Lựa chọn các dòng đậu tương ĐVN9 chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ sống sau khi phun thuốc Basta (nồng độ 0.3% basta). Tiến hành thu lá để phục vụ cho tách chiết DNA kiểm tra. DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp Saghai maroof (1984) [30] có một vài thay đổi để phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm.
- Phương pháp tách chiết DNA tổng số được tiến hành như sau:
Bước 1: Nghiền 0.3 – 0.5 gam lá đậu tương trong nitơ lỏng thành bột mịn. Bước 2: Chuyển bột lá vào ống ly tâm 1.5ml. Thêm 1ml đệm CTAB đã ủ ở 650C trong 10 phút. Bổ sung β-mecaptone với tỷ lệ 2%.
Bước 3: Ủ các ống ly tâm ở 650C trong 90 phút, trong quá trình ủ tiến hành lắc 10 - 15 phút/lần để việc tách có hiệu quả.
Bước 4: Ly tâm 12.000 vòng/phút, ở 40C. Hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ sung 0.8 ml dung dịch 24:1, đảo trộn nhẹ nhàng trong 5 - 7 phút rồi tiến hành ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (lặp lại bước này 2- 4 lần).
Bước 5: Hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ sung (25:24:1) theo tỷ lệ (1:1) lắc nhẹ trong 20 phút. Tiến hành ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút.
Bước 6: Hút lớp dịch nổi sang ống mới bổ sung Isopropanol vào tỷ lệ 1:1 với mẫu, bổ sung thêm 3-5µl NaCl 5M. Lắc nhẹ trong 10 phút. Để trong tủ -200
C qua đêm.
Bước 7: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút thu kết tủa.
Bước 8: Rửa tủa với Ethanol 70% sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 20 phút (lặp lại 2 lần).
Bước 9: Loại bỏ dịch lỏng làm khô bằng máy ly tâm hút chân không (5 phút). Bước 10: Bố sung 20µl H2O + 2µl RNAse sau đó ủ ở 370
C trong 30 phút. Đem cất giữ ở -200
C.
3.4.2.2. Phương pháp phân tích PCR xác định sự có mặt của gen kháng thuốc diệt cỏ Bar với cặp mồi đặc hiệu.