Sau khi bơm lặp lại 10 lần dung dịch chuẩn THC-COOH có nồng độ 10 ng/ml (10 ppb) đã được dẫn xuất thành THC-COOH-2TMS trên thiết bị GC-MS,
độ lệch chuẩn được xác định như đã trình bày ở chương 2, chúng tôi thu được giới hạn giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị đối với THC- COOH-2TMS lần lượt là: 0,9 ng/ml và 2,9 ng/ml.
3.4.2. Xây dựng đường chuẩn
Chất chuẩn dùng để pha nhằm xây dựng đường chuẩn với 7 điểm nồng độ nằm trong khoảng từ 10-2000 ng/ml. Mỗi nồng độ bơm một lượng dẫn xuất tương ứng, lặp lại 3 lần và lấy trung bình. Kết quả ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của THC-COOH
[THC-COOH] (ng/ml) STHC-COOH-2TMS Lần 1 STHC-COOH-2TMS Lần 2 STHC-COOH-2TMS Lần 3 STHC-COOH-2TMS Trung bình 10 113583 118262 112171 114672 50 578217 589241 624257 597238 250 2791191 3008012 3114510 2971238 500 5794173 6093128 5954061 5947121 1000 9931744 11248722 13327980 11502815 1500 16907125 18053440 18513943 17824836 2000 22664504 24089856 24401104 23718488
Hình 3.8. Đường chuẩn xác định THC-COOH
- Kiểm tra sự khác nhau có nghĩa giữa hệ số a và giá trị 0 [4]
Trong phương trình hồi qui y = a + bx, trường hợp lý tưởng xảy ra khi a=0. Tuy nhiên, trong thực tế các số liệu phân tích thường mắc sai số ngẫu nhiên luôn làm cho a≠0. Nếu giá trị a khác “0” có nghĩa thống kê thì phương pháp phân tích sẽ mắc sai số hệ thống. Vì vậy, trước khi sử dụng đường chuẩn cho phân tích cần kiểm tra xem sự khác nhau giữa giá trị a và giá trị 0 không có ý nghĩa thống kê không.
Nếu xem a ≈ 0 thì phương trình được viết thành phương trình y = b’x. Thay các giá trị yi và xi vào phương trình y = b’x ta sẽ được các giá trị b’i là trung bình cộng các giá trị bi thu được.
Sau đó đánh giá sự sai khác giữa giá trị a và giá trị 0 theo chuẩn F (tính theo tỷ số của hai phương sai của hai phương trình sao cho F >1) và so sánh giá trị này với F(P, f1, f2) với P = 0,95 với f1, f2 là bậc tự do (f1=n-3, f2=n-2, n là số điểm trên đường chuẩn).
Phương sai của 2 phương trình được tính như sau:
2 ) ( 2 ) ˆ ( 2 2 2 n bx a y n y y Sy i i i i ) ( ) ˆ ( ' 2 ' 2 2 ' y y y bx S i i i i
Chuẩn F được tính như sau: 2 2 ' y y tinh S S F
Bảng 3.5. Kết quả so sánh giữa giá trị a với 0 của phương trình đường chuẩn
PT hồi quy Sy2 S'y2 Ftính Fbảng
y = -27884 +11840.x 1,73.1016 3,30.1016 1,91 5,19
Ta thấy Ftính < Fbảng với tất cả các phương trình đường chuẩn của THC- COOH. Vì vậy có thể kết luận được giá trị a và 0 khác nhau không có ý nghĩa thống kê, hay phương pháp xác định THC-COOH không mắc sai số hệ thống. 3.4.3. Kết quả đánh giá tính phù hợp của phương pháp
Để đánh giá RSD của phương pháp, tiến hành các thí nghiệm độc lập ở nồng độ đầu và nồng độ cuối đường chuẩn ở nồng độ 10 ppb và 2000 ppb. Kết
quả thu được tính toán theo công thức % RSD = . 100%. Kết quả như sau:
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp
STT 10 ppb 2000 ppb tR (phút) STHC-COOH-2TMS tR (phút) STHC-COOH-2TMS 1 11,627 120173 11,630 24375873 2 11,624 115237 11,636 24247912 3 11,615 109462 11,627 23958390 4 11,611 110791 11,638 25010389 5 11,613 122011 11,640 25391841 TB 11,618 115535 11,634 24596881 RSD (%) 0,06 4,80 0,05 2,39
Kết quả phân tích cho thấy, THC-COOH-2TMS có thời gian lưu xác định. Giá trị RSD rất nhỏ, RSD của thời gian lưu và tỉ lệ diện tích chất phân tích ở các
điểm nồng độ đầu và nồng độ cuối của đường chuẩn đều nhỏ hơn 5%, như vậy hệ thống sắc ký phù hợp, có độ lặp lại tốt, độ chính xác cao, áp dụng được cho phân tích định tính và định lượng trên sắc ký được.
3.4.4. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp
Tiến hành độc lập 3 thí nghiệm với mẫu nước tiểu dương tính của cùng một đối tượng để khảo sát hiệu suất thu hồi:
-Thí nghiệm I : Lấy vào lọ thủy tinh có nắp 10 ml nước tiểu, xử lý và phân tích theo quy trình đã được tối ưu.
-Thí nghiệm II: Lấy vào lọ thủy tinh có nắp 10 ml nước tiểu, thêm dung dịch chuẩn 10 µl THC-COOH 50 ppb, xử lý và phân tích theo quy trình đã được tối ưu.
-Thí nghiệm III: Lấy vào lọ thủy tinh có nắp 10 ml nước tiểu, thêm dung dịch chuẩn 10 µl THC-COOH 1500 ppb, xử lý và phân tích theo quy trình đã được tối ưu.
Sau khi lặp lại mỗi thí nghiệm 3 lần, kết quả thu được trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Hiệu suất thu hồi trên nền mẫu thật
[THC- COOH] thêm vào (ng/ml) STHC-COOH-2TMS STHC-COOH-2TMS Trung bình [THC-COOH] tìm được (ng/ml) H (%) 0 842649 852550 74,4 868730 846270 50 1346137 1353616 116,7 93,8 1364360 1350352 1500 17742897 17840234 1509,1 95,6 17864911 17912893
Với hiệu suất thu được ứng với 2 nồng độ THC-COOH thêm vào là 50 ppb và 1500 ppb đạt 93,8 % và 95,6 % cho thấy, phương pháp có độ thu hồi tốt. Do đó kết quả phân tích là đáng tin cậy.
3.4.5. Quy trình giám định THC-COOH trên thiết bị GC-MS
Trên cơ sở kế thừa các nghiên cứu đã công bố đã tối ưu các điều kiện đã khảo sát cho thấy phương pháp có độ lặp lại tốt, độ chính xác cao, hiệu suất thu hồi tốt đáp ứng được yêu cầu phân tích định tính và định lượng, do đó chúng tôi xây dựng được quy trình xử lý mẫu để phân tích THC-COOH trong mẫu nước tiểu của đối tượng bị bắt giữ như sau:
Hình 3.9. Sơ đồ quy trình xử lý, tách chiết THC-COOH trong mẫu nước tiểu HCl 2M đến pH=2 3 ml đệm pH=2 20 ml n-hexan/etylaxetat (9/1) 20 µl BSTFA chứa 1% TMCS 2 ml KOH 10M 10 ml nước tiểu
Thủy phân trong 20 phút ở 500C
Lắc trong 30 phút, phân lớp
Thu dịch chiết, loại nước bằng Na2SO4 khan
Cô chân không, thu cặn chiết
Chuyển sang lọ dẫn xuất, rửa bằng 0,2 ml Metanol, lắc siêu âm
Thổi khô bằng dòng khí N2
Dẫn xuất trong 20 phút ở 90oC
3.5. Ứng dụng quy trình vào phân tích mẫu thực tế
Từ quy trình đã được khảo sát và tối ưu, tiến hành phân tích với 5/6 mẫu bắt được dương tính với que thử miễn dịch cần sa trong nước tiểu. Kết quả thu được trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả định lượng thu được từ một số mẫu thực
STT STHC-COOH-2TMS Lần 1 STHC-COOH- 2TMS Lần 2 STHC-COOH-2TMS Lần 3 STHC-COOH-2TMS Trung bình Khối lượng THC-COOH (ng/ml) M1 373729 359827 394023 375860 34,1 M2 780945 771801 799532 784092 68,6 M3 862841 884299 892446 879862 76,7 M4 1954728 1986471 1991763 1977654 169,4 M5 301249 328625 325033 318302 29,2
Kết quả cho thấy, hàm lượng THC-COOH trong mẫu nước tiểu phù hợp với lời khai của đối tượng. Đối tượng có tiền sử sử dụng cần sa và đối tượng mới sử dụng cần sa có hàm lượng THC-COOH trong mẫu nước tiểu cao hơn các đối tượng ít sử dụng và đã sử dụng lâu ngày so với thời điểm lấy mẫu phân tích. Như vậy, với đối tượng sử dụng cần sa thường xuyên hàm lượng THC-COOH có thể lên tới vài trăm ng/ml. Từ kết quả hàm lượng THC-COOH thu được trên một số mẫu nước tiểu có thể đánh giá lại được tiền sử và mức độ sử dụng cần sa của đối tượng.
3.6. Hướng phát triển của đề tài
Với những kết quả tin cậy đạt được qua quá trình khảo sát các yếu tố cũng như xây dựng quy trình phân tích THC-COOH trong nước tiểu của người bằng sắc ký khí khổi phổ, phương pháp có thể áp dụng và triển khai tại các phòng thí nghiệm của địa phương để phục vụ cho công tác giám định ma túy.
Ngoài đối tượng phân tích là mẫu nước tiểu, hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất là có thể áp dụng phân tích với các đối tượng mẫu khác như mẫu máu, nước bọt nhằm đa dạng hình thức lấy mẫu trên thiết bị GC-MS hoặc GC- MS/MS để tăng độ nhạy của phép phân tích. Đồng thời có thể tiến hành phân tích THC-COOH trong các đối tượng mẫu trên thiết bị HPLC, LC-MS để giảm bớt bước dẫn xuất hóa.
KẾT LUẬN
Trên cơ sở khảo sát các yếu tố chúng tôi thu được các kết quả sau: * Điều kiện tối ưu trên thiết bị GC-MS với chương trình nhiệt độ:
120oC (2 phút) 200oC 280oC (5 phút)
Tổng cộng: 13,933 phút - Các mảnh ion THC-COOH-2TMS: 73; 147; 209; 297; 355; 371; 398; 417; 432; 473; 488...
- Ion mảnh: 371.
* Khảo sát được phương pháp chiết lỏng lỏng với dung môi chiết THC- COOH trong nước tiểu là n-hexan/etylaxetat (9/1, v/v), thể tích dung môi chiết là 20 ml.
* Khảo sát được môi trường chiết THC-COOH trong nước tiểu tốt nhất là pH=2, môi trường chiết là HCl 2M, dung dịch đệm xitrat pH=2.
* Hiệu suất của quá trình chiết đạt 96,2%.
* Xây dựng được đường chuẩn phân tích định lượng THC-COOH trong khoảng 10-2000 ng/ml với hệ số tương quan r2 = 0,9998.
- Xác định được giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị là LOD= 0,9 ng/ml; LOQ= 2,9 ng/ml.
* Đánh giá được tính phù hợp của phương pháp với RSD ở hai điểm nồng độ đầu và nồng độ cuối của đường chuẩn nhỏ.
* Hiệu suất thu hồi trên nền mẫu thực cao 93,8 % và 95,6%.
* Xây dựng được quy trình phân tích THC-COOH trong mẫu nước tiểu của người sử dụng cần sa.
* Ứng dụng phân tích trên một số mẫu nước tiểu nghi sử dụng cần sa với hàm lượng từ 29,2 ng/ml – 169,4 ng/ml tùy thuộc vào tiền sử sử dụng cần sa và thời gian tính từ thời điểm sử dụng lần cuối đến thời điểm lấy mẫu nước tiểu phân tích bao lâu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Phạm Hùng Việt (2005), Sắc ký khí – Cơ sở lý thuyết và khả năng ứng dụng,
Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.
2. Nguyễn Văn Ri (2009), Các phương pháp táchTrường ĐH Khoa học Tự nhiên. 3. Tạ Thị Thảo (2006), Bài giảng Thống kê trong Hóa phân tích, Trường ĐH
Khoa học Tự nhiên.
4. Trần Minh Hương (2004), Các chất ma túy thường gặp và phương pháp giám
định trong mẫu phẩm sinh học, Nhà xuất bản Công an nhân dân.
Tiếng Anh
5. California NORML Guide Interpreting Drug Test Results (2012), Marijuana
Drug Test Detection Time.
6. D. Bourquin, R. Brenneisen (1987), Determination of the major Δ9- tetrahydrocannabinol metabolite in urine by high-performance liquid chromatography andphotodiode array detection, Analytica Chimica Acta, Vol
198, pp 183-189.
7. Eirin Berge Steinshamn (2009), Development of an analytical method for
detection and quantification of cannabis and cannabinoid analogues in urine,
Master in analytical chemistry thesis for the Norwegian pharmacy degree candidates pharmaciae.
8. Eugene W. Schwilke, David M. Schwope, Erin L. Karschner, Ross H. Lowe, William D. Darwin, Deanna L. Kelly, Robert S. Goodwin, David A. Gorelick
and Marilyn A. Huestis (2009), Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC), 11-Hydroxy- THC, and 11-Nor-9-carboxy-THC Plasma Pharmacokinetics during and after Continuous High-Dose Oral THC, Clinical Chemistry, pp. 2180-2189.
9. Fishburne PM, Abelson HI, Cisin I, (1979) National survey on drug abuse: main
10. Gehaltstatistik (2009), Swiss Federal Office of Public Health, THC Statistics,
p.p. 17-19.
11. Hunt AC, Jones RT (1980), Tolerance and disposition of THC in man. Pharm
Exp Ther, pp. 215:135-44.
12. K.J.S.De Cock, F.T.Delbeke, D.De Boer, P.Van Eenoo, and K.Roels (2003)
Quantitation of 11-nor-∆9-Tetrahydrocannabinol-9-carboxylic acid with GC-MS in Urine Collected for Doping Analysis, Journal of Analytical Toxicolog, Vol 27, pp 106-109.
13. Law, B; Mason, PA; Moffat, AC; King, LJ (1984). "Confirmation of cannabis
use by the analysis of delta 9-tetrahydrocannabinol metabolites in blood and urine by combined HPLC and RIA" Journal of analytical toxicology, pp. 19-22.
14. Marcello Chiarotti, Luisa Costamagna (2000), Analysis of 11-nor-9-carboxy-
∆9-tetrahydrocannabinol in biological samples by gas chromatography tandem mass spectrometry (GC/MS-MS), Forensic Science International, Vol 114, pp 1-6.
15. M. Felli, S. Martello, M. Chiarotti (2011), LC–MS–MS method for simultaneous
determination of THCCOOH and THCCOOH-glucuronide in urine: Application to workplace confirmation tests, Forensic Science International, Vol 204, pp 67-73.
16. Narcotics Division (1998), Manual for identification of abused drugs,
Pharmaceutical and Medical Safety Bureau Ministry of Health and Welfare, Japan.
17. Perez-Reyes M, Guiseppi SD, Mason AP, Davis KH (1983), Passive
inhalation of marijuana smoke and urinary excretion of cannabinoids. Clin
Pharmacol Ther; pp. 34:36-41.
18. Peter R. Stout, Carl K. Horn, and Kevin L. Kalette (2001), Solid-Phase
Extraction and GC-MS Analysis of THC-COOH Method Optimized for a High- Throughput Forensic Drug-Testing Laboratory, Journal of Analytical Toxicolog,
Vol 25, pp 550-554.
19. Shanlin Fu and John Lewis (2008), Novel Automated Extraction Method for
Quantitative Analysis of Urinary 11-nor-∆9-Tetrahydrocannabinol- 9-Carboxylic Acid (THC-COOH), Journal of Analytical Toxicolog, Vol 32, pp 292-297.
20. United Nations international drug control programe (1995), Recommended
methods for the detection and assay of Heroin, Cannabinoids, Cocaine, Amphetamine, Methamphetamine and Ring-substituted Amphetamine Derivatives in biological specimens, United Nations, New York, pp. 31-41.
21. UNODC United Nations office on drugs and crime (2009), Recommended
Methods for the Identification and Analysis of Cannabis and Cannabis Products,
United Nations, New York. pp. 8-9; 21-23.
22. Vandana Dixit and Vyas M. Dixit (1991) Solid-phase extraction of l l-nor-A-
9-tetrahydrocannabinol-9-carboxylic acid from human urine with gas chromatographic-mass spectrometric confirmation, Journal of Chromatography B:
Biomedical Sciences and Applications, Vol 567, pp 81-91.
23. Wolfgang Weinmann*, Susanne Vogt, Rolf Goerke, Claudia Mu¨ller, Andreas
Bromberger (2000), Simultaneous determination of THC-COOH and
PHỤ LỤC
Danh mục các hình tham khảo:
Hình 1. Sắc ký đồ của mẫu M1. Hình 2. Phổ khối của mẫu M1. Hình 3. Sắc ký đồ mẫu M2. Hình 4. Phổ khối của mẫu M2. Hình 5. Sắc ký đồ của mẫu M3. Hình 6. Phổ khối của mẫu M3. Hình 7. Sắc ký đồ mẫu M4. Hình 8. Phổ khối của mẫu M4. Hình 9. Sắc ký đồ của mẫu M5. Hình 10. Phổ khối của mẫu M5.
Hình 11. Sắc ký đồ khảo sát bằng dung môi n-hexan/etylaxetat (9/1). Hình 12. Phổ khối khảo sát bằng dung môi n-hexan/etylaxetat (9/1). Hình 13. Sắc ký đồ khảo sát ở môi trường pH=2.