Theo dõi khả năng kháng thuốc diệt cỏ của dòng đậu tương chuyển gen ĐVN9 qua các thế hệ T1 T2 và T3.

Một số hình ảnh đánh giá kháng thuốc diệt cỏ các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T1 .... Một số hình ảnh đánh giá kháng thuốc diệt cỏ các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T2 .... Một số

ĐÀO QUANG THƯỚNG

Tên đề tài:

THEO DÕI KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ CỦA DÒNG

ĐẬU TƯƠNG ĐVN9 CHUYỂN GEN QUA CÁC THẾ HỆ T1, T2 VÀ T3

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Thái Nguyên, 2014

ĐÀO QUANG THƯỚNG

Tên đề tài:

THEO DÕI KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ CỦA DÒNG

ĐẬU TƯƠNG ĐVN9 CHUYỂN GEN QUA CÁC THẾ HỆ T1, T2 VÀ T3

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Người hướng dẫn : TS Nguyễn Văn Duy

Khoa CNSH – CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, 2014

từ ban chủ nhiệm khoa, giảng viên hướng dẫn, cán bộ kỹ thuật tại phòng thí nghiệm, thầy cô, gia đình và bạn bè

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS Nguyễn Văn Duy đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn KS Lã Văn Hiền đã tận tình hướng dẫn cũng như tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện đề tài trong suốt thời gian thực tập tại phòng thí nghiệm và hoàn thành khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể gia đình, bạn bè đã hết lòng giúp đỡ, động viên tạo điều kiện vật chất cũng như tinh thần cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên không thể tránh khỏi những sai sót Em rất mong nhận được sự góp ý, nhận xét của các thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 03 tháng 06 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Đào Quang Thướng

Bảng 2.2 Tình hình sản xuất đậu tương của các nước đứng đầu thế giới 5

Bảng 2.3 Các nước nhập khẩu đậu tương hàng đầu châu Á 6

Bảng 2.4 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam những năm gần đây 7

Bảng 3.1 Mật độ gieo trồng 19

Bảng 4.1 Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ dòng đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1 sau 5 ngày 24

Bảng 4.2 Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của dòng đậu tương chuyển gen ở thế hệ T2 sau 5 ngày 26

Bảng 4.3 Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của dòng đậu tương chuyển gen ở thế hệ T3 28

Bảng 4.4 Kết quả phân tích PCR thế hệ T1 32

Bảng 4.5 Kết quả phân tích PCR thế hệ T2 34

Bảng 4.6 Kết quả phân tích PCR thế hệ T3 35

Hình 4.1 Một số hình ảnh đánh giá kháng thuốc diệt cỏ các dòng đậu tương chuyển

gen thế hệ T1 25

Hình 4.2 Một số hình ảnh đánh giá kháng thuốc diệt cỏ các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T2 27

Hình 4.3 Một số hình ảnh đánh giá kháng thuốc diệt cỏ các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T3 29

Hình 4.4 Phương pháp đánh giá kháng thuốc trừ cỏ của Zhang-yue Song và cs 29

Hình 4.5 Sản phẩm DNA tổng số của các dòng đậu tương thế hệ T1 30

Hình 4.6 Sản phẩm DNA tổng số của các dòng đậu tương thế hệ T2 30

Hình 4.7 Sản phẩm DNA tổng số của các dòng đậu tương thế hệ T2 31

Hình 4.8 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR gen bar thế hệ T1 32

Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen bar thế hệ T2 33

Hình 4.10 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen bar thế hệ T3 34

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

BNN&PTNT : Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

GNA : Galanthus Nivalis Agglutinin

MỤC LỤC

Trang

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 9

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11

2.1 Giới thiệu chung về đậu tương 11

2.1.1 Nguồn gốc 11

2.1.2 Phân loại 11

2.1.3 Giá trị cây đậu tương 11

2.2 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam 12

2.2.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới 12

2.2.2 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam 14

2.3 Ảnh hưởng của cỏ dại đối với cây trồng 15

2.3.1 Đặc tính của cỏ dại 15

2.3.2 Tác hại của cỏ dại đối với cây trồng 17

2.4 Biện pháp phòng trừ cỏ dại 18

2.4.1 Biện pháp cơ học 18

2.4.2 Biện pháp hóa học 20

2.4.3 Biện pháp sinh học 21

2.5 Tình hình sản xuất cây đậu tương biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam 22

2.5.1 Tình hình đậu tương biến đổi gen trên thế giới 22

2.5.2 Tình hình đậu tương biến đổi gen tại Việt Nam 22

2.6 Một số nghiên cứu về đặc tính kháng thuốc diệt cỏ cho cây trồng 23

2.6.1 Giới thiệu về gen kháng thuốc diệt cỏ 23

2.6.2 Cơ chế hoạt động của gen kháng thuốc diệt cỏ 23

2.6.3 Tình hình nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây trồng hiện nay 24

PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 Vật liệu nghiên cứu 25

3.1.1 Vật liệu thực vật 25

3.1.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 25

3.1.2.1 Hóa chất 25

3.1.2.2 Thiết bị thí nghiệm 25

3.2 Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 26

3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 26

3.2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26

3.3 Nội dung nghiên cứu 26

3.4 Phương pháp nghiên cứu 26

3.4.1 Phương pháp đánh giá khả năng kháng thuốc trừ cỏ và kháng sâu của dòng đậu tương chuyển gen ĐVN9 ở thế hệ T1, T2, T3 26

3.4.2 Phương pháp phát hiện gen Bar bằng phương pháp sinh học phân tử 29

3.4.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 29

3.4.2.2 Phương pháp phân tích PCR xác định sự có mặt của gen kháng thuốc diệt cỏ Bar với cặp mồi đặc hiệu 30

3.4.2.3 Phương pháp điện di sản phẩm DNA tổng số và PCR sản phẩm 31

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 Đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ trên đồng ruộng 32

4.1 1 Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của dòng đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1 32

4.1.2 Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của dòng đậu tương chuyển gen ở thế hệ T2 33

4.1.3 Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của dòng đậu tương chuyển gen ở thế hệ T3 36

4.2 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá đậu tương 38

4.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá đậu tương thế hệ T1 38

4.2.2 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá đậu tương thế hệ T2 38

4.2.3 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá đậu tương thế hệ T3 39

4.3 Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen bar qua các thế hệ T1, T2 và T3 39

4.3.1 Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen bar qua thế hệ T1 39

4.3.2 Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen bar qua thế hệ T2 41

4.3.3 Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen bar qua thế hệ T3 42

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

5.1 Kết luận 45

5.2 Đề nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

PHẦN 1: MỞ ĐẦU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Đậu tương (Glycine max (L.) Merr.) là một cây trồng cạn ngắn ngày phổ biến

trên thế giới và Việt Nam Đậu tương có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao Hàm lượng protein trung bình khoảng 35,5- 40%, lipit từ 15- 20%, hydratcacbon từ 15- 16% cùng nhiều loại vitamin và muối khoáng cần thiết Do vậy đậu tương được dùng làm thực phẩm cho con người, thức ăn chăn nuôi, nguyên liệu công nghiệp, và

là mặt hàng xuất khẩu Việc phát triển cây đậu tương là một trong những biện pháp nhanh chóng khắc phục tình trạng thiếu hụt protein ở các nước nghèo [4] Riêng đối với Việt Nam là nước nông nghiệp nhiệt đới trồng đậu tương với ba mục đích giải quyết vấn đề thiếu protein cho người và gia súc, xuất khẩu và cải tạo đất [11] Hiện nay, nước ta đang phải nhập khẩu đậu tương do nhu cầu trong nước tăng cao Sản lượng sản xuất còn thấp chưa đủ để cung ứng Một trong những lý do dẫn đến sản lượng thấp là do cỏ dại và sâu hại

Sâu hại là nhân tố thứ nhất ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng đậu tương Đậu tương thường bị các loại sâu hại chính như: sâu cuốn lá, sâu đục quả, sâu đục thân, sâu khoang Ngoài ra, Cây đậu tương có thể bị gây hại bởi virus, tuyến trùng

và côn trùng Những tác nhân gây bệnh và sâu hại có thể gây ra thiệt hại trong hạt,

rễ, thân, lá, cành, quả và thường là những mô cụ thể [19]

Cỏ dại là nhân tố thứ hai có tác động trực tiếp đến sinh trưởng và phát triển của đậu tương Nó có thể cạnh tranh về ánh sáng, dinh dưỡng, nước và là trung gian truyền bệnh cho đậu tương Do vậy, các biện pháp phòng trừ cỏ dại và sâu hại luôn được quan tâm Biện pháp phòng trừ hóa học là biện pháp chính đang được sử dụng thường gây ảnh hưởng xấu đến con người và môi trường sinh thái Chi phí cho phòng trừ cỏ dại, sâu hại là thiệt hại lớn nhất trong sản xuất đậu tương [4] Các biện pháp sinh học hiện đại hướng đến cải thiện các đặc tính của cây trồng Trong đó nghiên cứu tăng cường khả năng kháng thuốc diệt cỏ, kháng sâu bằng các biện pháp công nghệ sinh học đang được quan tâm xuất phát từ yêu cầu của thực tiễn sản xuất đậu tương trên thế giới và ở nước ta

Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã thành công trong việc tạo ra các dòng đậu tương chuyển gen

kháng thuốc diệt cỏ và kháng sâu từ các giống đậu tương của Việt Nam năm 2010 Tuy nhiên sự biểu hiện của các gen chuyển này chưa được nghiên cứu qua các thế

hệ Từ thực tế đó tôi đã tiến hành thực hiện nghiên cứu đề tài: “Theo dõi khả năng

kháng thuốc diệt cỏ của dòng đậu tương chuyển gen ĐVN9 qua các thế hệ T1, T2

và T3”

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về đậu tương

2.1.1 Nguồn gốc

Đậu tương là một trong những loại cây trồng mà loài người đã biết sử dụng và trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn gốc của cây đậu tương cũng sớm được xác minh Những bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học đều công nhận rằng đậu tương

có nguyên sản ở châu Á và có nguồn gốc từ Trung Quốc Cây đậu tương được thuần hoá ở Trung Quốc qua nhiều triều đại tiền phong kiến và được đưa vào trồng trọt và khảo sát có thể trong triều đại Shang (năm 1700-1100 B.C) trước công nguyên Những thông tin về nguồn gốc đậu tương được trình bày chi tiết trong tài liệu của Ngô Thế Dân và cs (1999) [4]

Theo một số tài liệu, ở Việt Nam cây đậu tương đã xuất hiện từ thời các vua Hùng [7] Hiện nay, trong nông nghiệp cây đậu tương chiếm một vai trò quan trọng trong cơ cấu cây nông nghiệp phục vụ cho công nghiệp chế biến

2.1.2 Phân loại

Đậu tương, đỗ tương hay đậu nành có tên khoa học là Glycine max(L.) Merr

theo khóa phân loại của Ottawa và cs, 1996 [24] căn cứ vào đặc điểm hình thái, sự

phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể Đậu tương trồng có số lượng nhiễm sắc thể 2n=40 thuộc:

Bộ đậu : Fabales

Họ đậu : Fabaceae

Phân họ : Leguminosae

Chi : Glycine

2.1.3 Giá trị cây đậu tương

Đậu tương (Glycine max (L) Merr.) là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị

kinh tế cao Sản phẩm của nó làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc nguyên liệu cho công nghiệp, hàng xuất khẩu, cây cải tạo đất tốt Bởi vậy cây đậu tương được đánh giá là có giá trị toàn diện

cổ truyền, thủ công và hiện đại dưới dạng tươi, khô và lên men như: làm giá, đậu

phụ, tương, xì dầu đến các sản phẩm cao cấp khác như sữa đậu nành, bánh kẹo

Giá trị về mặt công nghiệp

Đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, nhưng chủ yếu đậu tương được dùng để ép dầu Từ dầu đậu tương người ta có thể tạo ra hàng trăm sản phẩm công nghiệp khác như: làm nến, xà phòng, ni lông [11]

Giá trị về mặt nông nghiệp

Làm thức ăn cho gia súc: Đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc Cây

đậu tương (thân, lá, quả, hạt) có hàm lượng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ như thân lá tươi có thể làm thức ăn cho gia súc rất tốt, hoặc nghiền khô làm thức ăn tổng hợp của gia súc [11]

Cải tạo đất: Đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt, 1 ha trồng đậu tương

nếu sinh trưởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30-60 kg N [7] Trong hệ thống

luân canh, nếu bố trí cây đậu tương vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với cây trồng sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng mà giảm chi

phí cho việc bón phân hóa học

2.2 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam

2.2.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới

Hiện nay đậu tương được trồng phổ biến ở Đông Nam Á, và ở châu Mỹ Trong đó, 45% diện tích trồng đậu tương và 55% sản lượng đậu tương của thế giới nằm ở Mỹ [21] Đến năm 2010 cây đậu tương có diện tích 85,1 triệu ha chiếm 92% cây trồng ở Mỹ [26] Đây là loại cây chứa dầu thực vật đem lại lợi ích kinh tế to lớn, là một trong những loại cây trồng lương thực quan trọng nhất trên thế giới hiện nay

Bảng 2.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đây

Năm Diện tích (nghìn ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lượng (nghìn

Bảng 2.2 Tình hình sản xuất đậu tương của các nước đứng đầu thế giới

Quốc gia

Diện tích

(triệu ha)

Sản lượng

(triệu tấn)

Năng suất

(tạ/ha)

Diện tích

(triệu ha)

Sản lượng

(triệu tấn)

Năng suất

Theo báo cáo của Bộ nông nghiệp Mỹ, ở Châu Á nhu cầu về đậu tương để phục vụ cho công nghiệp lấy dầu, sản xuất thức ăn chăn nuôi … là rất lớn

Bảng 2.3 Các nước nhập khẩu đậu tương hàng đầu châu Á

2.2.2 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam

Hiện nay đậu tương được trồng ở khắp cả nước, nhưng tập trung chủ yếu ở Miền núi phía Bắc và Đông Nam Bộ, không ngừng được mở rộng về diện tích Tính đến tháng 4/2010 là 123,9 nghìn ha và được chia làm 6 vùng sản xuất chính: Miền núi Bắc Bộ 24,7%, Đồng bằng sông Hồng 17,5%, Đông Nam Bộ 26,2% (có diện tích lớn nhất); Đồng bằng sông Cửu Long 12,4% Tổng diện tích 4 vùng này chiếm 80% diện tích trồng đậu tương cả nước, còn lại là đồng bằng ven biển miền Trung

và Tây Nguyên [3]

Bảng 2.4 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam những năm gần đây

Năm Diện tích (nghìn ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lượng (nghìn

Đậu tương để phục vụ cho công nghiệp chế biến, sản xuất dầu ăn và thức ăn chăn nuôi Chính vì vậy việc tăng năng xuất và sản lượng đậu tương ở nước ta còn gặp nhiều khó khăn, bên cạnh tình hình giá phân bón, thuốc trừ sâu tăng cao và sâu bệnh diễn biến phức tạp

2.3 Ảnh hưởng của cỏ dại đối với cây trồng

2.3.1 Đặc tính của cỏ dại

Cỏ dại là loài thực vật có khả năng thích nghi với điều kiện ngoại cảnh, có

tính chống chịu cao với điều kiện khắc nghiệt của khí hậu và thổ nhưỡng, thường mọc tự nhiên trên đồng ruộng, vườn tược, ven đường, bãi đất hoang,… Mặc dù cỏ dại được định nghĩa tùy theo nhận định của con người chứ không tùy thuộc vào hệ thống phân loại, chúng có một số đặc điểm nổi bật có thể phân biệt với cây trồng và thích ứng với nhiều điều kiện khắc nghiệt của môi trường sống để tồn tại [13]

Cỏ dại có nhiều hình thức sinh sản Cỏ dại có thể ra hoa kết hạt quanh năm, luôn hiện diện trên đồng ruộng gây trở ngại cho các hoạt động sản xuất của con người Sự đa dạng về hình thức sinh sản của cỏ dại chính là một trong những nguyên nhân giúp chúng có thể thích ứng với các điều kiện tự nhiên để luôn có mặt trên đồng ruộng Nhiều loài cỏ vừa sinh sản hữu tính vừa vô tính làm cho khả năng lan truyền càng mạnh và mỗi khi điều kiện tự nhiên thay đổi thì có ít nhất một hình

thức sinh sản để lan truyền về sau [1]

Khả năng nhân giống cao Khả năng này thể hiện qua số hạt sinh sản hữu tính và số mầm ngủ sinh sản vô tính Số lượng hạt/cây của cỏ dại nhiều, đảm bảo cho chúng có hệ số nhân giống cao, có lợi cho duy trì nòi giống, đồng thời cũng cho chúng ta thấy trữ lượng hạt cỏ dại trên một đơn vị diện tích sẽ rất lớn, đe dọa

việc sản xuất nông nghiệp [1]

Hạt chín không đều, dễ rụng và có nhiều hình thức lan truyền Sau khi chín xong, hạt cỏ lại dễ rơi khỏi cây mẹ và rụng xuống đất Hiện tượng này kèm theo hiện tượng chín không đều làm cho cỏ dại kéo dài thời gian phóng thích hạt dẫn đến hiện tượng cỏ mọc mầm không tập trung, gây khó khăn và tốn kém cho công tác phòng trừ Cỏ dại có thể phát tán bằng nhiều con đường: hạt giống, thức ăn gia súc, rơm rạ và cỏ khô, gió, nước, động vật, máy móc, nông cụ … Do đó chúng có thể lan truyền từ ruộng này sang ruộng khác, từ nơi này sang nơi khác bất chấp con người

đã tìm mọi cách để ngăn cản sự phát triển của chúng Người ta đã phát hiện có sự xâm nhập của cỏ dại từ Châu Âu sang Châu Mĩ và ngược lại, từ lục địa Âu, Á sang Châu Mĩ, Đại Tây Dương và Thái Bình Dương Do vậy, phải tìm cho được nguồn gốc của cỏ dại xuất phát từ đâu thì mới có thể đề xuất biện pháp phòng trừ có hiệu

quả [13],[1],[17]

Hạt cỏ dại có thể giữ sức nảy mầm trong thời gian tương đối dài, tạo nên một nguồn hạt cỏ liên tục trong đất gây khó khăn và tốn kém cho công tác phòng trừ cỏ dại Điều này là do chúng có thời gian ngủ nghỉ nhất định Thời gian ngủ nghỉ của hạt là thời gian tối thiểu cần thiết cho sự nảy mầm sắp tới

Cỏ dại có khả năng chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất thuận tốt hơn cây trồng Đây là kết quả của quá trình thích nghi và chọn lọc tự nhiên lâu đời Một

số loài cỏ dại có khả năng sống và duy trì nòi giống ngay cả khi nhiệt độ xuống đến mức 40C hoặc thấp hơn [17].

2.3.2 Tác hại của cỏ dại đối với cây trồng

Cỏ dại xuất hiện ở mọi nơi, mọi lúc và là mối quan tâm của tất cả mọi người

Cỏ dại không chỉ gây cản trở hoạt động sản xuất nông nghiệp và làm gia tăng chi phí sản xuất mà còn ảnh hưởng đến sức khỏe của cộng đồng và gây khó khăn cho việc bảo trì các công trình xây dựng, nhà cửa, cảnh quan …

Theo tài liệu của FAO, thiệt hại do cỏ dại gây ra hàng năm trên thế giới có thể nuôi sống 100 triệu người mỗi năm Kết quả nghiên cứu của tổ chức môi trường

"Land Care of New Zealand" cho thấy cỏ dại gây ra thiệt hại 95 tỷ đô la Mỹ mỗi năm do làm giảm sản lượng lương thực thực phẩm trên toàn cầu trong khi bệnh cây, côn trùng và các động vật có xương sống (không kể con người) gây tổn thất 2,4 tỷ

đô la Mĩ [1] Những sự thiệt hại về kinh tế có thể lớn hơn nữa nếu tính đến khía

cạnh là hơn phân nửa thời gian mà nông dân lao động trên đồng ruộng là dành cho công việc nhổ cỏ

Cỏ dại tranh chấp các điều kiện sinh sống của cây trồng (ánh sáng, nước, dinh dưỡng và carbon dioxide) dẫn đến làm giảm năng suất cây trồng Tuy nhiên, tùy theo những điều kiện khác nhau mà cỏ dại làm cho năng suất cây trồng giảm nhiều hay ít Sự hiện diện của cỏ dại trên đồng ruộng còn làm tăng chi phí sản xuất, bao gồm: thuốc trừ cỏ, chi phí phun và rải thuốc trừ cỏ, chuẩn bị đất, trồng trọt và chăm sóc, dụng cụ trừ cỏ và thời gian làm cỏ [1]

Một vài loài cỏ dại có khả năng hạn chế sự cạnh tranh của các loài khác bằng cách tiết ra các hóa chất độc hại ức chế sự sinh trưởng, phát triển bình thường của các loài thực vật khác sự sinh trưởng, phát triển của cây trồng giảm mạnh trong những trường hợp này [13]

Cỏ dại là nơi trú ẩn của sâu bệnh hại và là nơi trú ẩn của chuột Các loài cỏ dại cùng họ, bộ với cây trồng là kí chủ rất tốt của sâu bệnh hại trên những cây trồng tương ứng [1]

Cỏ dại ảnh hưởng đến chất lượng nông sản Có một số loài cỏ dại nếu gia súc

ăn phải sẽ làm giảm chất lượng sữa và thịt (cỏ dại làm giảm chất lượng thịt và sữa

và có thể làm cho sản phẩm không tiêu thụ được) [1]

2.4 Biện pháp phòng trừ cỏ dại

Ngăn ngừa sự lây lan và xâm nhiễm ban đầu của cỏ dại là một biện pháp đầu tiên, quan trọng và ít tốn kém nhất trong việc quản lí cỏ dại Phòng ngừa bao gồm các biện pháp loại bỏ khả năng xâm nhập và thiết lập quần thể cỏ mới ở một vùng Biện pháp này sẽ đem lại hiệu quả cao trong việc quản lý cỏ dại nếu được áp dụng đồng loạt trên diện rộng với sự hợp tác chặt chẽ của các nông hộ trong vùng Công tác phòng ngừa sự lây lan và xâm nhiễm của cỏ dại có thể được thực hiện bằng nhiều cách

2.4.1 Biện pháp cơ học

- Làm cỏ

Biện pháp sử dụng các công cụ thô sơ như cuốc, xẻng, dao, nạo, liềm … đã được ứng dụng ở các cấp độ khác nhau trong việc kiểm soát cỏ dại Sau đó, các công cụ này được cải tiến thành những máy đơn giản chạy bằng động cơ nhỏ hay đẩy bằng tay Mặc dù tiết kiệm được công lao động hơn so với các công cụ làm cỏ bằng tay thông thường nhưng do các công cụ này chỉ có thể tiến hành được trên diện diện tích gieo trồng thẳng hàng hoặc bằng máy nên phạm vi ứng dụng của chúng bị hạn chế Tuy hạn chế về mặt nhân lực nhưng biện pháp làm cỏ bằng tay cho hiệu quả trừ cỏ cao và triệt để nhất, hạn chế gây tổn thương đến cây trồng đồng thời kết hợp với xới xáo, phá váng trong quá trình nhổ cỏ đã tạo điều kiện cho cây trồng sinh trưởng tốt, do đó năng suất cây trồng cao hơn so với các biện pháp khác Hai vấn đề quan trọng của việc làm cỏ bằng tay là số lần làm cỏ và khoảng thời gian giữa 2 lần làm cỏ Số lần làm cỏ phụ thuộc vào tốc độ phát triển của cây trồng và cỏ dại và khoảng thời gian khủng hoảng cạnh tranh giữa cỏ dại và cây trồng Khoảng thời gian giữa 2 lần làm cỏ phụ thuộc vào tốc độ phát triển và lấn chiếm của cỏ dại đối với cây trồng, thường là 15 – 20 ngày và nên chọn ngày nắng ráo để tăng hiệu quả trừ cỏ [13],[1]

Đối với các loài cỏ đa niên có thân ngầm nằm sâu trong đất, làm cỏ bằng tay

sẽ không tiêu diệt được chúng vì sẽ mọc lại sau đó rất nhanh Biện pháp làm cỏ bằng tay còn có nhược điểm là chỉ có khả năng áp dụng trên đồng ruộng nơi cây trồng được gieo trồng thẳng hàng, ngược lại, biện pháp này dễ gây tổn thương cho

cây trồng, đặc biệt là giai đoạn cuối [13],[1]

- Làm đất

Các hoạt động làm đất như cày, bừa, trục, san phẳng mặt ruộng đều trực tiếp hoặc gián tiếp tiêu diệt cỏ dại đặc biệt là cỏ đa niên [13], Thông qua các hoạt động cày đất, hạt cỏ cũng như các cơ quan sinh sản bị vùi xuống tầng đất sâu làm cho chúng bị chết hoặc mất sức nảy mầm

Ưu điểm của làm đất là: tiêu diệt nhanh và triệt để cỏ dại, diệt cỏ an toàn tăng cường sự sinh trưởng của cây trồng, có thể diệt toàn bộ các loài cỏ dại Tuy nhiên, không phải lúc nào cũng có thể tiến hành làm đất kiểm soátt cỏ dại được, chẳng hạn như khi cây trồng quá lớn, gieo trồng không thành hàng lối, cỏ bám cuốn vào cây trồng, đất quá ẩm [1]

- Ngâm nước ruộng

Cho nước ngập ruộng là một biện pháp thường được sử dụng để kiểm soát cỏ trong ruộng và cỏ đa niên bò Điều chỉnh chế độ tưới tiêu hợp lí vẫn có thể hạn chế được sự sinh trưởng và phát triển của các loài cỏ ưa ẩm trong ruộng Cơ quan sinh sản của các loài cỏ đa niên thân bò cũng có thể bị tiêu diệt khi ngâm nước ruộng Biện pháp này chỉ có thể thành công nếu tầng đế cày đủ chặt để giữ nước Với những ruộng có nhiều cỏ đa niên, việc giữ ruộng ngập trong 15 – 25 cm nước liên tục trong vòng 3 – 8 tuần trong mùa hè sẽ hạn chế được một số loài cỏ dại Phương pháp này chỉ có thể thực hiện được ở những nơi có đủ nước Phương pháp này không thể áp dụng được với tất cả các loài cỏ dại sinh sản vô tính vì mầm ngủ của nhiều loài cỏ dại sống tiềm sinh và vẫn có thể sống sót sau khi bị ngâm ngập trong nước [1]

- Dùng lửa

Việc dùng lửa đề phòng trừ cỏ dại được áp dụng khi trên đồng ruộng không

có cây trồng, lúc khai hoang hoặc làm đất trước khi gieo trồng Khi đốt lửa, nhiệt độ cao sẽ làm ngưng tụ hay phân giải nguyên sinh chất, làm hư hại các enzyme

Nhiệt độ tối đa mà các tế bào thực vật có thể chịu đựng được là là 45 – 550C Lợi dụng tính chất trên, người ta dùng lửa để tiêu diệt cỏ dại Lửa có thể làm chết các bộ phận trên mặt đất và một phần các cơ quan sinh sản vô tính và hạt cỏ dại ở trong đất Phương pháp này áp dụng trong mùa khô sau khi đã thu hoạch nông sản

để diệt cỏ và sâu bệnh có trong tàn dư cây trồng [13]

Phương pháp này luôn phải được kèm theo phương pháp cày bừa thì mới có kết quả cao, nếu không cỏ dại sau đó sẽ tiếp tục mọc trở lại, đặc biệt là cỏ đa niên

có thân rễ ngầm như cỏ tranh, cỏ cú, cỏ ống …

Ưu điểm của phương pháp này là: Đơn giản, dễ làm và ít tốn kém, tiêu diệt được cây cỏ và các hạt cỏ trên cây, có thể diệt cỏ nhanh chóng trên một diện tích lớn, tiêu diệt được mầm mống sâu bệnh gây hại cho cây trồng [1]

- Che phủ mặt đất

Che phủ mặt đất bằng các vật liệu khác nhau có tác dụng kiểm soát cỏ dại thông qua việc ngăn cản không cho ánh sáng lọt xuống mặt đất để hạt và mầm ngủ của cỏ dại không nảy mầm được, mầm cỏ đã mọc không đủ ánh sáng để lớn lên và vượt ra khỏi lớp che phủ Vật liệu che phủ mặt đất có thể là các vật liệu tự nhiên (rơm rạ, cỏ khô, bọt giấy, mạt cưa …) hay nhân tạo (giấy hay màng phủ polyethylen, plastic màu đen) Muốn hiệu quả thì lớp che phủ phải đủ dày để ngăn ánh sáng và hạn chế quang hợp Che phủ đất bằng các vật liệu tự nhiên: Thảm che phải dày ít nhất là 10 cm [13]

2.4.2 Biện pháp hóa học

- Sử dụng thuốc trừ cỏ

Ưu điểm: Hiệu quả cao và tương đối triệt để, nhiều loại thuốc có phổ tác động rộng, diệt được hầu hết các loại cỏ mà lại an toàn đối với cây trồng Sử dụng thời gian đầu khi mới gieo trồng do đó diệt được cỏ ngay từ khi mới mọc mầm và còn nhỏ nên hạn chế tác hại của cỏ rõ rệt Đỡ tốn chi phí và công lao động, có thể

áp dụng trên diện tích rộng lớn trong một thời gian ngắn [13],[1]

2.4.3 Biện pháp sinh học

- Côn trùng diệt cỏ

Côn trùng diệt cỏ là tác nhân sinh học được sử dụng rộng rãi để kiểm soát nhiều loài cỏ nguy hiểm trên thế giới Thành công đầu tiên của tác nhân sinh học trong việc diệt trừ cỏ dại đựoc biết đến vào năm 1902 trên cây trâm ổi (ngũ sắc

Lantana camara) tại đảo Hawaii Các thử nghiệm đã chỉ ra một số loài côn trùng rất

hiệu quả trong việc kiểm soát loài cỏ này, bao gồm: ấu trùng của Crocidosema

lantana (bướm sâu cuốn lá) (đục vào trong cuống hoa, nằm trên đế của cụm hoa và

ăn hoa quả), ấu trùng của ruồi ăn hạt Agromyza lantana ăn quả và làm cho quả khô

để hạn chế chim mang hạt đi phát tán nơi khác, ấu trùng của bướm Theclaechion và

Thecla bazochi phá hủy hoa ngăn không cho cây kết hạt, giảm khả năng sinh sản

[1]

Ở nước ta, Viện BVTV đã tiến hành nhân thả thành công 2 tác nhân sinh học

là sâu đục thân Carmenta mimosa để trừ cây mai dương Mimosa pigra và bọ cánh cứng Neochetina bruchi để trừ cây lục bình Eichornia crassipes [1]

- Chăn thả gia cầm

Cỏ dại trong vườn cây đa niên có thể được kiểm soát bằng phương pháp thả nuôi gia cầm Việc sử dụng 1000 – 1.500 con vịt/ha trong hệ thống canh tác lúa vịt cho hiệu quả phòng trừ cỏ dại cao hơn so với công thức xử lý thuốc diệt cỏ 2 lần/vụ [13],[1]

- Nấm

Người ta đã phân lập được nhiều loài nấm kí sinh trên cỏ Cây keo dậu có thể

bị tiêu diệt khi chích dung dịch bào tử nấm Cephalosporious sp., nấm Rhizoctonia

sp gây cháy lá trên lục bình cũng được nghiên cứu để kiểm soát loài cỏ dại này [1].

- Thuốc diệt cỏ sinh học (bioherbicides)

Thuốc diệt cỏ sinh học thường là vi sinh vật gây bệnh có trong tự nhiên được phân lập, nuôi cấy và nhân lên với số lượng lớn để áp dụng cho các loài cỏ mà con

người định kiểm soát [1],[17]

- Trồng cây cạnh tranh

Có nhiều loài cây trồng nảy mầm nhanh, tán lá phát triển rộng, hiệu suất quang hợp cao có thể cạnh tranh hiệu quả với cỏ dại, chẳng hạn như cây đậu bò

(cowpea), cỏ linh lăng (Medicago sativa L.), cỏ ba lá Ai Cập (Trifolium

alexandrinum L.) [13],[1] Có những loài cỏ cạnh tranh mạnh, mọc rất nhanh và ít

nguy hiểm cho con người hơn các loài cỏ khác được trồng và tạo điều kiện để lấn át các loài cỏ nguy hiểm hơn

2.5 Tình hình sản xuất cây đậu tương biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam

2.5.1 Tình hình đậu tương biến đổi gen trên thế giới

Trong các loại cây trồng biến đổi gen đậu tương là loại cây biến đổi gen nổi

bật nhất Đậu tương chuyển gen lần đầu tiên được trồng ở Mỹ và Canada vào năm

1996 Sau 11 năm, đậu tương chuyển gen đã xuất hiện tại 10 quốc gia với tổng diện tích trồng lên đến có tới 69,7 triệu ha chiếm 52% trong tổng diện tích cây biến đổi gen toàn thế giới và chiếm tới 75% trong tổng diện tích 90 triệu ha trồng đậu tương trên thế giới [26] Đậu tương là một trong số các cây lương thực đã có nhiều giống được cải biến di truyền (GMO) nhằm tăng năng suất Hiện nay, khoảng 80% lượng đậu tương được trồng phục vụ thương mại đều là GMO Việc cải thiện các đặc tính của cây đậu tương đã đem lại nhiều lợi ích Tính trạng kháng thuốc diệt cỏ là tính trạng phổ biến dùng cho đậu tương, chiếm tới 62% [9],[23] Vì vậy đậu tương chuyển gen hiện nay được trồng phổ biến ở rất nhiều quốc gia ở Châu Mỹ, Châu Phi

và Châu Á

2.5.2 Tình hình đậu tương biến đổi gen tại Việt Nam

Chuyển gen đậu tương ở Việt Nam mới được đưa vào nghiên cứu trong mấy năm gần đây [2] Bắt đầu từ việc tách dòng gen chịu hạn phục vụ cho công tác chuyển gen Hiện nay, đã có một số thử nghiệm để tối ưu hóa quá trình tái sinh cũng như chuyển gen của đậu tương Bên cạnh đó quá trình chuyển gen cũng được Trần Thị Cúc Hòa và cs (2008)[14] nghiên cứu, đã sử dụng giống đậu PC19 làm

giống chuyển gen Việc biến nạp vào nốt lá mầm thông qua A tumefaciens mang vector nhị thể pZY 102/pTF 102 chứa gen bar, gen gusA và gen kháng glufosinate đã

thu được tần số chuyển gen ở thế hệ T0 là 1-3% Đây là một trong những bước đầu thuận lợi cho các nghiên cứu chuyển gen hữu dụng vào cây đậu tương ở Việt Nam Tuy nhiên do hạn chế về thiết bị, kiến thức và nguồn vật liệu nên việc nghiên cứu mới

chỉ dừng ở mức độ phòng thí nghiệm và thử nghiệm trên diện hẹp, chưa thể đưa cây

đậu tương chuyển gen vào sản xuất thương mại trong tương lai gần [2]

2.6 Một số nghiên cứu về đặc tính kháng thuốc diệt cỏ cho cây trồng

2.6.1 Giới thiệu về gen kháng thuốc diệt cỏ

Gen bar - gen kháng thuốc diệt cỏ được phân lập từ hệ DNA của S

Hygroscopicus, gen được nhân dòng thứ cấp trong E.Coli W3110iq sử dụng vector

pUC19 Trong W3110iq, quá trình phiên mã được thực hiện bởi promoter Lac bị lìm hãm mạnh nhưng có thể cảm ứng với isopropylthiogalactoside Gen tạo ra bằng

cách nhân dòng thứ cấp vùng BamHI được phân lập ban đầu từ Streptomysete,

pBG4, từ vị trí của BamHI của pUC19 tạo pBG195 và pBG196 W3110iq có hoạt tính kháng bialaphos yếu khi nó chứa pBG196, tuy nhiên làm tăng mức độ kháng chất không thể cảm ứng bằng isopropylthiogalactoside Với W3110iq/ pBG195, hàm lượng kháng chất có thể cảm ứng từ 0.005 đến hơn 0.05 mg/l [27]

Gen bar (bialaphos resistance) mã hóa phosphinothricin acetyl transferase

(PAT) khử độc phosphinothricin làm cho glutamine synthase (GS) không bị ức chế Phosphinothricin là thành phần mang hoạt tính thuốc trừ cỏ nhóm glufosinate có tên thương mại là Basta, Liberty, Ignite,… Phosphinothricin có cấu trúc tương tự glutamin, cấu trúc này cũng giống như cấu trúc của bialaphos (PPT), một kháng

sinh Streptomyces Tác động của phosphinothricin là ức chế glutamine synthase

(GS), một enzyme chủ chốt trong quy trình khử độc ammoni hình thành trong quá trình trao đổi hình thành chất nitơ trong thực vật Tính kháng glufosinates được thực hiện thông qua gen mã hóa PAT có nguồn gốc từ các loài xạ khuẩn như

Streptomyces hygroscopicus hay S Viridochromogen [9] Khi chuyển loại gen này

vào cây giúp hoạt động trao đổi chất của cây diễn ra bình thường không bị tác động của nhóm thuốc diệt cỏ trên

2.6.2 Cơ chế hoạt động của gen kháng thuốc diệt cỏ

- Ngăn cản không cho cây hấp thu thuốc diệt cỏ

- Vô hiệu hóa các enzyme kích hoạt của thuốc diệt cỏ

- Ức chế tác động của thuốc trừ cỏ đối với các protein mục tiêu trong cây trồng

- Kích thích protein mục tiêu kháng lại thuốc trừ cỏ của cây trồng

Gen bar là tên gọi của gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin

acetyltransferase (PAT), có tác dụng làm mất độc tính của phosphinothricin (PPT)

Gen bar được tạo dòng đầu tiên từ một dòng vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus Phương pháp đơn giản nhất để kiểm tra sự có mặt của gen bar là phương

pháp trực tiếp Mô, tế bào hoặc cây chuyển gen được đặt trên môi trường có các nồng độ phosphinothricin khác nhau và so sánh sinh trưởng của mô, tế bào hoặc cây đối chứng đặt trên cùng môi trường [31]

2.6.3 Tình hình nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây trồng hiện nay

Bằng công nghệ sinh học người ta đã có thể tạo ra những giống cây trồng kháng thuốc diệt cỏ, cho phép loại trừ được cỏ dại một cách chọn lọc Nhìn chung, sản xuất cây trồng kháng thuốc diệt cỏ được tiến hành bằng việc chuyển gen mã hóa enzyme gây bất hoạt thuốc diệt cỏ vào cây trồng Monsanto, công ty giữ bản quyền

về giống đậu tương chuyển gen kháng cỏ “Round up” thống kê cho thấy năm 1996

có khoảng 0,4 triệu hecta trồng đậu tương kháng thuốc diệt cỏ, năm 1997 tăng lên 3,6 triệu hecta, năm 1998 đạt 11,3 triệu hecta đến năm 2007 đạt 12 triệu ha chiếm

10% cây trồng chuyển gen (Tadayoshi Masuda and Peter D.Goldsmith, 2009)

Theo thống kê của USDA, diện tích trồng cây đậu tương kháng thuốc diệt cỏ chiếm 81% ở Mỹ, 99,1% ở Argentina và 34% ở Brazil [10]

Gen mã hóa enzyme tổng hợp 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimic (EPSPS), gen mã hóa enzyme phosphinothricin acetyl transerase (PAT) đã được chuyển vào cây đậu tương và tạo ra các dòng đậu tương chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ glyphosate /glufosinate [23] Các giống đậu tương chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ glufosinate, Roundup và imidazoline đã được thương mại hóa