Sau khi lựa chọn được hệ dung môi tốt nhất cho việc chiết mẫu, cố định dung môi và khảo sát môi trường pH trong khoảng pH = 1 ÷ 4.
Lấy vào lọ thủy tinh có nắp: 10 ml nước tiểu dương tính, thực hiện thủy phân theo điều kiện đã chọn trên. Thêm dung dịch HCl 2M để điều chỉnh pH đến các giá trị pH=1; pH=2; pH=3; pH=4. Thêm 3 ml dung dịch đệm có pH tương ứng. Thêm 20 ml dung môi chiết đã tối ưu được, lắc bằng máy lắc trong 30 phút. Xử lý mẫu sau khi chiết, bơm 1 µl mẫu vào GC-MS để phân tích. Mỗi thí nghiệm lặp lại ba lần và lấy kết quả trung bình. Kết quả được trình bày trong chương 3. 2.4.5. Khảo sát hiệu suất chiết
Tiến hành độc lập hai thí nghiệm sau:
- Thí nghiệm I: Lấy vào lọ sắc ký dung dịch chuẩn THC-COOH 500 ppb, làm khô rồi đem dẫn xuất.
- Thí nghiệm II: Lấy vào lọ thủy tinh có nắp 10 ml nước tiểu trắng, thêm 50 µl dung dịch chuẩn THC-COOH 500 ppb, điều chỉnh đến pH đã tối ưu bằng dung dịch HCl 2M, thêm 20 ml dung môi đã tối ưu, tiến hành chiết và xử lý mẫu trước khi phân tích trên GC-MS.
Tiến hành phân tích ở cùng một điều kiện trên GC-MS đã tối ưu được. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình. Kết quả được trình bày trong chương 3.
2.4.6. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị
Giới hạn phát hiện của thiết bị (LOD) và giới hạn định lượng của thiết bị (LOQ) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích có ý nghĩa định lượng so với tín hiệu nền.
LOD và LOQ được xác định dựa vào sai số giữa các lần bơm một dung dịch có nồng độ nhỏ của chất cần phân tích lên thiết bị. Ban đầu tiến hành bơm lặp dung dịch này 7-10 lần. Sau đó, tính độ lệch chuẩn SD theo công thức:
Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn
xi: lượng chất phân tích trong mẫu lặp i
x: lượng chất phân tích trung bình trong mẫu lặp N: số mẫu lặp lại
Với độ tin cậy cần đạt là 99% thì
Giới hạn phát hiện của thiết bị: LOD ≈ 3 x SD Và giới hạn định lượng của thiết bị: LOQ ≈ 10 x SD
Trong luận văn này chúng tôi lặp lại 10 lần dung dịch chuẩn THC-COOH có nồng độ 10 ng/ml (10 ppb) đã được dẫn xuất thành THC-COOH-2TMS trên thiết bị GC-MS, thể tích bơm mẫu là 1 µl.
2.4.7. Xây dựng đường chuẩn
Mẫu chuẩn được chuẩn bị ở 7 nồng độ đã xác định khác nhau trong khoảng từ 10-2000ng/ml, sau đó được dẫn xuất bằng BSTFA chứa 1% TMCS. Mỗi điểm nồng độ tiến hành đo 3 lần để xác định và loại trừ những giá trị khác biệt.
2.4.8. Đánh giá phương pháp phân tích - Độ chụm - Độ chụm
Người ta thường sử dụng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) hay còn gọi là hệ số biến thiên (CV %) hơn là độ lệch chuẩn (SD) do có thể đánh giá được độ lệch chuẩn chiếm bao nhiêu % giá trị trung bình và có cái nhìn rõ hơn về độ chụm của các số liệu trong tập số liệu lặp lại [4]. % RSD được xác định theo công thức:
RSD (%) = . 100%
Để đánh giá RSD, tiến hành các thí nghiệm độc lập ở điểm đầu và điểm cuối đường chuẩn. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Kết quả được trình bày trong chương 3.
- Hiệu suất thu hồi
Mục đích để đánh giá hiệu suất thu hồi là kiểm tra xem chất chuẩn được thêm vào được trộn đều với nền mẫu thế nào và tính chất của nền mẫu có giống với nền mẫu ban đầu hay không. Sử dụng mẫu thêm chuẩn để đánh giá độ thu hồi của phương pháp xử lý mẫu. Mẫu thực tế dương tính được thêm một lượng nhất
định chuẩn THC-COOH vào ở 2 mức nồng độ 50 ppb, 1500ppb, sao cho tổng hàm lượng THC-COOH sau khi xử lý không bị vượt quá đường chuẩn. Xử lý mẫu và phân tích theo quy trình đã chọn. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, và lấy kết quả trung bình. Kết quả được trình bày trong chương 3. Hiệu suất thu hồi được xác định theo công thức sau:
100% x 0 C C C H spike blank
Trong đó: Cspike: nồng độ của mẫu thêm chuẩn (ppb) Cblank: nồng độ của mẫu nền (ppb)
C0: nồng độ chuẩn được thêm chuẩn (ppb) 2.4.9. Phân tích mẫu thực tế
Sau khi khảo sát và tối ưu được quy trình phân tích, tiến hành khảo sát trên các mẫu thực thu được từ các vụ án để định tính và định lượng nồng độ THC- COOH trong mẫu nước tiểu của đối tượng sử dụng cần sa. Kết quả phân tích mẫu thực sẽ được trình bày trong chương 3.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả khảo sát điều kiện phân tích THC-COOH trên GC-MS
Để tối ưu quá trình phân tích trên GC-MS đảm bảo khả năng tách tốt nhất, tiến hành phân tích mẫu chuẩn ở chương trình nhiệt khác nhau như đã trình bày ở chương hai.
Dưới đây là phổ khối của THC-COOH chuẩn, sắc ký đồ của THC-COOH- 2TMS, phổ khối của THC-COOH-2TMS ở hai chương trình nhiệt độ phân tích khác nhau và cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS.
Chương trình nhiệt thứ nhất:
100oC (2 phút) 270oC (20 phút)
Tổng cộng: 30,5 phút Chương trình nhiệt thứ hai:
120oC (2 phút) 200oC 280oC (5 phút)
Tổng cộng: 13,933 phút 200C/ phút
Như vậy, sắc ký đồ trong hai điều kiện phân tích trên không có sự khác nhau nhiều, sắc ký đồ đều cho pic đặc trưng sắc nét, phổ khối cho các mảnh phù hợp với cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS. Tuy nhiên thời gian lưu của THC-COOH-2TMS ở điều kiện phân tích thứ hai ngắn hơn, nên tiết kiệm được thời gian phân tích. Do vậy, chương trình sắc ký thứ hai được lựa chọn để phân tích.
Theo cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS có 3 mảnh chính và đặc trưng là mảnh m/z = 371; 473; 488. Tuy nhiên mảnh m/z 371 cho tín hiệu cao nhất đồng thời đặc trưng nhất, phù hợp với cơ chế phân mảnh của THC-COOH- 2TMS nên sẽ được lựa chọn làm mảnh cho phân tích định lượng.
3.2. Kết quả khảo sát điều kiện thủy phân và dẫn xuất
- Điều kiện thủy phân: Kết quả khảo sát điều kiện thủy phân với cùng tác nhân là môi trường kiềm mạnh (KOH 10M) ở 3 nhiệt độ 50oC; 55oC; 60oC thu được diện tích pic THC-COOH-2TMS không có thay đổi đáng kể, tức là ở nhiệt độ 50oC, quá trình thủy phân coi như đã hoàn toàn.
Vì vậy lựa chọn điều kiện thủy phân là: Môi trường kiềm mạnh KOH 10M, nhiệt độ thủy phân là 50oC trong thời gian 20 phút.
- Điều kiện dẫn xuất: Kết quả khảo sát điều kiện dẫn xuất với cùng chất dẫn xuất là BSTFA chứa 1% TMCS ở các điều kiện: 90oC trong 20 phút; 90oC trong 30 phút; 100oC trong 20 phút cho thấy diện tích pic THC-COOH-2TMS không có thay đổi đáng kể, chứng tỏ ở điều kiện 90oC trong 20 phút quá trình dẫn xuất đã xảy ra hoàn toàn.
Vì thế, lựa chọn điều kiện dẫn xuất là: BSTFA chứa 1% TMCS ở 90oC trong 20 phút.
3.3. Kết quả khảo sát điều kiện tối ưu cho quá trình chiết 3.3.1. Kết quả khảo sát dung môi chiết 3.3.1. Kết quả khảo sát dung môi chiết
Khảo sát khả năng chiết THC-COOH trên 6 hệ dung môi: iso-octan; n- hexan/etylaxetat (9:1,v/v); n-hexan/etylaxetat (7:3,v/v); metylencloride/2-
propanol/etyaxetat (1:1:3,v/v/v); etylaxetat/dietyete (1:1, v/v); xyclohexan/etylaxetat (7:1,v/v): 10 ml nước tiểu dương tính, thực hiện thủy phân theo điều kiện đã chọn trên. Đo pH của mẫu, rồi điều chỉnh đến pH =2 bằng dung dịch HCl 2M. Thêm 3ml dung dịch đệm pH = 2. Thêm 20 ml dung môi chiết. Lắc bằng máy lắc trong 30 phút. Xử lý mẫu sau khi chiết, dẫn xuất, bơm 1 µl mẫu vào GC-MS để phân tích. Kết quả thu được trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến quá trình chiết
Dung môi STHC-COOH-2TMS Lần 1 STHC-COOH-2TMS Lần 2 STHC-COOH-2TMS Lần 3 STHC-COOH-2TMS Trung bình Isooctan 32132 37509 37419 35686 n-hexan/EtOAc (9:1, v/v) 98635 99737 110469 102947 n-hexan/EtOAc (7:3, v/v) 96814 94213 94708 95245 Metylencloride/2- propanol/EtOAc (1:1:3,v/v/v) 54163 50391 49733 51429 EtOAc/dietyete (1:1, v/v) 88025 85564 85707 86432 Xyclohexan/EtOAc (7:1,v/v) 89786 90176 91917 90626
Hình 3.6. Ảnh hưởng của dung môi đến quá trình chiết
Nhìn vào đồ thị ảnh hưởng của dung môi tới quá trình chiết, ta thấy khả năng chiết của các dung môi n-hexan/EtOAc (9/1); n-hexan/EtOAc (7/3); EtOAc/dietylete (1/1); xyclohexan/EtOAc (7/1) không chênh lệch nhau nhiều. Tuy nhiên, hệ có dung môi dietylete dễ bay hơi hơn, nên độ lặp lại không cao, dễ gây sai số, đồng thời độc hại.
Đồng thời dựa vào diện tích pic trung bình của THC-COOH-2TMS, ta thấy khả năng tách của hỗn hợp dung môi n-hexan/etylaxetat (9:1, v/v) là tốt nhất, chiết còn ít tạp, hiệu quả chiết cao nhất, n-hexan là dung môi có độ phân cực cao còn etylaxetat có độ phân cực thấp hơn sẽ làm cho khả năng tách THC-COOH dễ nhất, đồng thời chúng là dung môi dễ mua, ít tốn kém, thường được sử dụng trong các phòng thí nghiệm phân tích ma túy tại các địa phương, ít độc hại hơn so với các dung môi còn lại.
Vì vậy, để tối ưu quá trình phân tích, hỗn hợp dung môi n-hexan/etylaxetat (9:1, v/v) được lựa chọn để tách THC-COOH ra khỏi nước tiểu của đối tượng sử dụng cần sa.
3.3.2. Kết quả khảo sát môi trường chiết (pH)
Môi trường chiết là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới hiệu suất của quá trình chiết: Lấy vào lọ thủy tinh có nắp10 ml nước tiểu dương tính, thực hiện thủy phân theo điều kiện đã chọn trên. Thêm dung dịch HCl 2M để điều chỉnh pH đến các giá trị pH=1; pH=2; pH=3; pH=4. Thêm 3 ml dung dịch đệm có pH tương ứng. Thêm 20 ml dung môi chiết đã tối ưu được, lắc bằng máy lắc trong 30 phút. Xử lý mẫu sau khi chiết, bơm 1 µl mẫu vào GC-MS để phân tích. Kết quả thu được trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết
pH STHC-COOH-2TMS Lần 1 STHC-COOH-2TMS Lần 2 STHC-COOH-2TMS Lần 3 STHC-COOH-2TMS Trung bình 1,0 637708 661257 664912 654626 2,0 751335 785403 793884 776874 3,0 680955 706057 718497 701836 4,0 500237 557645 563977 540620
Nhận xét: Như vậy ở môi trường chiết pH=2, diện tích pic thu được của THC-COOH-2TMS là lớn nhất, đồng thời lượng tạp chất trên sắc đồ cũng ít nhất cho thấy khả năng chiết THC-COOH ở môi trường pH=2 cho kết quả tốt hơn so với các pH =1; pH = 2; pH =3. Vì vậy lựa chọn dung dịch HCl để điều chỉnh đến pH=2 làm môi trường chiết nhằm tối ưu quy trình chiết.
3.3.3. Kết quả khảo sát hiệu suất chiết
Sau khi tiến hành 2 thí nghiệm phân tích chuẩn THC-COOH riêng biệt: - Thí nghiệm I: Lấy vào lọ sắc ký dung dịch chuẩn THC-COOH 500 ppb, làm khô rồi đem dẫn xuất.
- Thí nghiệm II: Lấy vào lọ thủy tinh có nắp 10 ml nước tiểu trắng, thêm 50 µl dung dịch chuẩn THC-COOH 500 ppb, điều chỉnh đến pH =2 bằng dung dịch HCl 2M, thêm 20 ml dung môi hexan/etylaxetat (9:1, v/v), tiến hành chiết và xử lý mẫu trước khi phân tích trên GC-MS. Kết quả thu được trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát hiệu suất chiết
Thí nghiệm ( TN) STHC-COOH-2TMS Lần 1 STHC-COOH-2TMS Lần 2 STHC-COOH-2TMS Lần 3 STHC-COOH-2TMS Trung bình TN 1 5927379 5976343 5836589 5913437 TN 2 5548371 5709186 5817481 5691679 Hiệu suất (H%) 96,2
Kết quả thí nghiệm chiết với tỉ lệ thể tích nước tiểu và dung môi là 1:2 cho hiệu suất chiết THC-COOH đạt 96,2% khá cao, cho thấy quy trình phân tích THC-COOH trong nước tiểu đạt yêu cầu phân tích lượng vết và có thể áp dụng vào mẫu thực từ các vụ án bắt được.
3.4. Phương pháp định lượng THC-COOH
3.4.1. Kết quả xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị Sau khi bơm lặp lại 10 lần dung dịch chuẩn THC-COOH có nồng độ 10 Sau khi bơm lặp lại 10 lần dung dịch chuẩn THC-COOH có nồng độ 10 ng/ml (10 ppb) đã được dẫn xuất thành THC-COOH-2TMS trên thiết bị GC-MS,
độ lệch chuẩn được xác định như đã trình bày ở chương 2, chúng tôi thu được giới hạn giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị đối với THC- COOH-2TMS lần lượt là: 0,9 ng/ml và 2,9 ng/ml.
3.4.2. Xây dựng đường chuẩn
Chất chuẩn dùng để pha nhằm xây dựng đường chuẩn với 7 điểm nồng độ nằm trong khoảng từ 10-2000 ng/ml. Mỗi nồng độ bơm một lượng dẫn xuất tương ứng, lặp lại 3 lần và lấy trung bình. Kết quả ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của THC-COOH
[THC-COOH] (ng/ml) STHC-COOH-2TMS Lần 1 STHC-COOH-2TMS Lần 2 STHC-COOH-2TMS Lần 3 STHC-COOH-2TMS Trung bình 10 113583 118262 112171 114672 50 578217 589241 624257 597238 250 2791191 3008012 3114510 2971238 500 5794173 6093128 5954061 5947121 1000 9931744 11248722 13327980 11502815 1500 16907125 18053440 18513943 17824836 2000 22664504 24089856 24401104 23718488
Hình 3.8. Đường chuẩn xác định THC-COOH
- Kiểm tra sự khác nhau có nghĩa giữa hệ số a và giá trị 0 [4]
Trong phương trình hồi qui y = a + bx, trường hợp lý tưởng xảy ra khi a=0. Tuy nhiên, trong thực tế các số liệu phân tích thường mắc sai số ngẫu nhiên luôn làm cho a≠0. Nếu giá trị a khác “0” có nghĩa thống kê thì phương pháp phân tích sẽ mắc sai số hệ thống. Vì vậy, trước khi sử dụng đường chuẩn cho phân tích cần kiểm tra xem sự khác nhau giữa giá trị a và giá trị 0 không có ý nghĩa thống kê không.
Nếu xem a ≈ 0 thì phương trình được viết thành phương trình y = b’x. Thay các giá trị yi và xi vào phương trình y = b’x ta sẽ được các giá trị b’i là trung bình cộng các giá trị bi thu được.
Sau đó đánh giá sự sai khác giữa giá trị a và giá trị 0 theo chuẩn F (tính theo tỷ số của hai phương sai của hai phương trình sao cho F >1) và so sánh giá trị này với F(P, f1, f2) với P = 0,95 với f1, f2 là bậc tự do (f1=n-3, f2=n-2, n là số điểm trên đường chuẩn).
Phương sai của 2 phương trình được tính như sau:
2 ) ( 2 ) ˆ ( 2 2 2 n bx a y n y y Sy i i i i ) ( ) ˆ ( ' 2 ' 2 2 ' y y y bx S i i i i
Chuẩn F được tính như sau: 2 2 ' y y tinh S S F
Bảng 3.5. Kết quả so sánh giữa giá trị a với 0 của phương trình đường chuẩn
PT hồi quy Sy2 S'y2 Ftính Fbảng
y = -27884 +11840.x 1,73.1016 3,30.1016 1,91 5,19
Ta thấy Ftính < Fbảng với tất cả các phương trình đường chuẩn của THC- COOH. Vì vậy có thể kết luận được giá trị a và 0 khác nhau không có ý nghĩa thống kê, hay phương pháp xác định THC-COOH không mắc sai số hệ thống. 3.4.3. Kết quả đánh giá tính phù hợp của phương pháp
Để đánh giá RSD của phương pháp, tiến hành các thí nghiệm độc lập ở nồng độ đầu và nồng độ cuối đường chuẩn ở nồng độ 10 ppb và 2000 ppb. Kết
quả thu được tính toán theo công thức % RSD = . 100%. Kết quả như sau:
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp
STT 10 ppb 2000 ppb tR (phút) STHC-COOH-2TMS tR (phút) STHC-COOH-2TMS 1 11,627 120173 11,630 24375873 2 11,624 115237 11,636 24247912 3 11,615 109462 11,627 23958390 4 11,611 110791 11,638 25010389 5 11,613 122011 11,640 25391841 TB 11,618 115535 11,634 24596881 RSD (%) 0,06 4,80 0,05 2,39