Theo dõi khả năng kháng thuốc diệt cỏ của dòng đậu tương chuyển gen ĐVN9 qua các thế hệ T1 T2 và T3.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐÀO QUANG THƯỚNG Tên đề tài: THEO DÕI KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ CỦA DÒNG ĐẬU TƯƠNG ĐVN9 CHUYỂN GEN QUA CÁC THẾ HỆ T 1 , T 2 VÀ T 3 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Khóa học : 2010- 2014 Thái Nguyên, 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐÀO QUANG THƯỚNG Tên đề tài: THEO DÕI KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ CỦA DÒNG ĐẬU TƯƠNG ĐVN9 CHUYỂN GEN QUA CÁC THẾ HỆ T 1 , T 2 VÀ T 3 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Khóa học : 2010- 2014 Ngư ời hướng dẫn : TS. Nguyễn Văn Duy Khoa CNSH – CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, 2014 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp tại phòng thí nghiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm vừa qua, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ ban chủ nhiệm khoa, giảng viên hướng dẫn, cán bộ kỹ thuật tại phòng thí nghiệm, thầy cô, gia đình và bạn bè. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Nguyễn Văn Duy đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn KS. Lã Văn Hiền đã tận tình hướng dẫn cũng như tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện đề tài trong suốt thời gian thực tập tại phòng thí nghiệm và hoàn thành khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể gia đình, bạn bè đã hết lòng giúp đỡ, động viên tạo điều kiện vật chất cũng như tinh thần cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên không thể tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được sự góp ý, nhận xét của các thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 03 tháng 06 năm 2014 Sinh viên thực hiện Đào Quang Thướng DANH MỤC BẢNG BIỂU Trang Bảng 2.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đây 5 Bảng 2.2. Tình hình sản xuất đậu tương của các nước đứng đầu thế giới 5 Bảng 2.3. Các nước nhập khẩu đậu tương hàng đầu châu Á 6 Bảng 2.4. Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam những năm gần đây 7 Bảng 3.1. Mật độ gieo trồng 19 Bảng 4.1. Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1 sau 5 ngày 24 Bảng 4.2. Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của dòng đậu tương chuyển gen ở thế hệ T2 sau 5 ngày 26 Bảng 4.3. Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của dòng đậu tương chuyển gen ở thế hệ T3 28 Bảng 4.4. Kết quả phân tích PCR thế hệ T1 32 Bảng 4.5. Kết quả phân tích PCR thế hệ T2 34 Bảng 4.6. Kết quả phân tích PCR thế hệ T3 35 DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 4.1. Một số hình ảnh đánh giá kháng thuốc diệt cỏ các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T1 25 Hình 4.2. Một số hình ảnh đánh giá kháng thuốc diệt cỏ các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T2 27 Hình 4.3. Một số hình ảnh đánh giá kháng thuốc diệt cỏ các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T3 29 Hình 4.4. Phương pháp đánh giá kháng thuốc trừ cỏ của Zhang-yue Song và cs 29 Hình 4.5. Sản phẩm DNA tổng số của các dòng đậu tương thế hệ T1 30 Hình 4.6. Sản phẩm DNA tổng số của các dòng đậu tương thế hệ T2 30 Hình 4.7. Sản phẩm DNA tổng số của các dòng đậu tương thế hệ T2 31 Hình 4.8. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR gen bar thế hệ T1 32 Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen bar thế hệ T2 33 Hình 4.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen bar thế hệ T3 34 6 DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Bar : Baialaphos resistance BNN&PTNT : Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Bt : Bacillus thuringiensis var. Kurstaki Cs : Cộng sự CT : Công thức CTAB : Cetyl-trimethyl ammonium bromide Đ/c : Đối chứng EDTA : Ethyenediamine tetraacetate Nxb : Nhà xuất bản FAO : Food and Agriculture oganization of the United Nations Gus : B-1,4- Glucoronidase GNA : Galanthus Nivalis Agglutinin PCR : Polymerase chain reaction PPT : phosphinothricin T 0 : Thế hệ cây chuyển gen đầu tiên thu được sau tái sinh (Ví dụ:D35) T 1 : Thế hệ thứ nhất của cây T 0 (Ví dụ: D35.1; D35.2; D35.3.v.v ) T 2 : Thế hệ thứ hai của cây T 0 (Ví dụ: D35.1.1; D35.2.1;.v.v ) T 3 : Thế hệ thứ ba của cây T 0 (Ví dụ: D35.1.1.2; D35.2.1.1;.v.v ) TB : Trung bình USD : United states dollar 7 MỤC LỤC Trang PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài 9 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 2.1. Giới thiệu chung về đậu tương 11 2.1.1. Nguồn gốc 11 2.1.2. Phân loại 11 2.1.3. Giá trị cây đậu tương 11 2.2. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam 12 2.2.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới 12 2.2.2. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam 14 2.3. Ảnh hưởng của cỏ dại đối với cây trồng 15 2.3.1. Đặc tính của cỏ dại 15 2.3.2. Tác hại của cỏ dại đối với cây trồng 17 2.4. Biện pháp phòng trừ cỏ dại 18 2.4.1. Biện pháp cơ học 18 2.4.2. Biện pháp hóa học 20 2.4.3. Biện pháp sinh học 21 2.5. Tình hình sản xuất cây đậu tương biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam 22 2.5.1. Tình hình đậu tương biến đổi gen trên thế giới 22 2.5.2. Tình hình đậu tương biến đổi gen tại Việt Nam 22 2.6. Một số nghiên cứu về đặc tính kháng thuốc diệt cỏ cho cây trồng 23 2.6.1. Giới thiệu về gen kháng thuốc diệt cỏ 23 2.6.2. Cơ chế hoạt động của gen kháng thuốc diệt cỏ 23 2.6.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây trồng hiện nay 24 PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1. Vật liệu nghiên cứu 25 3.1.1. Vật liệu thực vật 25 3.1.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 25 3.1.2.1. Hóa chất 25 3.1.2.2. Thiết bị thí nghiệm 25 3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 26 8 3.2.1. Phạm vi nghiên cứu 26 3.2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26 3.3. Nội dung nghiên cứu 26 3.4. Phương pháp nghiên cứu 26 3.4.1. Phương pháp đánh giá khả năng kháng thuốc trừ cỏ và kháng sâu của dòng đậu tương chuyển gen ĐVN9 ở thế hệ T1, T2, T3. 26 3.4.2. Phương pháp phát hiện gen Bar bằng phương pháp sinh học phân tử. 29 3.4.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số 29 3.4.2.2. Phương pháp phân tích PCR xác định sự có mặt của gen kháng thuốc diệt cỏ Bar với cặp mồi đặc hiệu. 30 3.4.2.3. Phương pháp điện di sản phẩm DNA tổng số và PCR sản phẩm 31 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1. Đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ trên đồng ruộng 32 4.1. 1. Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của dòng đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1 32 4.1.2. Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của dòng đậu tương chuyển gen ở thế hệ T2 33 4.1.3. Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của dòng đậu tương chuyển gen ở thế hệ T3 36 4.2. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá đậu tương 38 4.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá đậu tương thế hệ T1 38 4.2.2. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá đậu tương thế hệ T2 38 4.2.3. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá đậu tương thế hệ T3 39 4.3. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen bar qua các thế hệ T1, T2 và T3 39 4.3.1. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen bar qua thế hệ T1 39 4.3.2. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen bar qua thế hệ T2 41 4.3.3. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen bar qua thế hệ T3 42 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 5.1. Kết luận 45 5.2. Đề nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 9 PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Đậu tương (Glycine max (L.) Merr.) là một cây trồng cạn ngắn ngày phổ biến trên thế giới và Việt Nam. Đậu tương có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao. Hàm lượng protein trung bình khoảng 35,5- 40%, lipit từ 15- 20%, hydratcacbon từ 15- 16% cùng nhiều loại vitamin và muối khoáng cần thiết. Do vậy đậu tương được dùng làm thực phẩm cho con người, thức ăn chăn nuôi, nguyên liệu công nghiệp, và là mặt hàng xuất khẩu. Việc phát triển cây đậu tương là một trong những biện pháp nhanh chóng khắc phục tình trạng thiếu hụt protein ở các nước nghèo [4]. Riêng đối với Việt Nam là nước nông nghiệp nhiệt đới trồng đậu tương với ba mục đích giải quyết vấn đề thiếu protein cho người và gia súc, xuất khẩu và cải tạo đất [11]. Hiện nay, nước ta đang phải nhập khẩu đậu tương do nhu cầu trong nước tăng cao. Sản lượng sản xuất còn thấp chưa đủ để cung ứng. Một trong những lý do dẫn đến sản lượng thấp là do cỏ dại và sâu hại. Sâu hại là nhân tố thứ nhất ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng đậu tương. Đậu tương thường bị các loại sâu hại chính như: sâu cuốn lá, sâu đục quả, sâu đục thân, sâu khoang Ngoài ra, Cây đậu tương có thể bị gây hại bởi virus, tuyến trùng và côn trùng. Những tác nhân gây bệnh và sâu hại có thể gây ra thiệt hại trong hạt, rễ, thân, lá, cành, quả và thường là những mô cụ thể [19]. Cỏ dại là nhân tố thứ hai có tác động trực tiếp đến sinh trưởng và phát triển của đậu tương. Nó có thể cạnh tranh về ánh sáng, dinh dưỡng, nước và là trung gian truyền bệnh cho đậu tương. Do vậy, các biện pháp phòng trừ cỏ dại và sâu hại luôn được quan tâm. Biện pháp phòng trừ hóa học là biện pháp chính đang được sử dụng thường gây ảnh hưởng xấu đến con người và môi trường sinh thái. Chi phí cho phòng trừ cỏ dại, sâu hại là thiệt hại lớn nhất trong sản xuất đậu tương [4]. Các biện pháp sinh học hiện đại hướng đến cải thiện các đặc tính của cây trồng. Trong đó nghiên cứu tăng cường khả năng kháng thuốc diệt cỏ, kháng sâu bằng các biện pháp công nghệ sinh học đang được quan tâm xuất phát từ yêu cầu của thực tiễn sản xuất đậu tương trên thế giới và ở nước ta. Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã thành công trong việc tạo ra các dòng đậu tương chuyển gen 10 kháng thuốc diệt cỏ và kháng sâu từ các giống đậu tương của Việt Nam năm 2010. Tuy nhiên sự biểu hiện của các gen chuyển này chưa được nghiên cứu qua các thế hệ. Từ thực tế đó tôi đã tiến hành thực hiện nghiên cứu đề tài: “Theo dõi khả năng kháng thuốc diệt cỏ của dòng đậu tương chuyển gen ĐVN9 qua các thế hệ T1, T2 và T3”. [...]... khổ của đề tài, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của các dòng đậu tương chuyển gen ĐVN9 Thí nghiệm được tiến hành từ thế hệ T1 đến thế hệ T3 thu được kết quả như sau: 4.1 Đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ trên đồng ruộng 4.1 1 Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của dòng đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1 Tiến hành đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của các dòng. .. Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T2 được thể hiện trong bảng 4.2 Từ kết quả theo dõi trong bảng 4.2 cho thấy tỷ lệ kháng thuốc diệt cỏ Basta 0,3% của các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T2 dao động từ 50,0 – 75,0% Dòng kháng cao nhất là D12.2, D12.1 và D21.3 với tỷ lệ kháng 75,0% So sánh tỷ lệ kháng thuốc diệt cỏ với các dòng thế hệ T1 có sự chênh... cây theo dõi, tỷ lệ kháng trung bình chỉ tính của các dòng chuyển gen Tiến hành đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của các dòng đậu tương chuyển gen trên đồng ruộng ở 2 giai đoạn Kết quả theo dõi biểu hiện gen kháng thuốc diệt cỏ thông qua biểu hiện của lá cây bị cháy và cây bị chết sau khi phun 3- 5 ngày thuốc diệt cỏ Basta 0,3% cho các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T3, kết quả được trình bày qua. .. Phương pháp đánh giá khả năng kháng thuốc trừ cỏ và kháng sâu của dòng đậu tương chuyển gen ĐVN9 ở thế hệ T1, T2, T3 - Thí nghiệm 1: Theo dõi khả năng kháng thuốc trừ cỏ của dòng đậu tương chuyển gen ĐVN9 ở thế hệ T1, T2, T3 + Nội dung tiến hành: Thu hạt của cây T0, T1, T2, trồng riêng rẽ, mỗi cây được kí hiệu thành một dòng riêng biệt Tiến hành gieo trồng, chăm sóc theo giá trị canh tác và giá trị sử dụng... gen kháng thuốc diệt cỏ thông qua biểu hiện của lá cây bị cháy và cây bị chết sau khi phun thuốc diệt cỏ Basta 0,3% 3- 5 ngày cho các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T1, kết quả được trình bày qua bảng 4.1 Bảng 4.1 Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1 sau 5 ngày Số cây không kháng thuốc diệt cỏ Basta Tỉ lệ kháng thuốc diệt cỏ Basta (%) Tên dòng Số cây... chứng ĐVN9 không chuyển gen (0,0%) So sánh giữa các dòng, từ bảng 4.1 cho thấy kết quả kháng thuốc diệt cỏ của 6 dòng đậu tương chuyển gen có sự chênh lệch đáng kể Điều này cho thấy kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của 6 dòng chuyển gen này chịu sự chi phối của yếu tố giống Hình 4.1 Một số hình ảnh đánh giá kháng thuốc diệt cỏ các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T1 Thí nghiệm kiểm tra kháng. .. 59 63,1% 35 Tương tự như cách thực hiện trên mẫu cây T1 Tiến hành đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của các dòng đậu tương chuyển gen trên đồng ruộng ở 2 giai đoạn Kết quả theo dõi biểu hiện gen kháng thuốc diệt cỏ thông qua biểu hiện của lá cây bị cháy và cây bị chết sau khi phun 3- 5 ngày thuốc diệt cỏ Basta 0,3% cho các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T2, kết quả được trình bày qua bảng 4.2... kháng thuốc diệt cỏ các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T2 Thí nghiệm kiểm tra kháng thuốc diệt cỏ Basta 0,3% (a, b, c - cây chuyển gen; d - cây đối chứng) Hình a: lá cây chuyển gen có biểu hiện vàng Hình b, c: lá cây chuyển gen có biểu hiện kháng, màu xanh bình thường Hình d: lá cây đối chứng có dấu hiệu vàng và cháy 36 4.1.3 Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của dòng đậu tương chuyển gen. .. khả năng kháng thuốc diệt cỏ theo phương pháp của Margine M.Paz và cs [29] Bằng cách dùng tăm bông tẩm dung dịch thuốc PPT quét ngang lá với nồng độ 0,3 mg/ml Theo dõi khả năng kháng của cây sau 3-5 ngày thử thuốc 34 Bảng 4.2 Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ ở thế hệ T2 Số cây không kháng thuốc diệt cỏ Basta Tỉ lệ kháng thuốc diệt cỏ Basta (%) TT Tên dòng Số cây được đánh giá Số cây kháng. .. hệ T1 Thí nghiệm kiểm tra kháng thuốc diệt cỏ Basta 0,3% (a, b, c - cây chuyển gen; d cây đối chứng) Hình a, b, c: lá của các cây chuyển gen vẫn xanh và có biểu hiện kháng thuốc diệt cỏ Hình d: cây đối chứng không chuyển gen có biểu hiện lá bị vàng 4.1.2 Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của dòng đậu tương chuyển gen ở thế hệ T2 Cây con được trồng trong vườn và chăm sóc Khi cây có từ 3 lá . khả năng kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1 sau 5 ngày 24 Bảng 4.2. Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của dòng đậu tương chuyển gen ở thế hệ T2 sau 5 ngày. diệt cỏ các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T2 27 Hình 4.3. Một số hình ảnh đánh giá kháng thuốc diệt cỏ các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T3 29 Hình 4.4. Phương pháp đánh giá kháng thuốc. kháng thuốc diệt cỏ trên đồng ruộng 32 4.1. 1. Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của dòng đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1 32 4.1.2. Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của