Nghiên cứu quy trình giám định 11-Nor-9-Cacboxyl-Delta-9-Tetrahydrocannabinol trong nước tiểu của người bằng GC-MS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ TUYẾN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH 11-NOR-9-CACBOXYL-DELTA-9-TETRAHYDROCANNABINOL TRONG NƯỚC TIỂU CỦA NGƯỜI BẰNG GC-MS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ TUYẾN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH 11-NOR-9-CACBOXYL-DELTA-9-TETRAHYDROCANNABINOL TRONG NƯỚC TIỂU CỦA NGƯỜI BẰNG GC-MS Chuyên ngành: Hóa Phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Xuân Trường Hà Nội – 2014 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Xuân Trường đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, động viên và tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành luận văn này. Em xin cảm ơn các thầy, cô giáo Khoa Hóa, trường Đại học Khoa học tự nhiên đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, đặc biệt là sự chỉ bảo của PGS.TS.Nguyễn Văn Ri. Em cũng xin chân thành cảm ơn Ths. Hoàng Ngọc Mai, cùng các anh chị Trung tâm giám định ma túy - Viện Khoa học hình sự đã rất nhiệt tình giúp đỡ, động viên, truyền đạt lại nhiều kinh nghiệm quý báu cho em. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn lãnh đạo phòng PC54 –CATP Hà Nội cùng các đồng nghiệp trong đội giám định Hóa học- phòng PC54 – CATP Hà Nội đã hết sức tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã hỗ trợ, là chỗ dựa vững chắc giúp tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2014 Học viên Nguyễn Thị Tuyến MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Cần sa, các chế phẩm từ cần sa và các hoạt chất chính của cần sa 3 1.1.1. Cần sa 3 1.1.2. Các chế phẩm từ cần sa 5 1.1.3. Tác hại của việc sử dụng cần sa 6 1.1.4. Các thành phần hóa học của cần sa có ý nghĩa trong khoa học hình sự 7 1.1.5. Thời gian phát hiện và đối tượng phân tích đối với người sử dụng cần sa 9 1.1.6. THC và sự chuyển hóa THC trong nước tiểu 10 1.1.7. THC-COOH 12 1.2. Một số phương pháp phân tích THC-COOH 13 1.2.1. Phương pháp phân tích THC-COOH bằng sắc ký lỏng 13 1.2.2. Phương pháp phân tích THC-COOH bằng sắc ký khí 17 1.3. Một số các nghiên cứu về phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký khí đã được công bố 20 1.4. Nguyên tắc phương pháp nghiên cứu xác định THC-COOH bằng GC-MS . 22 1.5. Cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS 22 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 24 2.1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 24 2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu 24 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu 24 2.1.3. Nội dung nghiên cứu 25 2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 26 2.2.1. Hóa chất 26 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị 27 2.3. Phương pháp nghiên cứu 28 2.3.1. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu 28 2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu 28 2.4. Thực nghiệm 29 2.4.1. Khảo sát điều kiện phân tích trên thiết bị GC-MS Triple Quad 7000 29 2.4.2. Khảo sát điều kiện thủy phân và dẫn xuất 30 2.4.3. Khảo sát dung môi chiết 30 2.4.4. Khảo sát môi trường (pH) chiết 31 2.4.5. Khảo sát hiệu suất chiết 31 2.4.6. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị 31 2.4.7. Xây dựng đường chuẩn 32 2.4.8. Đánh giá phương pháp phân tích 32 2.4.9. Phân tích mẫu thực tế 33 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1. Kết quả khảo sát điều kiện phân tích THC-COOH trên GC-MS 34 3.2. Kết quả khảo sát điều kiện thủy phân và dẫn xuất 40 3.3. Kết quả khảo sát điều kiện tối ưu cho quá trình chiết 40 3.3.1. Kết quả khảo sát dung môi chiết 40 3.3.2. Kết quả khảo sát môi trường chiết (pH) 43 3.3.3. Kết quả khảo sát hiệu suất chiết 44 3.4. Phương pháp định lượng THC-COOH 44 3.4.1. Kết quả xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị 44 3.4.2. Xây dựng đường chuẩn 45 3.4.3. Kết quả đánh giá tính phù hợp của phương pháp 47 3.4.4. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp 48 3.4.5. Quy trình giám định THC-COOH trên thiết bị GC-MS 49 3.5. Ứng dụng quy trình vào phân tích mẫu thực tế 51 3.6. Hướng phát triển của đề tài 51 KẾT LUẬN 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC 56 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Các thành phần hóa học của cần sa có ý nghĩa trong KHHS 7 Bảng 1.2. Hàm lượng THC thay đổi tùy vào các bộ phận của cây cần sa 8 Bảng 1.3. Thời gian phát hiện trên các đối tượng mẫu 9 Bảng 1.4. Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký lỏng 15 Bảng 1.5. Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký khí 21 Bảng 2.1. Thông tin một số mẫu nước tiểu bị bắt giữ 25 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến quá trình chiết 41 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết 43 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát hiệu suất chiết 44 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của THC-COOH 45 Bảng 3.5. Kết quả so sánh giữa giá trị a với 0 của phương trình đường chuẩn 47 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 47 Bảng 3.7. Hiệu suất thu hồi trên nền mẫu thật 48 Bảng 3.8. Kết quả định lượng thu được từ một số mẫu thực 51 DANH MỤC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1. Các đặc điểm hình thái đặc trưng của cây cần sa 4 Hình 1.2. Cần sa trồng trong nhà 5 Hình 1.3. Sơ đồ quá trình chuyển hóa THC trong nước tiểu 12 Hình 1.4. Sắc đồ của THC-COOH khi phân tích bằng LC- MS 16 Hình 1.5. Phổ khối của THC-COOH khi phân tích bằng LC-MS 16 Hình 1.6. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí và vận hành 19 Hình 1.7. Sự tạo thành và dẫn xuất THC-COOH 22 Hình 1.8. Cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS 23 Hình 2.1. Một số mẫu nước tiểu bị bắt giữ 24 Hình 3.1. Phổ khối của THC-COOH chuẩn 35 Hình 3.2. Sắc ký đồ của THC-COOH-2TMS ở CTN I 36 Hình 3.3. Phổ khối của THC-COOH-2TMS ở CTN I 37 Hình 3.4. Sắc ký đồ của THC-COOH-2TMS ở CTN II 38 Hình 3.5. Phổ khối của THC-COOH-2TMS ở CTN II 39 Hình 3.6. Ảnh hưởng của dung môi đến quá trình chiết 42 Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết 43 Hình 3.8. Đường chuẩn xác định THC-COOH 46 Hình 3.9. Sơ đồ quy trình xử lý, tách chiết THC-COOH trong mẫu nước tiểu 50 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT THC Delta 9 –tetrahydrocannabinol CBN Canabinol CBD Cannabidiol THC-COOH 11-nor-9-cacboxyl-delta-9-tetrahydrocannabinol TMCS Trimetylclosilan BSTFA N,O-bis- (trimetylsilyl) trifloaxetamit TMS Trimetylsilyl IS Internal standard (Chất nội chuẩn) PFPA/PFPOH Pentafluoropropionic anhydride/pentafluoropropanol MSTFA 2,2,2-Trifluoro-N-methyl-N-(trimethylsilyl)acetamide EtOAc Etylaxetat LOD Limit of detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Limit of quantity (Giới hạn định lượng) HPLC High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) GC Gas Chromatography (Sắc ký khí) GC-MS Gas chromatography–mass spectrometry (Sắc ký khí khổi phổ) LC-MS Liquid chromatography–mass spectrometry (Sắc ký lỏng khối phổ) KHHS Khoa học hình sự CTN Chương trình nhiệt 1 MỞ ĐẦU Từ lâu người ta đã biết đến ma túy là những chất có tác dụng làm thay đổi trạng thái tâm lý và sinh lý của người sử dụng, có khả năng bị lạm dụng và gây ra sự phụ thuộc về tâm, sinh lý vào việc sử dụng các chất đó. Khi ngừng dùng chất ma túy, người nghiện thường không kiểm soát được hành vi của mình, tìm mọi cách để có ma túy sử dụng tiếp, có khuynh hướng gia tăng liều lượng nhằm thỏa mãn trạng thái tinh thần, cảm giác mong muốn. Đó là nguyên nhân làm gia tăng các loại tội phạm hình sự như trộm cắp, giết người, cướp của, mại dâm, là nguyên nhân của rất nhiều tội phạm kinh tế như buôn lậu, gian lận, tham nhũng [3]. Cùng với các loại ma túy gây hậu quả nghiêm trọng tới đời sống xã hội như thuốc phiện và các chất nhóm Opiat, các chất kích thích thần kinh nhóm Amphetamine, nhóm Cocain, các thuốc an thần gây ngủ nhóm Benzodiazepine, các thuốc an thần gây ngủ nhóm Barbiturat, hiện nay loại ma túy gây ảo giác Cần sa đang ngày càng được giới trẻ sử dụng nhiều. Người sử dụng cần sa có thể bị rối loạn thần kinh, gây mất thăng bằng, chóng mặt, rối loạn tình dục, làm giảm khả năng sinh sản, làm trụy thai, chết thai thậm chí gây rối loạn nhiễm sắc thể nếu sử dụng lâu dài. Từ cần sa người 61 chất khác nhau, với thành phần chủ yếu là THC (delta 9 –tetrahydrocannabinol), CBN (canabinol), CBD (cannabidiol). Trong đó THC là hoạt chất chính gây ra tác dụng tâm lý tới người sử dụng cần sa.[16] Cần sa được dùng chủ yếu bằng cách hút. Sau khi hút 24 giờ, khoảng 50% lượng THC bị đào thải dưới dạng chuyển hóa, 50% còn lại được phân bố trong toàn cơ thể, chủ yếu ở các mô mỡ, sau đó bị đào thải từ từ trong những ngày tiếp theo. Khi bài tiết trong nước tiểu, chủ yếu là các sản phẩm oxy hóa THC-COOH (11-nor-9-cacboxyl-delta-9-tetrahydrocannabinol) và các sản phẩm liên hợp với một hoặc hai phân tử axit glucuronic của THC-COOH [3]. Đây chính là các đối tượng để kiểm tra việc sử dụng cần sa. 2 Việc phân tích THC-COOH trong nước tiểu có thể thực hiện bằng phân tích miễn dịch, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hay bằng sắc ký khí (GC), tuy nhiên HPLC là phương pháp tốn kém hơn do giá thành dung môi tương đối đắt. Phương pháp sắc ký khí có hiệu quả tách rất cao, thời gian phân tích nhanh, độ nhạy và độ chọn lọc cao. Vì thế chúng tôi lựa chọn sử dụng thiết bị sắc ký khí khối phổ để xác định THC-COOH. Từ hiện trạng sử dụng và mức độ nguy hại mà cần sa đem đến cho người sử dụng nó, đồng thời để phục vụ cho công tác giám định ma túy, đề tài này chúng tôi tập trung “Nghiên cứu quy trình giám định 11-nor-9-cacboxyl-delta- 9-tetrahydrocannabinol trong nước tiểu của người bằng thiết bị sắc ký khí khối phổ” nhằm kiểm tra phát hiện đối tượng sử dụng cần sa. [...]... tích hàm lượng THC-COOH trong nước tiểu bằng quy trình đã lựa chọn được trên GC-MS 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu Các mẫu nước tiểu nghi sử dụng cần sa Các mẫu nước tiểu đều được thử phản ứng miễn dịch với kít thử cần sa Thông tin về một số mẫu nước tiểu bị thu giữ theo lời khai của đối tượng như sau: Hình 2.1 Một số mẫu nước tiểu bị bắt giữ 24 Bảng 2.1 Thông tin một số mẫu nước tiểu bị bắt giữ Ký hiệu... nước bọt và hơi thở Vì thế, lấy mẫu nước tiểu sẽ thuận lợi đối với điều kiện tại các phòng thí nghiệm giám định Hóa học của các tỉnh thành trong cả nước cũng như Viện KHHS của Bộ công an hiện nay Thời gian để phát hiện được cần sa trong nước tiểu phụ thuộc rất lớn vào tần suất sử dụng, đối với những người sử dụng thường xuyên (trên một lần một tuần), dạng chuyển hóa của THC là THC-COOH trong nước tiểu. .. ng/ml [5] 9 Xét nghiệm nước tiểu có thể dựa trên sự phát hiện THC-COOH, một dạng chuyển hóa của THC, nó là thành phần mang hoạt tính dược lý chính của cần sa Các nghiên cứu trên cơ thể người chỉ ra rằng, 80-90% tổng số THC được bài tiết trong vòng 5 ngày, khoảng 20% trong nước tiểu và 65% trong phân [11] Trong huyết tương nồng độ THC cao nhất sau khi hút một liều thường rơi vào 2ng/ml trong 4-6 giờ, và... dụng bằng cách 90 ml hút, mới hút 1 lần 2.1.3 Nội dung nghiên cứu Sau khi dẫn xuất THC-COOH, tiến hành bơm dung dịch này để phân tích trên GC-MS Cùng với sự kế thừa các nghiên cứu về phân tích THC-COOH, để xây dựng quy trình phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ, trong luận văn này các vấn đề sau đây được nghiên cứu: - Lựa chọn và khảo sát lại điều kiện thủy phân và... Pha rắn MSTFA GC-MS COOH-d3; THCCOOH-d9 21 - 0,1-500 (r=1) 1.4 Nguyên tắc phương pháp nghiên cứu xác định THC-COOH bằng GC-MS Hoạt chất chính của cần sa khi được đưa vào trong cơ thể người là THC, qua quá trình chuyển hóa sẽ chuyển thành THC-OH rồi sau đó chuyển sang dạng liên hợp glucuronic của THC-COOH, tiến hành thủy phân trong môi trường kiềm mạnh để chuyển dạng liên hợp glucuronic của THC-COOH... trên GC-MS có thể phân mảnh theo cơ chế sau: 22 Hình 1.8 Cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS 23 CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.1 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu Để xác định THC-COOH trong nước tiểu, cần khảo sát các điều kiện thủy phân, môi trường pH để chiết lỏng - lỏng, dung dịch chiết, hiệu suất chiết, chất dẫn xuất và điều kiện dẫn xuất trước khi đưa vào phân tích bằng máy GC-MS. .. x) Với thiết bị phân tích hiện đại GC-MS Agilent 7000 các thông số làm việc của máy như nhiệt độ, tốc độ dòng…có độ ổn định tốt, các lần bơm mẫu có độ lặp lại cao nên chúng tôi dùng phương pháp ngoại chuẩn để phân tích định lượng [1] 1.3 Một số các nghiên cứu về phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký khí đã được công bố Dưới đây là bảng một số các nghiên cứu về phân tích THC-COOH với các điều... phân tử - Sắc ký ái lực Mỗi phương pháp có đặc điểm riêng về pha tĩnh và pha động, detector cũng như cách vận hành [2] Một số các nghiên cứu về phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký lỏng đã công bố: 14 Bảng 1.4 Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký lỏng STT Tác nhân và nhiệt độ thủy phân 1 β-glucuronidase ở [13] 37oC/20 giờ 2 KOH 10M [6] 50oC/20 phút 3 β-glucuronidase/... đối với người sử dụng cần sa [5] Bảng 1.3 Thời gian phát hiện trên các đối tượng mẫu Mẫu Nước tiểu Máu Người sử dụng một lần 1-7 ngày 12-24 giờ 7-100 ngày 2-7 ngày Người sử dụng thường xuyên Tóc Nước bọt Không chắc Không có giá chắn trị Hàng tháng 0-24 giờ Có thể kiểm tra huyết tương, nước bọt, mẫu tóc, hơi thở để phát hiện cần sa trong cơ thể người sử dụng, tuy nhiên việc xét nghiệm nước tiểu được... THC Oxy hóa THC-COOH mono/diglucuronic THC-COOH Hình 1.3 Sơ đồ quá trình chuyển hóa THC trong nước tiểu 1.1.7 THC-COOH THC-COOH được hình thành trong cơ thể do quá trình oxy hóa THC bởi các enzyme của gan Sau đó, tiếp tục chuyển hóa thành dạng glucuronic, tạo thành một hợp chất tan được trong nước và có thể dễ dàng bài tiết trong cơ thể người [13] Công thức phân tử: C21H28O4 Khối lượng phân tử: 344,445 . NHIÊN NGUYỄN THỊ TUYẾN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH 11-NOR-9-CACBOXYL-DELTA-9-TETRAHYDROCANNABINOL TRONG NƯỚC TIỂU CỦA NGƯỜI BẰNG GC-MS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC. TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ TUYẾN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH 11-NOR-9-CACBOXYL-DELTA-9-TETRAHYDROCANNABINOL TRONG NƯỚC TIỂU CỦA NGƯỜI BẰNG GC-MS Chuyên ngành: Hóa Phân tích Mã. THC-COOH bằng sắc ký khí 17 1.3. Một số các nghiên cứu về phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký khí đã được công bố 20 1.4. Nguyên tắc phương pháp nghiên cứu xác định THC-COOH bằng GC-MS