Nghiên cứu tinh chế hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ đậu đen lên men bằng chủng Aspergillus oryzae.

Một số ứng dụng của hoạt chất AGIs từ đậu lên men trên thế giới Trên thế giới có nhiều công trình đã và đang nghiên cứu công nghệ sản xuất các sản phẩm lên men đậu chế biến, quá trình n

ĐạI HọC THáI NGUYÊN

TRƯờNG ĐạI HọC NÔNG LÂM

-

phạm thanh dung

Tờn đề tài:

Nghiên cứu tinh chế hoạt chất ức chế enzyme α - glucosidase từ

đậu đen lên men bằng chủng Aspergillus oryzae

khóa luận TốT NGHIệP đại học

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Thực phẩm

Khoa : CNSH - CNTP

Khoá học : 2010 - 2014

Thỏi Nguyờn, 2014

ĐạI HọC THáI NGUYÊN

TRƯờNG ĐạI HọC NÔNG LÂM

-

phạm thanh dung

Tờn đề tài:

Nghiên cứu tinh chế hoạt chất ức chế enzyme α - glucosidase từ

đậu đen lên men bằng chủng Aspergillus oryzae

khóa luận TốT NGHIệP đại học

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ Thực phẩm

Khoa : CNSH - CNTP

Lớp : 42 - CNTP

Khoá học : 2010 - 2014 Giảng viên hướng dẫn : 1 ThS Nguyễn Đức Tiến

2.ThS Trần Thị Lý

Thái Nguyên, 2014

ThS Trần Thị Lý - Giảng viên Bộ môn Công nghệ thực phẩm Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ, hỗ trợ về phương diện nghiên cứu, kiến thức và có những góp ý sâu sắc trong thời gian tôi thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời yêu thương chân thành nhất đến bố mẹ, anh chị tôi đã luôn ở bên cạnh tôi ủng hộ và động viên trong suốt quá trình thời gian học tập

và thực hiện đề tài này

Tôi chân thành cảm ơn bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi, chia sẻ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài tốt nghiệp

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu trên

Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Sinh viên

Phạm Thanh Dung

enzyme α-glucosidase 34Bảng 4.4 Khoảng biến đổi các yếu tố 36Bảng 4.5 Bảng thiết kế ma trận 37Bảng 4.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ cô chân không đến chất lượng dịch cô và

thời gian cô 42Bảng 4.8 Ảnh hưởng của áp suất cô chân không đến thời gian cô đặc dịch

đậu đến lên men 43 Bảng 4.9 Ảnh hưởng của túi Kraft và lọ thủy tinh đến chất lượng bảo quản

chế phẩm sau 3 tháng bảo quản 44Bảng 4.10 Đánh giá chất lượng sản phẩm hoạt chất AGIs 45

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Aspergillus oryzae (Hệ sợi) 5

Hình 2.2 Aspergillus oryzae (Cơ quan sinh sản vô tính) 5

Hình 2.3 Một số sản phẩm chứa hoạt chất AGIs trên thể giới 6

Hình 2.4 Cấu tạo của enzyme α-glucosidase 7

Hình 2.5 Cấu trúc không gian của enzyme α-glucosidase 7

Hình 2.6 Sơ đồ ảnh hưởng của chất AGIs đến quá trình trao đổi đường của cơ thể 10

Hình 4.1 Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu quả tinh chế hoạt chất ức chế ezyme α-glucosidase của phần kết tủa thu được 31

Hình 4.2 Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu quả tinh chế hoạt chất ức chế ezyme α-glucosidase của phần dịch lỏng thu được 32

Hình 4.3 Đồ thị ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến tinh chế hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase 33

Hình 4.4 Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả tinh chế hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase 35

Hình 4.5 Phân tích phương sai ANOVA của mô hình tối ưu tinh chế bằng dung môi hữu cơ 38

Hình 4.6 Phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng các yếu tố tới tinh chế hoạt chất AGIs của chủng A.oryaze 38

Hình 4.7 Tương tác giữa nhiệt độ với nồng độ tới khả năng sinh hoạt chất AGIs 39

Hình 4.8 Tương tác giữa nồng độ với tỷ lệ dung môi tới khả năng sinh hoạt chất AGIs 40

Hình 4.9 Tương tác giữa tỷ lệ dung môi với nhiệt độ tới khả năng sinh hoạt chất AGIs 41

Hình 4.10 Phương trình hàm kỳ vọng 42

Hình 4.11 Ảnh hưởng của áp suất cô chân không đến thời gian cô đặc dịch đậu đến lên men 43

Hình 4.12 Sơ đồ quy trình trích ly và tinh chế hoạt chất AGIs từ đậu đen lên men 46

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

AGIs Ức chế enzyme α-glucosidase

TPCN Thực phẩm chức năng

A.oryzae Aspergillus oryzae

ĐTĐ Đái tháo đường

MỤC LỤC

Trang

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 1

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Đậu đen lên men 3

2.1.1 Đậu đen 3

2.1.2 Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae (A.oryzae) 4

2.1.3 Một số ứng dụng của hoạt chất AGIs từ đậu lên men trên thế giới 5

2.2 Hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase (AGIs) 7

2.2.1 Giới thiệu về enzyme α-glucosidase 7

2.2.2 Giới thiệu về hoạt chất AGIs 8

2.3 Trích ly hoạt chất AGIs từ đậu đen lên men 11

2.3.1 Cơ sở của quá trình trích ly 11

2.3.2 Phương pháp trích ly hoạt chất AGIs 13

2.4 Tinh chế hoạt chất AGIs từ đậu đen lên men 14

2.4.1 Cơ sở của quá trình tinh chế AGIs từ đậu đen lên men 14

2.4.2 Các phương pháp tinh chế 14

2.5 Phương pháp thu nhận AGIs 16

2.5.1 Phương pháp cô đặc 16

2.5.2 Phương pháp sấy 17

2.6 Các loại bao bì dùng để bảo quản 18

2.7 Tình hình nghiên cứu hợp chất AGIs trong và ngoài nước 20

2.7.1 Tình hình nghiên cứu hợp chất AGIs thế giới 20

2.7.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 21

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 23

3.1 Đối tượng nghiên cứu 23

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 23

3.3 Hoá chất và thiết bị sử dụng 23

3.4 Nội dung nghiên cứu 23

3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng quá trình kết tủa bằng ethanol đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs 23

3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng quá trình cô đặc đến thu nhận hoạt chất AGIs 24 3.4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình lọc gel đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs 24

3.4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của bao bì bảo quản đến chất lượng sản phẩm 24 3.4.5 Đánh giá chất lượng sản phẩm và đưa ra quy trinh tinh chế hoạt chất AGIs 24

3.5 Phương pháp nghiên cứu 24

3.5.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 24

3.5.2 Phương pháp phân tích chỉ tiêu hóa lý 28

3.5.3 Quy trinh tinh chế sơ bộ hoạt chất AGIs 30

3.5.4 Phương pháp sử lý số liệu 30

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng quá trình kết tủa bằng ethanol đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs từ đậu đen lên men 31

4.1.1 Lựa chọn nồng độ ethanol đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs từ đậu đen lên men 31

4.1.2 Lựa chọn tỷ lệ dung môi đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs từ dịch trích ly đậu đen lên men 33

4.1.3 Lựa chọn nhiệt độ đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs từ dịch trích ly

đậu đen lên men 34

4.1.4 Tối ưu hóa nhiệt độ, nồng độ, tỷ lệ dung môi, đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs 35

4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng quá trình cô đặc đến thu nhận hoạt chất AGIs 42

4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc đến thu nhận hoạt chất AGIs 42

4.2.2 Xác định áp suất chân không cho quá trình cô dịch 43

4.3 Nghiên cứu tinh chế hoạt chất ức chế hoạt chất AGIs bằng phương pháp lọc gel 44

4.4 Nghiên cứu bao bì bảo quản chế phẩm AGIs 44

4.5 Đánh giá chất lượng sản phẩm và đưa ra quy trinh tinh chế AGIs từ đậu đen lên men 45

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

5.1 Kết luận 48

5.2 Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Chất ức chế enzyme α-glucosidase (AGIs) là một trong những nhóm phổ biến được ứng dụng giúp ổn định đường huyết cho người tiểu đường, thừa cân và béo phì Chất AGIs có chức năng ngăn sự tạo thành monosaccharide từ disaccharide, làm cho quá trình tổng hợp insulin diễn ra dễ dàng và hạn chế hấp thụ monosaccharide Chất AGIs có thể được tổng hợp bằng con đường hóa học hoặc tự nhiên từ thực vật, động vật và vi sinh vật

Chất AGIs tổng hợp theo con đường hóa học hiện thường gây một số tác dụng phụ như rối loạn chức năng gan và chứng đau dạ dày Tuy nhiên chất

AGIs từ đậu đỗ lên men bởi Aspergillus oryzae (A.oryzae) có độ an toàn cao,

không có tác dụng phụ đối với cơ thể sống Hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu tạo ra các sản phẩm thực phẩm thương mại có hiệu quả chức năng

hỗ trợ ổn định đường huyết, phòng chống tiểu đường, thừa cân và béo phì

Tác Giả Nguyễn Đức Tiến Trưởng bộ môn Nghiên cứu phụ phẩm và môi trường Nông nghiệp - Viện Cơ Điện Nông Nghiệp và Công nghệ sau thu

hoạch đã nghiên cứu ‘‘Tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase và thử nghiệm sản xuất thực phẩm chức năng’’ Đã nghiên cứu trích ly hoạt chất ức chế AGIs từ đậu đen lên

men thu được hàm lượng AGIs là 86,8%, IC50 là 5,4mg/ml Nếu chỉ dừng lại

ở trích ly thì hoạt chất thu được lẫn rất nhiều tạp chất khác Việc tinh chế hoạt chất AGIs là rất cần thiết

Từ những lý do trên tôi tiên hành đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu tinh chế hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ đậu đen lên men bằng chủng Aspergillus oryzae”

1.2 Mục đích

Nghiên cứu tinh chế hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ đậu đen

lên men bằng chủng Aspergillus oryzae

1.3 Yêu cầu

- Nghiên cứu ảnh hưởng quá trình kết tủa bằng ethanol đến hiệu quả

tinh chế hoạt chất AGIs

- Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình cô đặc đến thu nhận hoạt chất AGIs

- Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình sắc ký lọc gel đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs

- Nghiên cứu ảnh hưởng của bao bì bảo quản đến chất lượng sản phẩm

- Đánh giá chất lượng sản phẩm và đưa ra quy trinh tinh chế hoạt chất AGIs

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đậu đen lên men

Bảng 2.1 Thành phần chất dinh dưỡng trong đậu đen

Đậu đen cũng được xác nhận là có tác dụng lợi tiểu và tiêu độc cơ thể Ngoài lợi ích cho hệ tiêu hóa, tim mạch, chất xơ hòa tan có trong đậu đen có tác dụng ổn định lượng đường trong máu Trường hợp cơ thể kháng insulin mắc bệnh tiểu đường thì nên tăng cường ăn đậu đen, nó sẽ giúp cơ thể tiêu thụ năng lượng một cách chậm hơn và cuối cùng ổn định lượng đường huyết Tại Hoa Kỳ, người ta đã thực hiện một nghiên cứu đối chứng những người mắc bệnh tiểu đường tuýp 2 được chia làm 2 nhóm, nhóm ăn theo tiêu chuẩn quy định đối với người mắc bệnh tiểu đường, khẩu phần ăn có 24g chất xơ đậu đen/ngày và một nhóm khác dùng tới 50g chất xơ đậu đen/ngày Kết quả hai nhóm đều giảm lượng đường huyết và insulin nhưng ở nhóm sau lượng cholesterol toàn phần giảm được gần 7%, triglycerid giảm 10,2% và hàm lượng cholesterol xấu giảm 12,5% Gần đây, các nhà khoa học còn phát hiện đậu đen lên men còn giàu chất AGIs [3]

2.1.2 Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae (A.oryzae)

Aspergillus oryzae (A.oryzae) thuộc chi Aspergillus Họ Trichocomaceae, bộ Eurotiales, lớp Eurotiomycetes, ngành Ascomycota và thuộc giới nấm (Kitamoto, 2002) Mốc màu hoa cau mà nhân dân ta thường dùng để làm tương Đây cũng chính là loài mà người Nhật dùng để đường hóa

gạo khi làm rượu Sake Người nghiên cứu sớm nhất về loài nấm này là một

nhà khoa học Nhật Bản tên là Jokichi Takamine (1854 - 1922)

Nấm sợi A.oryzae đã được chọn lọc để có các chủng có hoạt tính rất

cao, được sử dụng để sản xuất nhiều sản phẩm khác nhau ở nhiều nước khác nhau ngay từ những thập niên 60 và ngày càng được ứng dụng rộng rãi, phổ biến, nâng cao và chuyên sâu Nấm này còn được dùng để sản xuất tương

Nhật từ đậu tương, dạng đặc gọi là miso (soybean paste), dạng loãng gọi là shoyu (soy sauce) Và nấm này có thể dùng trong công nghiệp để sản xuất

nhiều loại enzyme khác nhau (amylase, protease, lipase, hemicellulase, cellulase, oxidoreductase, phytase, pectinesterase…) [2;25]

Hình 2.1 Aspergillus oryzae (Hệ sợi)

Hình 2.2 Aspergillus oryzae (Cơ quan sinh sản vô tính)

Hiện nay trên thế giới đã tìm thấy một loại chất chiết từ các chủng Aspergillus.sp lên men đậu tương có khả năng ức chế enzym α-glucosidase Nhóm tác giả Klich chứng minh đậu tương lên men bằng A.oryzae cho hợp chất ức chế enzym α-glucosidase cao hơn so với lên men bằng Asp Elegans

và Asp.Reurhizus vì vậy chủng nấm mốc A.oryzae là nguyên liệu phù hợp nhất cho sản xuất hoạt chất AGIs

2.1.3 Một số ứng dụng của hoạt chất AGIs từ đậu lên men trên thế giới

Trên thế giới có nhiều công trình đã và đang nghiên cứu công nghệ sản xuất các sản phẩm lên men đậu chế biến, quá trình nghiên cứu không chỉ dừng lại việc

cung cấp thực phẩm, mà còn hướng đến các tác dụng lớn hơn trong việc phòng một

số bệnh như: béo phì, tiểu đường Theo nghiên cứu của Hiroyuki Fujita và cộng sự, chiết xuất Touchi từ đậu lên men là thực phẩm truyền thống của Trung Quốc, có chứa họat chất AGIs với hàm lượng IC50 0,05 - 0,55mg/g [9]

Hiện nay chất chiết từ đậu lên men Tuochi chứa hoạt chất AGIs được sử dụng trong dược phẩm, thực phấm sản xuất, thực phẩm chức năng, thực phẩm y tế chăm sóc đặc biệt nó không chỉ tạo ra sự đa dạng về sản phẩm mà còn mang đến một số tác dụng trong phòng bệnh như: bệnh tiểu đường, béo phì…

Ứng dụng trong dược phẩm dưới nhiều hình thức như: Viên nén, viên nang, hay dạng viên rắn như: Nutritionalsupplement bao gồm khoảng 100mg Touchi chiết xuất và khoảng 166,67mg phaseolamin Hay thuốc providesabout gồm có 300mg Touchi và khoảng 500mg phaseolamin Khả năng ức chế của nó thể ngăn cản sự hình thành của 100gram carbohydrates Mang đến lợi ích cho người sử dụng vì tính thuận tiện về vận chuyển

Ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng: Như bổ sung sản xuất trà, các sản phẩm đồ uống, súp xiro đây cũng là hướng mới trong quá trình sản xuất và thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu trên thế giới

Theo nghiên cứu của ToyoRoshi, Kawasaki, Nhật Bản bột Tuochi được nghiền mịn và bổ sung vào trà với hàm lượng 0,3g và giá trị IC50 là 1,03g/l, sau đó đóng gói vào túi nhôm, các bệnh nhận được một gói trà, hòa tan với 100ml nước uống trước bữa ăn Để so sánh tác dụng của loại trà này người ta cũng tiến hành thử nghiệm với loại trà không bổ sung bột Tuochi [23] Kết quả cho thấy ở các bệnh nhân sử dụng loại trà có hàm lượng Touchi, nồng độ đường trong máu ổn định và nồng độ chất béo trung tính giảm so với các bệnh nhân không sử dụng trà có bổ sung Touchi

Hình 2.3 Một số sản phẩm chứa hoạt chất AGIs trên thể giới

2.2 Hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase (AGIs)

2.2.1 Giới thiệu về enzyme α-glucosidase

Enzyme α-glucosidase là một enzyme có hoạt tính exohydrolysis từ đầu khử đến đầu không khử của oligosaccharides chứa các α-D-glucose nối với nhau bằng liên kết 1-4glycosides Enzyme α-glucosidase có thể có nhiều nguồn gốc khác nhau: Từ vi khuẩn, nấm mốc, đường tiêu hóa động vật việc khác nhau về nguồn gốc α-glucosidase có thể dẫn đến sự khác biệt về pH hoạt động, khoảng nhiệt độ hoạt động, hoạt độ của enzyme những thông số cơ này chỉ có thể thu nhận được qua thực nghiệm trên một enzyme α-glucosidase

cụ thể

Hình 2.4 Cấu tạo của enzyme α - glucosidase

Enzyme α-glucosidase được phân chia theo cấu trúc chính gồm có gen

mã hóa lysosomal alpha-glucosidase dài khoảng 20kb

Hình 2.5 Cấu trúc không gian của enzyme α-glucosidase

2.2.2 Giới thiệu về hoạt chất AGIs

2.2.2.1 Nguồn sản xuất hoạt chất AGIs

Hoạt chất AGIs có thể tạo ra bằng nhiều con đường khác nhau như: Trích ly từ thực vật, động vật, tổng hợp bằng con đường hóa học hoặc bằng con đường vi sinh vật:

a AGIs từ thực vật

Chất AGIs có thể được tạo ra bằng nhiều con phần khác nhau của thực vật Đây là nguồn thu nhận AGIs phong phú và đa dạng nhất Năm 2006, Atsuo và cộng sự [5] đã công bố dịch chiết bằng methanol từ lá cây hoa sữa phơi khô có khả năng AGIs ruột non của chuột Năm 2002, Ye và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết một loại thảo mộc Trung

Quốc tên là Ramulus mori (Sangzhi) trên chuột [7] Gần đây Phuwapraisirisan

và cộng sự (2009) đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của lá rau

Corchorus olitorius ( Thái Lan) [21]

Ngoài ra, trên thực tế còn rất nhiều loài thực vật chứa chất AGIs deoxynojirimicin hay DNJ từ lá dâu [1]) đã được các nhà khoa học nghiên cứu và công nhận Tuy nhiên, sản xuất các chất AGIs từ thực vật trên quy mô lớn rất tốn kém và phức tạp

(1-b Chất AGIs từ động vật

Năm 2009, các nhà khoa học Việt Nam và Hàn Quốc đã khám phá ra

khả năng AGIs của các hợp chất chiết xuất từ Stichopus japonicas (Hải Sâm)

[19] Nghiên cứu cho thấy nếu chiết hải sâm bằng hexan ở nồng độ 0,5mg/ml thì khả năng AGIs từ nấm men là 68% Từ dịch chiết Hải Sâm, các nhà khoa học đã thu được ba loại AGIs

c Chất AGIs từ vi sinh vật

Việc sản xuất chất AGIs bằng vi sinh vật đang thu hút sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học cũng như các nhà sản xuất vì chúng sử dụng an toàn, không có các tác dụng phụ đối với cơ thể sống Hiện nay một số chủng vi sinh vật như:

A oryzae, Actinomucor elegans, Rhizopus arrhizus, Streptomyces , Actinoplanes và Flavobacterium saccharophilium, Saccharomyces cerevisiae đã

được nghiên cứu cho sinh tổng hợp chất AGIs [10] Một số AGIs phổ biến như: acarbose - một pseudo - tetrasaccharite được thu nhận từ canh trường lên men

Actinoplanes spp SE - 50 Validamycin A từ Streptomyces hygroscopicus var limoneus Adiposin, trestatin B, cyclophellitol và CKD - 711 được lấy từ Streptomyces calvus TM - 521, Streptomyces dimorphogenes và Phellinus spp [11] Tuy nhiên AGIs từ A.oryzae là hướng nghiên cứu mới

Phần lớn các chất AGIs từ vi sinh vật có cấu trúc tương tự gốc pyranosyl của α-glucosidase, như: Acarbose và Voglibose từ vi sinh vật Acarbose (pseudotetrasaccharide được tách chiết từ dịch lên men loài

Actinoplanes SE50) là AGIs được tìm ra đầu tiên trên thế giới với giá trị IC50

= 0,5µM [22] Acarbose không làm tăng tiết insulin, không làm giảm glucose

trong máu lúc đói khi dùng điều trị ở người Sau Acarbose, năm 1984,

Kameda và cộng sự đã tìm ra valiolamine - AGIs từ vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus [15] Năm 2000, các nhà khoa học Hàn Quốc đã phát hiện cyclo (dehydroala-L-Leu), một AGIs từ dịch chiết của Penicillium sp F

70614 có khả năng AGIs của nấm men và của ruột non lợn [17]

2.2.2.2 Cơ chế tác dụng của AGIs trong điều trị bệnh tiểu đường tuýp 2

Bệnh đái tháo đường biểu hiện mức đường trong máu cao hơn 7 mmol/l Insulin là hoocmon có chức năng vận chuyển đường vào bên trong tế bào Khi thiếu insulin, đường không thể vào bên trong tế bào mà bị thải ra ngoài qua đường nước tiểu, khi ấy con người cảm thấy mệt mỏi, khát nước và giảm cân

Bệnh nhân tiểu đường được phân thành hai nhóm:

Tiểu đường tuýp 1 hay còn gọi là tiểu đường phụ thuộc insulin: Do tuyến tụy không hoạt động tạo ra đủ insulin để cân bằng đường huyết nên phải tiêm hoặc uống insulin

Tiểu đường túyp 2 hay còn gọi là tiểu đường không lệ thuộc insulin: Chiếm tỷ lệ chủ yếu của bệnh tiểu đường cơ thể người vẫn tiết ra insulin nhưng không đủ khiến đường không được đưa vào tế bào mà chỉ lưu hành trong máu Muốn điều trị bệnh này người ta chỉ cần áp dụng một chế độ ăn hợp lý là kiềm chế được bệnh

Các thuốc chữa bệnh đái tháo đường được chia làm 6 nhóm gồm: Biguanides, Sulphonylurea, Glinidines, Thiazolidinediones, chất ức chế dipeptidyl peptidase IV và hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase (AGIs) Hiện nay, một loạt các chất AGIs được sử dụng để điều trị bệnh tiểu đường như voglibose, acarbose

Các nghiên cứu trên thế giới đã làm sáng tỏ cơ sở khoa học của việc sử dụng hoạt chất AGIs để điều trị bệnh ĐTĐ như sau: Tinh bột hoặc đường, còn được gọi là cacbonhydrat cấu tạo gồm hai hay nhiều monosaccharide (glucose và fructose) Để cơ thể hấp thụ được, cacbonhydrate sẽ bị phân cắt hoàn toàn thành các monosaccharide nhờ hệ thống enzyme tiêu hóa Dưới tác dụng của enzyme α-glucosidase chúng sẽ phân cắt thành các monosaccharide tại ruột non Chất AGIs có thể kìm hãm hoạt tính enzyme α-glucosidase nên ngăn cản sự tạo thành monosaccharide từ disaccharide làm cho quá trình tổng hợp insullin diễn ra dễ dàng hơn

AGIs có trung tâm hoạt động chứa acid carboxylic AGIs là chất kìm hãm cạnh tranh Khi tiếp xúc với α-glucosidase, AGIs sẽ gắn vào trung tâm hoạt động của enzyme này và làm giảm hoạt lực của enzyme, ngăn không cho α-glucosidase thủy phân các polysaccharide thành monosaccharide nên có tác dụng điều hòa lượng đường trong máu

2.2.2.3 Ảnh hưởng của hoạt chất AGIs đến quá trình trao đổi đường trong cơ thể

Hình 2.6 Sơ đồ ảnh hưởng của chất AGIs đến quá trình trao đổi đường của cơ thể

Tinh bột Saccarose ( Glucose+Fructose)

Maltose (Glucose +Glucose)

Chất ức chế α-glucosidase Chất ức chế

Glucose Glucose Fructose Glucose

Glucose huyết Amylase

Các kết quả nghiên cứu cho thấy AGIs có tác dụng gia tăng peptide-1 dạng glucagon (GLP-1) và peptide-2 dạng glucagon (GLP-2) trong huyết tương Nằm trong vùng ngoại biên của ruột non và ruột kế GLP-1 kích thích

sự tiết insulin phụ thuộc glucose và sự sinh sôi tế bào beta GLP-2 cải thiện cấu trúc và chức năng của ruột non bằng cường cấu trúc của lông nhung và tăng hoạt tính vận chuyển vào enzyme GLP-2 làm giảm sự viêm ruột GLP-1 vad GLP-2 được tạo ra khi có sự kích thích thần kinh, hormone hoặc yếu tố dinh dưỡng AGIs có khả năng ngăn cản sự phân cắt carbohydrate nên kéo dài thời gian có mặt của carbohydrate trong ruột Do vậy một lượng lớn carbohydrate sẽ đến vùng ngoại biên của ruột non và tương tác với tế bào Langerhans làm tăng sự tiết GLP-1 và GLP-2 Người ta cho rằng glucose ở ngoại biên ruột non sẽ bị lên men tạo các acid béo chuỗi ngắn và kích thích tiết GLP-1 và GLP-2 hoặc quá trình vận chuyển glucose phụ thuộc vào natri khi qua màng tế bào Langerhans sẽ kích thích sự tiết GLP-1 và GLP-2 Nồng

độ GLP-1 trong huyết tương tăng thúc đẩy quá trình kiểm soát glycemic và cản trở sự có mặt glucose trong máu [19]

2.3 Trích ly hoạt chất AGIs từ đậu đen lên men

2.3.1 Cơ sở của quá trình trích ly

Trích ly (chiết) là phương pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp)

để tách lấy một chất hay một nhóm các chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu Trường hợp thường gặp nhất là sự chiết hoạt chất từ dung dịch nước vào dung môi hữu cơ Dung môi có tỷ trọng nhỏ hơn sẽ ở lớp trên như: Eter, benzene, các hyđrocacbua,… dung môi có tỷ trọng lớn hơn sẽ ở lớp dưới như: Chloroform, tetracloriccacbon, đicloetan… Khi trộn lẫn hai pha nước và dung môi hữu cơ với nhau, pha này có thể khuếch tán một ít sang pha kia nhưng về

cơ bản một pha vẫn là nước và pha kia vẫn là dung môi hữu cơ Khi lắc hai pha lại với nhau, thể tích hai pha khi lắc không bằng đúng như thể tích trước khi lắc Tuy nhiên để cho đơn giản, giả thiết rằng thể tích của pha là không đổi khi lắc Trích ly nhằm mục đích điều chế hay phân tích

Một hệ trích ly có thể là: Trích ly lỏng - rắn; Trích ly lỏng - lỏng Dựa vào trạng thái của nguyên liệu và đặc tính của dung môi người ta chia làm:

- Trích ly tĩnh là trong suốt quá trình trích ly nguyên liệu và dung môi không được đảo trộn

- Trích ly động là nguyên liệu và dung môi được khuấy trộn để tăng sự tiếp xúc, nhờ đó mà hiệu suất trích cao hơn

Trong quá trình trích ly tùy loại nguyên liệu mà gia nhiệt hoặc không gia nhiệt Loại nguyên liệu ít bị biến đổi hay biến đổi theo chiều hướng có lợi khi gia nhiệt thì có thể gia nhiệt trong quá trình để tăng khả năng hòa tan của các cấu tử nguyên liệu, làm thời gian trích ly nhanh hơn

Dựa vào phương pháp, số bậc trích ly có thể chia thành trích ly gián đoạn gồm:

- Trích ly đơn (chiết một lần): Toàn bộ quá trình thực hiện trong một

thiết bị trích ly, nguyên liệu và dung môi tiếp xúc một lần Phương pháp thường cho hiệu suất thấp

- Trích ly lặp (chiết nhiều lần): Nếu hệ số phân bố không đủ lớn thì

phải chiết nhiều lần như chiết một lần thì lượng chất tan còn trong dịch chiết lượng đáng kể người ta cho thêm dung môi chiết mới và chiết một hoặc nhiều lần nữa Nhờ đó mà đường đi của dung môi được kéo dài tạo điều kiện cho dung môi bão hòa chất tan Toàn bộ quá trình vẫn thực hiện trên một thiết bị Hiệu suất phương pháp cao hơn chiết đơn nhưng tốn dung môi, thời gian và công suất Tùy thuộc vào chiều chuyển động của dung môi và nguyên liệu ta

có trích ly nhiều lần xuôi dòng và ngược dòng Trích ly nhiều lần ngược dòng

là cho dung môi vào dung dịch cần ly chiết chạy ngược dòng nhau Đây là một quá trình liên tục, mục đích tách hai hay nhiều chất tan ra bằng một loạt

sự phân chia giữa hai pha lỏng - lỏng Nguyên tắc chiết lỏng - lỏng là chuyển chất cần phân tích trong dung môi thứ nhất sang dung môi thứ hai và điều kiện chất đó không tan trong dung môi thứ nhất

Việc chọn loại hình trích ly sao cho hiệu suất cao nhất với chi phí về dung môi, thời gian, thiết bị dễ chế tạo và vận hành là cần thiết Một số phương pháp hòa tan chiết xuất bao gồm:

- Phương pháp ngâm: Chuẩn bị nguyên liệu cho vào cột có kích thước

nhất định Đổ dung môi ngâm qua đêm Dịch chiết thu được đem cô đuổi dung môi thu hoạt chất

- Phương pháp ngấm kiệt: Cho nguyên liệu vào bình ngâm nhỏ giọt,

lót một lớp bông thấm nước lên trên ống thoát dịch để nguyên liệu không gây tắc bình và lẫn vào dịch chiết Đặt giấy lọc đã cắt vừa vặn với tấm kim loại có đục lỗ ở đáy bình Cho từ từ nguyên liệu đã được làm ẩm vào bình vừa san đều và nén nhẹ Cho tới 2/3 thể tích bình đặt giấy lọc và để các bi thủy tinh hoặc các tấm sứ, thép không gỉ có đục lỗ lên trên mặt nguyên liệu tránh khối nguyên liệu bị xáo trộn khi đổ dung môi Đổ dung môi vào bình và ngâm lạnh, mở khóa ống thoát dịch chiết rồi đổ dung môi tới khi có vài giọt dịch chiết chảy ra, đóng khóa lại Đổ dung môi cho tới khi cách mặt nguyên liệu 3

- 4cm, ngâm lạnh 22 - 24 giờ Sau đó mở khóa cho dịch chiết chảy ra từng giọt vào bình hứng Thể tích dịch chiết/1 phút là 0,5 - 1ml

- Phương pháp trích ly bằng thiết bị Soxhlet: Chuẩn bị nguyên liệu,

bọc giấy, bịt 2 đầu rồi đặt vào trụ chiết Dùng dung môi chiết trong thời gian nhất định Sau khi thực hiện các chu trình chiết lấy dịch chiết ra đem cô chân không thu được hoạt chất thô

Trong quá trình trích ly để thu hoạt chất AGIs cũng dựa vào nguyên tắc chung của quá trình trích ly Do đó việc lựa chọn phương pháp trích ly sao cho hiệu quả cao nhất với chi phí về dung môi thời gian, thiết bị đơn giản và

dễ vận hành nhất

2.3.2 Phương pháp trích ly hoạt chất AGIs

Theo nghiên cứu của Kawabata và cộng sự năm 2001có thể sử dụng các dung môi hữu cơ có cực như methanol, ethanol, propanol, ethyl axetate, hexan để chiết chất AGIs từ nấm mốc lên men trên môi trường đậu tương Người ta cũng có thể sử dụng kết hợp nước và rượu theo tỷ lệ khác nhau 1/10 hoặc 10/1 hay 1/5 hoặc 5/1 Quá trình trích ly được thực hiện như sau: Đậu đen sau khi lên men được ngâm trong hỗn hợp (nước và rượu) tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1/15 chiết xuất ở nhiệt độ 40 - 600C trong 1 - 3 giờ Hoặc

ở nhiệt độ 300

C trong 10 giờ đến 7 ngày Nếu sử dụng nước để chiết xuất: Đậu lên men sau khi xay, ngâm trong nước với tỷ lệ nước /nguyên liệu là 1/20, chiết xuất ở 40 - 600C trong 12 - 20 giờ hoặc 100 - 1400C trong 1 - 3 giờ Giá trị IC50 là 0,5 - 0,55mg/ml [15]

Theo Fujita H, Yamagami và cộng sự năm 2007 bột đậu đen sau lên men được xay, ngâm với nước theo tỷ lệ nguyên liệu/nước là 1/5 Sau đó chiết xuất bằng nước nóng 800C, dịch trích ly sau khi ly tâm và lọc sẽ được sấy

phun tạo dạng bột màu nâu sáng (bột Tuochi chiết xuất) Xác đinh hoạt chất AGIs bằng cách xác định giá trị IC50 (IC50 của bột Tuochi là 0,05 - 0,55mg/ml) [4]

2.4 Tinh chế hoạt chất AGIs từ đậu đen lên men

2.4.1 Cơ sở của quá trình tinh chế AGIs từ đậu đen lên men

Bản chất của quá trình tinh chế AGIs là loại bỏ những tạp chất để thu được một AGIs tinh khiết nhất

Theo các nghiên cứu cho thấy, hoạt chất AGIs từ đậu đen lên men là những chất có trọng lượng phân tử dưới 3000Da Dịch chiết thu được trong quá trình trích ly có chứa 30 - 90% là những chất có trọng lượng phân tử từ 3000Da trở lên Vì vậy việc lựa chọn phương pháp tinh chế có ảnh hưởng trực tiếp tới hiệu suất thu hồi và hoạt tính của hoạt chất

Theo nghiên cứu của Kawabata và cộng sự (2001), có thể sử dụng

nhiều phương pháp để loại bỏ thành phần có trọng lượng phân tử từ 3000Da trở lên như sử dụng phương pháp lọc màng, phương pháp phân tách hai pha nước hoặc sử dụng các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, propanol, butanol, chloroform, ethyl acetate, toluene, hexane hoặc bezen Thí nghiệm cho thấy sản phẩm sau tinh chế có khả năng ức chế lớn gấp 2 đến 1000 lần so với chất chiết thu được sau trích ly [15]

Theo nghiên cứu của Min-Gu Kang và cộng sự năm 2013, tinh chế hoạt chất ức chế α-glucosidase từ đậu đen lên men bằng chủng Aspergillus oryzae (A.oryzae) đã sử dụng hàng loạt các phương pháp sắc ký, sử dụng sắc kí lọc

gel sephadex G-25 đã xác định được trọng lượng phân tử là 360,1Da IC50 có giá trị là 3,1mg/ml [18]

2.4.2 Các phương pháp tinh chế

2.4.2.1 Phương pháp lọc màng

Màng lọc là một kỹ thuật được sử dụng để tách các hạt riêng biệt từ một chất lỏng nhằm mục đích tinh hóa nó Trong lọc màng, một dung môi

được thông qua một màng bán thấm Tính thấm của màng được xác định bởi các kích thước của các lỗ chân lông màng, và nó sẽ hoạt động như một rào cản đối với các hạt lớn hơn các lỗ chân lông, trong khi phần còn lại của dung môi có thể vượt qua một cách tự do qua màng Kết quả là một chất lỏng làm sạch và lọc ở một bên của màng tế bào, với chất tan còn lại ở phía bên kia Có nhiều phương pháp khác nhau để đưa chất nào đó thấm qua một màng, một số phương pháp được áp dụng như: Màng siêu lọc, màng tinh lọc, màng lọc Nano, màng thẩm thấu ngược

Tuy nhiên, để lọc được những chất có trọng lượng phân tử dưới 3000Da thì người ta thường dùng đến màng siêu lọc, một số màng siêu lọc

hay được sử dụng như: UF màng “PLBC” của Millipore hoặc UF màng “SEP 1013” của Akikasei

Theo Kawabata và cộng sự (2001), 30g chất thu được sau khi cô đặc

dịch trích ly được tinh sạch bằng phương pháp lọc màng cho ra 5,8g chất rắn khô có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase lên đến 90,4% trong đó chất có trọng lượng phân tử lớn hơn 3000Da chiếm 15% [15]

2.4.2.2 Phương pháp phân tách hai pha nước

Cơ sở kỹ thuật của phương pháp này dựa vào sự phân bố khác nhau của hỗn hợp trong dung dịch hai pha không hòa tan vào nhau Các hệ hai pha đặc trưng bằng cách trộn các hệ dung môi vào nhau để tạo thành hai pha riêng biệt

Một nghiên cứu khác cho thấy khi thêm một hỗn hợp của ethyl acetate

và nước theo tỷ lệ 1/2 vào dịch chiết đã được cô đặc và đặt trong kênh phân tách thì nó được phân chia thành hai lớp,một lớp hòa tan trong nước và một lớp hòa tan trong ethyl acetate Việc xác định hoạt tính chỉ ra rằng các chất hòa tan trong nước có hoạt tính ức chế là 91,4%, chất tan trong ethyl acetate

có hoạt tính ức chế không đáng kể

2.4.2.3 Phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ

Đây là phương pháp được cho là đơn giản hơn các phương pháp trên nhưng cũng thu được hoạt tính cao nhất Việc bổ sung dung môi hữu cơ vào chất chiết đã được cô đặc với tỷ lệ thích hợp nhằm mục đích kết tủa chất có trọng lượng phân tử cao để loại bỏ chúng ra ngoài và thu được các chất hòa tan trong dung môi

Theo Kawabata và cộng sự (2001), sử dụng ethanol để hòa tan các chất

trong dịch chiết đã được cô đặc có trọng lượng phân tử thấp có thể thu được hoạt tính lên đến 90,8% [15]

2.4.2.4 Phương pháp sắc ký lọc gel

Phương pháp sắc ký lọc gel là dựa trên sự khác nhau về kích thước, hình dạng và trọng lượng phân tử của các chất có trong hỗn hợp

Theo nghiên cứu của Fujita và cộng sự (2007), trong phương pháp lọc

gel, sử dụng gel sephadex G-75, những chất có trọng lượng phân tử trên 3000Da sẽ đi ra trước và được loại bỏ, những chất có trọng lượng phân tử dưới 3000Da do phải đi qua các lỗ gel nên sẽ đi ra chậm hơn và được giữ lại Xác định hoạt tính cho thấy, những chất được thoát ra ngoài trước có hoạt tính thấp, chất có trọng lượng phân tử thấp được đi ra sau có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase trong khoảng 85-90% [4;9]

Theo nghiên cứu của Min-Gu Kang và cộng sự năm 2013, tinh chế hoạt

chất ức chế α-glucosidase từ đậu đen lên men bằng chủng Aspergillus oryzae (A.oryzae) đã sử dụng hàng loạt các phương pháp sắc ký, sử dụng lọc gel

sephadex G-25 đã xác định được trọng lượng phân tử là 360,1Da IC50 có giá trị là 3,1mg/ml [18]

2.5 Phương pháp thu nhận AGIs

2.5.1 Phương pháp cô đặc

Cô đặc là phương pháp dùng để nâng cao nồng độ các chất hoà tan trong dung dịch gồm 2 hai nhiều cấu tử Quá trình cô đặc của dung dịch lỏng- rắn hay lỏng - lỏng có chênh lệch nhiệt độ sôi rất cao thường được tiến hành

bằng cách tách một phần dung môi (cấu tử dễ bay hơi hơn) Tuỳ theo tính chất của cấu tử khó bay hơi (hay không bay hơi trong quá trình đó), ta có thể tách một phần dung môi (cấu tử dễ bay hơi hơn) bằng phương pháp nhiệt độ (đun nóng) hoặc phương pháp làm lạnh kết tinh

Các phương pháp cô đặc:

- Phương pháp nhiệt (đun nóng): Dung môi chuyển từ trạng thái lỏng

sang trạng thái hơi dưới tác dụng của nhiệt khi áp suất riêng phần của nó bằng

áp suất tác dụng lên mặt thoáng chất lỏng

- Phương pháp lạnh: Khi hạ thấp nhiệt độ đến một mức nào đó, một

cấu tử sẽ tách ra dưới dạng tinh thể của đơn chất tinh khiết, thường là kết tinh dung môi để tăng nồng độ chất tan Tuỳ tính chất cấu tử và áp suất bên ngoài tác dụng lên mặt thoáng mà quá trình kết tinh đó xảy ra ở nhiệt độ cao hay thấp và đôi khi ta phải dùng máy lạnh

2.5.2 Phương pháp sấy

Phương pháp sấy nóng: Trong phương pháp sấy nóng, tác nhân sấy và

vật liệu sấy được đốt nóng Do tác nhân sấy được đốt nóng nên độ ẩm tương đối φ giảm dẫn đến phân áp suất hơi nước trong tác nhân sấy giảm Mặt khác

do nhiệt độ của vật liệu sấy tăng lên nên mật độ hơi trong các mao quản tăng

và phân áp suất hơi nước trên bề mặt vật cũng tăng

Phương pháp sấy lạnh: Khác với phương pháp sấy nóng, để tạo ra sự

chênh lệch áp suất giữa hơi nước của vật liệu sấy với tác nhân sấy, người ta làm giảm áp suất hơi nước trong tác nhân sấy (bằng cách giảm ẩm trong tác nhân sấy và độ ẩm tương đối (φ)) Áp suất của môi trường không khí bên ngoài giảm xuống, độ chênh áp suất của ẩm trong vật sấy vào môi trường xung quanh tăng lên Ẩm chuyển dịch từ trong vật ra môi trường Nhiệt độ môi trường của sấy lạnh thường thấp (có thể thấp hơn nhiệt độ của môi trường bên ngoài, có khi nhỏ hơn 0C)

Phương pháp sấy thăng hoa: Phương pháp sấy thăng hoa được thực

hiện ở điều kiện nhiệt độ và áp suất thấp Chế độ làm việc thấp hơn điểm ba

thể của nước (t = 0,0098 0 C, p = 4,58mmHg) Quá trình sấy được thực hiện

trong một buồng sấy kín

Phương pháp sấy phun: Sấy phun được sử dụng để sấy khô các chất cô của

dung dịch canh trường, các chất kháng sinh động vật, các acid amin, các enzyme, các chất trích ly thu nhận được trên các môi trường dinh dưỡng rắn, các dung dịch chất lắng thu nhận được khi làm lắng enzyme bằng các dung môi vô cơ hay bằng các muối trung hoà, cũng như các phần cô chất lỏng canh trường

Phương pháp sấy chân không: Phương pháp sấy chân không được áp

dụng để sấy các loại vật liệu có chứa nhiều hàm lượng tinh dầu, hương hoa,

dược phẩm, các nông sản thực phẩm có yêu cầu nhiệt độ sấy thấp nhằm giữ nguyên chất lượng và màu sắc, không gây phá hủy, biến tính các chất

Nguyên lý cơ bản của phương pháp sấy chân không đó là sự phụ thuộc

vào áp suất điểm sôi của nước Nếu làm giảm (hạ thấp) áp suất trong một

thiết bị chân không xuống đến áp suất mà ở đấy nước trong vật bắt đầu sôi và bốc hơi sẽ tạo nên một dòng chênh lệch áp suất đáng kể dọc theo bề mặt vật, làm hình thành nên một dòng ẩm chuyển động trong vật liệu theo hướng từ trong ra bề mặt vật

2.6 Các loại bao bì dùng để bảo quản

Bảo quản các sản phẩm thực phẩm nhằm giữ hình thức và phẩm chất

của sản phẩm của thực phẩm để không bị giảm sút (nếu bảo quản không tốt thì thực phâm sẽ mất hoạt tín, biến đổi mầu sắc mùi vị) Trong thời gian bảo

quản, thực phẩm chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố: nhiệt độ, độ ẩm

Một số nghiên cứu đã xác định chế phẩm lưu trữ được ở nhiệt độ phòng trong tình trạng kín Sau khi khảo sát bao bì có trên thị trường, cho thấy phổ biến bao bì là lọ thủy tinh nút kín, túi Kraft, túi PE và túi giấy

- Bao bì thủy tinh: Là loại bao bì thực phẩm thông dụng có một số ưu

điểm như: Bền hóa học, không cho không khí và hơi nước, vi sinh vật thâm nhập Đẹp dễ trang trí trên bề mặt bao bì, tạo dáng Thủy tinh không mùi, chắn ánh sáng Tái sử dụng dễ dàng đối với các loại chai, lọ Bao bì thủy tinh như chai lọ có thể sử dụng hầu hết các dạng khác nhau của thực phẩm như dạng lỏng, dạng paste, dạng bột Tuy nhiên vẫn còn những nhược điểm trong tiêu thụ như: Nặng, giá thành sản xuất cao, dễ vỡ

Do vậy dùng lọ thủy tinh để lưu trữ chế phẩm có thể đảm bảo về chất lượng của chế phẩm, nhưng về giá thành sản xuất và vận chuyển sẽ không được thuận lợi

- Bao bì PE (Polyethylene): Được sử dụng làm túi bóng kính có ưu

điểm như: Là loại bao bì có tính ngăn cản nước và độ ẩm, cũng có tính hàn nhiệt rất tốt và vẫn giữ được tính mềm dẻo ở mật độ rất thấp nó có thể được

sử dụng ở điều kiện đông lạnh -500C Về mặt sinh lý học, không có sự bất lợi nào liên quan đến PE vì khi cháy nó chỉ sinh ra khí CO2 và nước Bên cạnh đó

còn có nhược điểm: Tuy nhiên cũng có vài bất lợi, PE có tính thấm O2 khá cao, tính ngăn ẩm và cản mùi hương bị giới hạn, ở nhiệt độ quá cao sẽ cho mùi khó chịu, chịu nhiệt kém

Do vậy dùng bao bì bằng túi PE để lưu trữ chế phẩm không phù hợp để đảm bảo chất lượng của hoạt chất ức chế trong chế phẩm và tính ổn định hàm

ẩm của chế phẩm

- Bao bì túi giấy: Được làm từ giấy Có ưu điểm như: Nhẹ, rẻ, dễ dàng

trang trí trên bề mặt bao bì, tạo hình Bên cạnh các ưu điểm còn có nhiều nhược điểm như: Là dễ dàng bị thấm nước, khí và vi sinh vật rễ xâm nhập

Do vậy dùng bao bì bằng túi giấy để lưu trữ chế phẩm không phù hợp

để đảm bảo chất lượng của hoạt chất ức chế trong chế phẩm và tính ổn định hàm ẩm của chế phẩm

- Bao bì túi Kraft: Là loại bao bì túi tráng kim loại Lớp thứ 1 nằm

trong cùng và cũng là lớp tiếp xúc với thực phẩm thì được làm từ polyethylene và bao bọc kín thực phẩm, lớp thứ 2 được làm từ polyethylene

và đóng vai trò kết dính, lớp thứ 3 là lớp nhôm, có nhiệm vụ làm rào chắn chống lại các ảnh hưởng có hại của không khí và ánh sáng, lớp thứ 4 được làm từ nylon và có nhiệm vụ kết dính, lớp thứ 5 là lớp giấy để tạo hình dạng

và độ cứng cho hộp giấy, lớp thứ 6 được làm từ nylon có tác dụng ngăn cản

độ ẩm từ bên ngoài xâm nhập vào Có khá nhiều ưu điểm như: Tương đối bền

cơ học, không cho không khí và hơi nước, vi sinh vật thâm nhập vào, ngăn được tia cực tím, bao bì nhẹ hơn và giá thành rẻ hơn so với các loại bao bì như chai lọ thủy tinh, dễ đóng gói và vận chuyển Tuy nhiên vẫn còn những nhược điểm: Không chịu được ở nhiệt độ cao Do vậy dùng bao bì bằng túi kraft để lưu trữ chế phẩm phù hợp để đảm bảo chất lượng sản phẩm không bị không khí và hơi nước, vi sinh vật thâm nhập vào chế phẩm, ngăn được tia cực tím tác động tới chế phẩm, tồn trữ chế phẩm của túi Kraft giúp vận chuyển thuận lợi, là loại bao bì hiện có bán thông dụng trên thị trường

Dựa trên các đặc tính ưu việt của loại bao bì này mà một số sản phẩm tinh chế lại lựa chọn túi Kraft để bảo quản

2.7 Tình hình nghiên cứu hợp chất AGIs trong và ngoài nước

2.7.1 Tình hình nghiên cứu hợp chất AGIs thế giới

Kaisa và cộng sự đã nghiên cứu để tìm ra các loại thực phẩm ngăn chặn bệnh tiểu đường Họ đã kiểm tra hơn 100 loại chất chiết từ thực phẩm được từ

A.oryzae với mục đích ức chế các enzym tiêu hoá và cuối cùng họ đã tìm thấy một loại chất chiết từ đậu lên men bởi chủng Aspergillus.sp có khả năng AGIs

Công ty Nippon của Nhật Bản nổi tiếng chuyên cung cấp các chất bổ sung cho sản xuất TPCN đã sản xuất được chất AGIs từ nấm mốc

Aspergillu.sp lên men đậu Họ đã chứng minh được hiệu quả và tính an toàn

của hoạt chất AGIs chiết từ đậu lên men bởi nấm mốc thực phẩm

Vào tháng 6 năm 2008, chế phẩm hoạt chất AGIs từ Aspergillus.sp lên

men đậu đã được cấp phép lưu hành tại thị trường Châu Âu, một thị trường nổi tiếng về sự quản lý nghiêm ngặt các loại sản phẩm thực phẩm Sản phẩm này đã nhận được sự đánh giá cao của Uỷ ban cố vấn Thực phẩm và Chế biến Hội đồng chung châu Âu Ở Châu Á các chất chứa hoạt chất AGIs cũng được

sử dụng nhiều như Trung Quốc là nước nổi tiếng với có hàng trăm công ty sản xuất chất chiết AGIs từ nấm mốc lên men để cung cấp cho ngành chế biến thực phẩm chức năng

Jing Chen và cộng sự năm 2001 đã nghiên cứu công nghệ sản xuất chất

AGIs từ chủng nấm mốc A.oryzae, Actinomucor elegans và Rhizopus arrhizus Nhóm tác giả cho rằng sự hình thành chất AGIs phụ thuộc vào ảnh

hưởng bởi chủng vi sinh vật cũng như các yếu tố công nghệ Nồng độ muối NaCl trong quá trình ủ chín đậu lên men cũng quyết định đến sự hình thành hoạt chất AGIs nhiều hay ít Nồng độ muối từ 10 - 12,5% đã làm giảm khả năng hình thành hoạt chất AGIs một cách đáng kể (gần 50%) Khả năng AGIs trong quá trình lên men đậu không những phụ thuộc vào chủng vi sinh vật lựa chọn mà còn chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như thời gian nuôi cấy, độ ẩm

cơ chất, pH ban đầu Bởi vậy việc tối ưu hóa quá trình nuôi cấy có ý nghĩa cho việc sản xuất hoạt chất AGIs Công nghệ chiết xuất và thu hồi chất AGIs

là một công nghệ quan trọng trong sản xuất chất AGIs từ vi sinh vật [12]

Kawabata và cộng sự nghiên cứu dung môi để chiết chất AGIs từ nấm mốc lên men trên môi trường đậu tương cho thấy quá trình tách chiết còn phụ

thuộc vào tỷ lệ dung môi cơ chất, nhiệt độ và thời gian, để cô đặc sản phẩm đã

sử dụng một số dung môi hữu cơ có cực như methanol, ethanol, propanol, ethyl axetate, hexan…và sử dụng các phương pháp như sắc ký cột, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lỏng cao áp…để tinh sạch sản phẩm Hoạt chất AGIs được sử dụng trước bữa ăn để cản trở quá trình thuỷ phân cacbonhydrat trong ruột non Các nghiên cứu của Hiroyuki Fujita và cộng sự năm 2005 cho thấy chất

chiết từ đậu lên men nấm mốc có tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase, là

enzym quan trọng trong việc điều hoà insulin trong máu [4]

Theo nghiên cứu của Min-Gu Kang và cộng sự (2013), tinh chế hoạt chất ức chế α-glucosidase từ đậu đen lên men bằng chủng Aspergillus oryzae (A.oryzae) đã sử dụng hàng loạt các phương pháp sắc ký, sử dụng sắc ký lọc

gel sephadex G-25 đã xác định được trọng lượng phân tử là 360,1Da IC50 có

giá trị là 3,1mg/ml [18]

2.7.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam có khoảng 4,5 triệu người mắc bệnh tiểu đường trong đó

có tới 65% người phát hiện bệnh muộn Dự tính đến năm 2025 có khoảng 7 triệu người mắc bệnh tiểu đường trong đó bệnh tiểu đường tuýp 2 chiếm trên 90% Những năm gần đây, trên thị trường có rất nhiều loại TPCN, trong đó loại TPCN dành cho người mắc bệnh tiểu đường có giá thành (từ vài trăm nghìn đến vài triệu) như: Viên giáp xác Tianshi, táo xoắn Tianshi, oyster Plus, tinh dầu hoa anh thảo được bày bán và quảng cáo có khả năng chữa khỏi bệnh Tuy nhiên, do mới phổ biến ở Việt Nam nên việc quản lí loại sản phẩm này còn nhiều bất cập Thêm vào đó, lợi dụng sự thiếu hiểu biết của người tiêu dùng, một số nhà phân phối đã quảng cáo quá tác dụng khiến nhiều người hiểu sai và dùng sai TPCN

Hiện nay để chữa bệnh tiểu đường người ta thường dùng các nhóm thuốc sulphonylurea và biguanidses với mục đích làm tăng hiệu lực tác dụng của insullin, tăng tính thấm màng tế bào với glucose Ngoài ra các thuốc để ức chế enzyme α-glucosidase cũng được sử dụng nhiều, nhưng các thuốc này chủ yếu được chỉ định cho những người đã mắc bệnh, trong khi xu hướng chung

là tìm cách phòng bệnh

Nước ta chưa có công trình nghiên cứu nào về công nghệ sản xuất hoạt

chất AGIs từ nấm mốc để chế biến thực phẩm cho người bệnh tiểu đường, béo

phì Các nghiên cứu mới chỉ tập trung vào tạo sản phẩm dinh dưỡng hay tạo

sản phẩm chức năng chứa peptit chuyển hóa angiotensin (ACEIP)

Trong khi đó theo đáng giá của các chuyên gia Việt Nam là nước có nguồn lợi về thảo dược và động vật dùng làm nguyên liệu cho chế biến TPCN hết sức phong phú: Việt Nam là nước có ngành Y học cổ truyền với kinh nghiệm từ hàng nghìn năm Đồng thời lực lượng công nhân của chúng ta cũng hết sức dồi dào và các công ty đã chú trọng tới chất lượng đào tạo cán bộ khoa học, kỹ thuật Chỉ tính riêng các TPCN công bố tại Bộ y tế đã khoảng

3000 loại và danh sách công bố sản phẩm ngày càng dài hơn Cũng theo các chuyên gia của Hiệp hội thực phẩm chức năng Việt Nam (VADS ) tỷ lệ % sử dụng TPCN của người dân Việt Nam đang dần gia tăng đặc biệt là khu vực thành thị Các loại TPCN thường hay dùng là cho các bệnh mãn tính có thời

gian điều trị lâu (như tim mạch, tiểu đường, ung thư, gout, viêm gan, lao ) và

các sản phẩm tăng miễn dịch như Delta immune, lô hội, gấc, tỏi, tảo xoắn sự nhận thức về các mối nguy cơ do sự ô nhiễm môi trường làm hại

tới sức khỏe đã làm mọi người ý thức bảo vệ bằng các loại TPCN

Trong những năm gần đây viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau

thu hoạch đã tuyển chọn được một số chủng A.oryzae từ nguồn đậu tương cho

tạo dịch đậu tương lên men, tận dụng phụ phẩm nông nghiệp để sản xuất thức

ăn chăn nuôi Năm 2003 Nguyễn Đức Tiến Và Cộng sự trong đề tài cấp bộ đã

đưa ra được quy trình công nghệ lên men hạt nhãn bằng chủng A.oryzae để

làm thức ăn chăn nuôi đạt được kết quả khả quan

PHẦN 3

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

- Hoạt chất ức chế enzyme α-Glucosidase trích ly từ đậu đen lên men bởi chủng nấm mốc Aspergillus oryzae do Viện Cơ điện nông nghiệp và công nghệ sau thu hoạch cung cấp

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm bộ môn Nghiên cứu phụ phẩm và Môi

trường nông nghiệp - Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch

- Địa chỉ: Số 126 phố Trung Kính - Trung Hòa - Cầu Giấy - Hà Nội

- Thời gian: Từ tháng 1/ 2014 đến tháng 6 /2014

3.3 Hoá chất và thiết bị sử dụng

*Hoá chất:

- Nước cất, Ethanol 50%, Ethanol 95%

- Hóa chất xác định hoạt chất AGIs: Na2CO3, Na2HPO4, NaH2PO4 12H2O

- Hộp petri, ống nghiệm, pipet, đèn cồn, bình tam giác, ống đong, giấy lọc

3.4 Nội dung nghiên cứu

3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng quá trình kết tủa bằng ethanol đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs

- Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ dung môi đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs

- Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ dung môi đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs

- Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs

- Tối ưu hóa điều kiện kết tủa bằng ethanol đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs

3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng quá trình cô đặc đến thu nhận hoạt chất AGIs 3.4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình sắc ký lọc gel đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs

3.4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của bao bì bảo quản đến chất lượng sản phẩm

3.4.5 Đánh giá chất lượng sản phẩm và đưa ra quy trinh tinh chế hoạt chất AGIs

3.5 Phương pháp nghiên cứu

Dịch trích ly thu được ở quá trình trích ly được lọc để loại bỏ cặn

không hòa tan, sau đó tiến hành cô 10 lít dịch trích ly bằng chân không (800C, -0,8atm) để loại dung môi, thu được dịch cô được tiến hành khảo sát tinh chế bằng ethanol ở các nồng độ: 95, 90, 85, 80% Bố trí như bảng dưới đây:

Cố định các điều kiện thí nghiệm như sau:

- Mỗi mẫu 30g dịch cô

- Tỷ lệ dịch chiết/dung môi: 1/4

- Dung môi: Ethanol

- Nhiệt đô: 250C

- Sau phản ứng để hỗn hợp lắng qua đêm(12h)

Hỗn hợp thu được đem lọc qua giấy lọc, tách riêng được phần dịch và phần kết tủa Xác định hoạt chất AGIs ở mỗi phần thu được

b Nghiên cứu ảnh hưởng lựa chon tỷ lệ dịch chiết/dung môi đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs

- Khảo sát các tỉ lệ giữa dịch chiết/dung môi khác nhau tương ứng là: 1/1, 1/2, 1/3 và 1/4 Bố trí như bảng sau đây:

Tỷ lệ dịch chiết/dung

môi

- Cố định các điều kiện thí nghiệm như sau:

- Mỗi mẫu 30g dịch cô

- Dung môi: Ethanol

- Nhiệt độ: 250C

- Nồng độ dung môi: Theo mục 3.5.1.1.a

- Sau phản ứng để hỗn hợp lắng qua đêm (12h)

Mỗi công thức lặp lại 3 lần

- Phương pháp xác định: Hỗn hợp thu được đem lọc qua giấy lọc thu được phần dịch, xác định hàm lượng chất ức chế enzyme α-Glucosidase Từ thí nghiệm này ta tìm được tỉ lệ nguyên liệu/dung môi tối ưu nhất

c, Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs Khảo sát các nhiệt độ khác nhau được bố trí thí nghiệm ở bảng sau:

Cố định các điều kiện nghiên cứu thí nghiệm như sau:

- Mỗi mẫu 30g dịch cô

- Dung môi: Ethanol

- Nồng độ dung môi Theo mục 3.5.1.1.a

- Tỷ lệ dịch chiết/ dung môi Theo mục 3.5.1.1.b

- Sau phản ứng để hỗn hợp lắng qua đêm (12h)

- Mỗi công thức lặp lại 3 lần

- Phương pháp xác định: Hỗn hợp thu được đem lọc qua giấy lọc thu được phần dịch, xác định hàm lượng chất ức chế enzyme α-Glucosidase Từ thí nghiệm này ta tìm được nhiệt độ tinh chế thích hợp nhất