơi đặtkhoanh giấy nồng độ kháng sinh càng cao

Để chọn được kháng sinh thích hợp cho điều trị, cần phải đặt đủ cho 8nhóm kháng sinh, mỗi khoanh giấy thấm một kháng sinh với hàm lượng nhấtđịnh (tùy theo hãng sản xuất), mỗi đĩa petri (đường kính 90 mm) thường đặt 6khoanh giấy kháng sinh

Cách tiến hành:

 Sử dụng môi trường Mueller – Hinton để tiến hành kỹ thuật.

 Lấy khuẩn lạc E faecalis nuôi cấy 18-24 giờ, hòa đều với nước muối

sinh lý 0,9%, so với độ đục tiêu chuẩn Mc Farland 0,5 (tương đươngvới 3x108 vi khuẩn/1ml) Dùng pipette Pasteur hút huyền dịch láng đềulên bề mặt đĩa thạch có đường kính 9 cm với độ dày 4 cm Hút bỏhuyền dịch thừa trên mặt đĩa thạch

Trước hết kiểm tra mật độ khuẩn lạc: nơi không có kháng sinh hoặc nồng

độ kháng sinh thấp không đủ ức chế được vi khuẩn, chúng sẽ mọc thànhnhững khuẩn lạc dày sát nhau, nhưng không được dày quá, thành các thảmhoặc thưa quá, còn khe hở giữa các khuẩn lạc Vì mật độ vi khuẩn quá dày sẽthu nhỏ đường kính vùng ức chế và ngược lại quá thưa sẽ mở rộng đườngkính vùng ức chế so với chuẩn, điều này sẽ làm sai lệch kết quả

Dùng thước đo đường kính vùng ức chế tính ra mm

Đo và nhận định kết quả các chủng mẫu bằng cách so vào bảng giới hạndành cho chủng mẫu để kiểm tra chất lượng xét nghiệm bao gồm nhiều yếu tố

kỹ thuật; ví dụ: hoạt tính của khoanh giấy kháng sinh, nếu đạt yêu cầu mớiđọc kết quả của các chủng phân lập được

Đo đường kính vùng ức chế ở các chủng phân lập được từ người bệnh sovào bảng giới hạn đường kính vùng ức chế xếp loại độ nhạy cảm của vi khuẩnvới kháng sinh (CLSI, 2010) để xếp loại “đề kháng – resistan – R” hoặc