Sau khi dẫn xuất THC-COOH, tiến hành bơm dung dịch này để phân tích trên GC-MS. Cùng với sự kế thừa các nghiên cứu về phân tích THC-COOH, để xây dựng quy trình phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ, trong luận văn này các vấn đề sau đây được nghiên cứu:
- Lựa chọn và khảo sát lại điều kiện thủy phân và dẫn xuất. - Khảo sát dung môi chiết.
- Khảo sát môi trường chiết (pH). - Đánh giá hiệu quả chiết.
- Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn phát hiện (LOQ) - Xây dựng đường chuẩn của THC-COOH.
- Đánh giá tính phù hợp của phương pháp: Độ lệch chuẩn tương đối, hiệu suất thu hồi…
- Ứng dụng: Phân tích trên các mẫu nước tiểu nghi sử dụng Cần sa bị bắt giữ. 2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.1. Hóa chất
* Mẫu chuẩn THC-COOH Arlesheim, Thụy Sỹ do Liên hợp quốc cấp với lượng chính xác là 0,1 mg.
* Các hóa chất còn lại đều là hóa chất tinh khiết dùng trong phân tích (đạt tiêu chuẩn PA):
- Dung dịch HCl 36,5% (dùng để pha dung dịch HCl 2M và dung dịch đệm), (Merck, Đức).
- NaOH, axit xitric (C6H8O7.H2O) để pha các dung dịch đệm Xitrat pH = 1, pH = 2, pH = 3, pH =4.
- KOH (dùng để pha dung dịch KOH 10M).
- Muối khan Na2SO4 (Merck, Đức) được nung ở 2500 C trong 2h trước khi sử dụng.
- Nước cất hai lần.
- Khí N2 kỹ thuật 99% dùng để đuổi dung môi.
- Khí He tinh khiết dùng làm khí mang cho thiết bị GC/MS.
- Chất dẫn xuất N,O-bis- (trimetylsilyl) trifloaxetamit (BSTFA) chứa 1% trimetylclosilan (TMCS) hãng Sigma-Aldrich.
- Các dung môi tinh khiết: Xyclohexan, etylaxetat, dietylete, methanol, n- hexan, isooctane, metylencloride, 2-propanol, (Merck, Đức).
- Kít thử miễn dịch Acon, Mỹ.
* Cách pha các dung dịch chuẩn và dung dịch đệm như sau:
+ Dung dịch chuẩn gốc THC-COOH nồng độ 2000 ng/ml được chuẩn bị như sau: 0,1 mg chuẩn THC-COOH được pha với hỗn hợp dung môi n- hexan/etylaxetat (9:1, v/v), định mức đến 50 ml. Dùng dung dịch chuẩn này để pha loãng với các dung dịch chuẩn có nồng độ nhỏ hơn nằm trong khoảng từ 10 ÷ 2000 ng/ml bao gồm: 10; 50; 250; 500; 1000; 1500; 2000 ng/ml. Các dung dịch chuẩn này sau đó được làm khô bằng dòng khí nitơ, thêm dung dịch BSTFA chứa
1% TMCS rồi dẫn xuất và phân tích trên sắc ký. Sau khi phân tích và dựng đường chuẩn, sẽ sử dụng các kết quả nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn cho mục đích phân tích định lượng THC-COOH có mặt trong nước tiểu của đối tượng sử dụng cần sa.
+ Dung dịch đệm pH=1: Cho vào bình định mức loại 250 ml các hóa chất sau: 0,388 gam NaOH; 1,019 gam axit xitric và 1,547 ml dung dịch HCl 36,5%, thêm 100 ml nước cất, lắc cho tan rồi định mức đến 250 ml.
+ Dung dịch đệm pH=2: Cho vào bình định mức loại 250 ml các hóa chất sau: 0,562 gam NaOH; 1,608 gam axit xitric và 1,470 ml dung dịch HCl 36,5%, thêm 100 ml nước cất, lắc cho tan rồi định mức đến 250 ml.
+ Dung dịch đệm pH=3: Cho vào bình định mức loại 250 ml các hóa chất sau: 0,806 gam NaOH; 2,118 gam axit xitric và 1,263 ml dung dịch HCl 36,5%, thêm 100 ml nước cất, lắc cho tan rồi định mức đến 250 ml.
+ Dung dịch đệm pH=4: Cho vào bình định mức loại 250 ml các hóa chất sau: 1,120 gam NaOH; 3,724 gam axit xitric và 0,931 ml dung dịch HCl 36,5%, thêm 100 ml nước cất, lắc cho tan rồi định mức đến 250 ml.
Tất cả các dung dịch đệm sau khi pha đều được kiểm tra lại bằng máy đo pH. 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị
- Lọ thủy tinh có nắp loại 100 ml.
- Pipet, ống đong các loại, phễu chiết, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh bình định mức các loại.
- Máy đo pH Thermo scientific. - Tủ sấy, tủ ấm.
- Cân phân tích Sartorius CPA 225D có độ chính xác 10-5. - Máy điều nhiệt Memmer, Germany.
- Máy cô quay Eyela, Japan. - Máy siêu âm Branson 1510. - Máy lắc Unitwist 300.
- GC Agilent Techologies 7890A.
- Agilent Technologies 7693 Autosample.
- Cột HP-5MS-5% phenyl metyl silox (30m x 250µm x 0,25µm). 2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu.
Mẫu trắng được lấy từ những người khỏe mạnh, không sử dụng bất cứ loại ma túy nào. Mẫu thực tế được lấy từ các đối tượng nghi đã sử dụng cần sa của các đơn vị bắt được, sau đó kiểm tra sơ bộ bằng que thử, mẫu nào dương tính với cần sa sẽ dùng để tiến hành phân tích.
Các mẫu đều ghi đầy đủ thông tin về tên, độ tuổi, tiền sử sử dụng và ngày sử dụng gần đây nhất và ngày lấy mẫu. Các mẫu đều được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ -20oC đến khi phân tích.
2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu
Phân tích với đối tượng mẫu phức tạp như mẫu sinh học, quá trình chuẩn bị mẫu phải hết sức cẩn thận, đòi hỏi khắt khe và tốn nhiều thời gian nhất. Nó quyết định đến nhiều đại lượng của phương pháp phân tích.
Để tăng độ nhạy của phép phân tích, quá trình thủy phân và chiết cần được thực hiện cẩn thận. Trước khi thủy phân mẫu, cần đo thể tích, pH mẫu, quan sát độ đục, độ tạo bọt, có thể lọc nếu nhiều cặn.
Mẫu được xử lý theo 3 bước như sau:
- Bước 1: Tiến hành thủy phân với mẫu nước tiểu: Lấy 10 ml nước tiểu vào lọ thủy tinh, thêm 2ml dung dịch KOH 10M, đậy kín và thủy phân ở nhiệt độ và thời gian được lựa chọn, điều chỉnh pH rồi tiến hành chiết.
- Bước 2: Mẫu sau khi được chiết, để phân lớp, tách phần dung dịch hữu cơ, loại nước bằng Na2SO4 khan, đem cô quay chân không ở nhiệt độ 40oC, chuyển dịch cô vào lọ thủy tinh nhỏ, cô khô bằng dòng N2. Sau đó được dẫn xuất trước khi phân tích để tăng độ nhạy phép phân tích.
- Bước 3: Mẫu sau khi làm bay hơi được cho thêm 20µl BSTFA (N,O-bis- trimetylsilyl trifloaxetamit) chứa 1% TMCS (trimetylclosilan). Làm nóng dung
dịch ở nhiệt độ và thời gian được lựa chọn. Sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng, bơm 1µl để phân tích sắc ký khí.
2.4. Thực nghiệm
2.4.1. Khảo sát điều kiện phân tích trên thiết bị GC-MS Triple Quad 7000 Điều kiện làm việc trên GC-MS Triple Quad 7000 được khảo sát với cùng Điều kiện làm việc trên GC-MS Triple Quad 7000 được khảo sát với cùng chương trình làm việc, với cùng 1 mẫu chuẩn ở cùng một nồng độ theo 2 chương trình nhiệt độ khác nhau.
Điều kiện làm việc: - Thể tích bơm mẫu: 1µl
- Kiểu bơm: Không chia; Thời gian không chia: 0,75 phút - Khí mang: He; Tốc độ dòng: 3 ml/phút; Kiểu đẳng dòng. - Kiểu va chạm điện tử EI+(Electron Impact): 70 eV - Chế độ quét: Full scan/SIM; Khoảng m/z: 40-500 - Nhiệt độ buồng bơm mẫu Injector: 250oC
- Nhiệt độ lò sang cột Transferline: 280oC - Nhiệt độ nguồn ion: 230oC
* Chương trình nhiệt độ thứ nhất (theo tham khảo quy trình của trung tâm ma túy, viện KHHS)
- Nhiệt độ ban đầu của cột mao quản là 100oC, giữ trong 2 phút. Sau đó tăng đến 270oC với tốc độ 20oC/phút. Nhiệt độ cuối cùng 270oC được giữ trong 20 phút. Tổng chương trình nhiệt độ là 30,5 phút.
- Sơ đồ mô tả chương trình nhiệt độ:
100oC (2 phút) 270oC (20 phút)
Tổng cộng: 30,5 phút * Chương trình nhiệt độ thứ hai [14]
- Nhiệt độ ban đầu của cột mao quản là 120oC, giữ trong 2 phút. Sau đó tăng nhanh đến 200oC với tốc độ 50oC/phút, tiếp tục tăng đến 280oC với tốc độ
15oC/phút. Nhiệt độ cuối cùng 280oC được giữ trong 5 phút. Tổng chương trình nhiệt độ là 13,933 phút.
- Sơ đồ mô tả chương trình nhiệt độ:
120oC (2 phút) 200oC 280oC (5 phút)
Tổng cộng: 13,933 phút 2.4.2. Khảo sát điều kiện thủy phân và dẫn xuất
- Điều kiện thủy phân: Lấy vào lọ thủy tinh có nắp 10 ml nước tiểu dương tính, đo pH bằng giấy quỳ, thêm 2 ml KOH 10M, thủy phân ở các nhiệt độ 50oC, 55oC và 60oC trong thời gian 20 phút bằng máy điều nhiệt. Để nguội, đo lại pH, thêm dung môi chiết, thu dung môi chiết, loại nước, cô khô, dẫn xuất và bơm vào sắc ký.
- Điều kiện dẫn xuất: Lấy vào 3 lọ sắc ký cùng một lượng chuẩn THC- COOH nồng độ 250 ppb. Cô khô, bơm 20µl dẫn xuất BSTFA chứa 1% TMCS. Làm nóng ở các điều kiện sau:
+ 90oC trong 20 phút. + 90oC trong 30 phút. + 100oC trong 20 phút. 2.4.3. Khảo sát dung môi chiết
Lấy vào lọ thủy tinh có nắp: 10 ml nước tiểu dương tính, thực hiện thủy phân theo điều kiện đã chọn trên. Đo pH của mẫu, rồi điều chỉnh đến pH =2 bằng dung dịch HCl 2M. Thêm 3ml dung dịch đệm pH = 2. Thêm 20 ml dung môi chiết. Lắc bằng máy lắc trong 30 phút. Xử lý mẫu sau khi chiết, dẫn xuất, bơm 1 µl mẫu vào GC-MS để phân tích.
Qua tham khảo các tài liệu, các hệ dung môi sau được lựa chọn để khảo sát dung môi chiết: iso-octan; n-hexan/etylaxetat (9:1,v/v); n-hexan/etylaxetat (7:3,v/v); metylencloride/2-propanol/etyaxetat (1:1:3,v/v/v); etylaxetat/dietyete (1:1, v/v); xyclohexan/etylaxetat (7:1,v/v). Mỗi thí nghiệm lặp lại ba lần và lấy kết quả trung bình.
2.4.4. Khảo sát môi trường (pH) chiết
Sau khi lựa chọn được hệ dung môi tốt nhất cho việc chiết mẫu, cố định dung môi và khảo sát môi trường pH trong khoảng pH = 1 ÷ 4.
Lấy vào lọ thủy tinh có nắp: 10 ml nước tiểu dương tính, thực hiện thủy phân theo điều kiện đã chọn trên. Thêm dung dịch HCl 2M để điều chỉnh pH đến các giá trị pH=1; pH=2; pH=3; pH=4. Thêm 3 ml dung dịch đệm có pH tương ứng. Thêm 20 ml dung môi chiết đã tối ưu được, lắc bằng máy lắc trong 30 phút. Xử lý mẫu sau khi chiết, bơm 1 µl mẫu vào GC-MS để phân tích. Mỗi thí nghiệm lặp lại ba lần và lấy kết quả trung bình. Kết quả được trình bày trong chương 3. 2.4.5. Khảo sát hiệu suất chiết
Tiến hành độc lập hai thí nghiệm sau:
- Thí nghiệm I: Lấy vào lọ sắc ký dung dịch chuẩn THC-COOH 500 ppb, làm khô rồi đem dẫn xuất.
- Thí nghiệm II: Lấy vào lọ thủy tinh có nắp 10 ml nước tiểu trắng, thêm 50 µl dung dịch chuẩn THC-COOH 500 ppb, điều chỉnh đến pH đã tối ưu bằng dung dịch HCl 2M, thêm 20 ml dung môi đã tối ưu, tiến hành chiết và xử lý mẫu trước khi phân tích trên GC-MS.
Tiến hành phân tích ở cùng một điều kiện trên GC-MS đã tối ưu được. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình. Kết quả được trình bày trong chương 3.
2.4.6. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị
Giới hạn phát hiện của thiết bị (LOD) và giới hạn định lượng của thiết bị (LOQ) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích có ý nghĩa định lượng so với tín hiệu nền.
LOD và LOQ được xác định dựa vào sai số giữa các lần bơm một dung dịch có nồng độ nhỏ của chất cần phân tích lên thiết bị. Ban đầu tiến hành bơm lặp dung dịch này 7-10 lần. Sau đó, tính độ lệch chuẩn SD theo công thức:
Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn
xi: lượng chất phân tích trong mẫu lặp i
x: lượng chất phân tích trung bình trong mẫu lặp N: số mẫu lặp lại
Với độ tin cậy cần đạt là 99% thì
Giới hạn phát hiện của thiết bị: LOD ≈ 3 x SD Và giới hạn định lượng của thiết bị: LOQ ≈ 10 x SD
Trong luận văn này chúng tôi lặp lại 10 lần dung dịch chuẩn THC-COOH có nồng độ 10 ng/ml (10 ppb) đã được dẫn xuất thành THC-COOH-2TMS trên thiết bị GC-MS, thể tích bơm mẫu là 1 µl.
2.4.7. Xây dựng đường chuẩn
Mẫu chuẩn được chuẩn bị ở 7 nồng độ đã xác định khác nhau trong khoảng từ 10-2000ng/ml, sau đó được dẫn xuất bằng BSTFA chứa 1% TMCS. Mỗi điểm nồng độ tiến hành đo 3 lần để xác định và loại trừ những giá trị khác biệt.
2.4.8. Đánh giá phương pháp phân tích - Độ chụm - Độ chụm
Người ta thường sử dụng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) hay còn gọi là hệ số biến thiên (CV %) hơn là độ lệch chuẩn (SD) do có thể đánh giá được độ lệch chuẩn chiếm bao nhiêu % giá trị trung bình và có cái nhìn rõ hơn về độ chụm của các số liệu trong tập số liệu lặp lại [4]. % RSD được xác định theo công thức:
RSD (%) = . 100%
Để đánh giá RSD, tiến hành các thí nghiệm độc lập ở điểm đầu và điểm cuối đường chuẩn. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Kết quả được trình bày trong chương 3.
- Hiệu suất thu hồi
Mục đích để đánh giá hiệu suất thu hồi là kiểm tra xem chất chuẩn được thêm vào được trộn đều với nền mẫu thế nào và tính chất của nền mẫu có giống với nền mẫu ban đầu hay không. Sử dụng mẫu thêm chuẩn để đánh giá độ thu hồi của phương pháp xử lý mẫu. Mẫu thực tế dương tính được thêm một lượng nhất
định chuẩn THC-COOH vào ở 2 mức nồng độ 50 ppb, 1500ppb, sao cho tổng hàm lượng THC-COOH sau khi xử lý không bị vượt quá đường chuẩn. Xử lý mẫu và phân tích theo quy trình đã chọn. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, và lấy kết quả trung bình. Kết quả được trình bày trong chương 3. Hiệu suất thu hồi được xác định theo công thức sau:
100% x 0 C C C H spike blank
Trong đó: Cspike: nồng độ của mẫu thêm chuẩn (ppb) Cblank: nồng độ của mẫu nền (ppb)
C0: nồng độ chuẩn được thêm chuẩn (ppb) 2.4.9. Phân tích mẫu thực tế
Sau khi khảo sát và tối ưu được quy trình phân tích, tiến hành khảo sát trên các mẫu thực thu được từ các vụ án để định tính và định lượng nồng độ THC- COOH trong mẫu nước tiểu của đối tượng sử dụng cần sa. Kết quả phân tích mẫu thực sẽ được trình bày trong chương 3.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả khảo sát điều kiện phân tích THC-COOH trên GC-MS
Để tối ưu quá trình phân tích trên GC-MS đảm bảo khả năng tách tốt nhất, tiến hành phân tích mẫu chuẩn ở chương trình nhiệt khác nhau như đã trình bày ở chương hai.
Dưới đây là phổ khối của THC-COOH chuẩn, sắc ký đồ của THC-COOH- 2TMS, phổ khối của THC-COOH-2TMS ở hai chương trình nhiệt độ phân tích khác nhau và cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS.
Chương trình nhiệt thứ nhất:
100oC (2 phút) 270oC (20 phút)
Tổng cộng: 30,5 phút Chương trình nhiệt thứ hai:
120oC (2 phút) 200oC 280oC (5 phút)
Tổng cộng: 13,933 phút 200C/ phút
Như vậy, sắc ký đồ trong hai điều kiện phân tích trên không có sự khác nhau nhiều, sắc ký đồ đều cho pic đặc trưng sắc nét, phổ khối cho các mảnh phù hợp với cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS. Tuy nhiên thời gian lưu của THC-COOH-2TMS ở điều kiện phân tích thứ hai ngắn hơn, nên tiết kiệm được thời gian phân tích. Do vậy, chương trình sắc ký thứ hai được lựa chọn để phân tích.
Theo cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS có 3 mảnh chính và đặc trưng là mảnh m/z = 371; 473; 488. Tuy nhiên mảnh m/z 371 cho tín hiệu cao nhất đồng thời đặc trưng nhất, phù hợp với cơ chế phân mảnh của THC-COOH- 2TMS nên sẽ được lựa chọn làm mảnh cho phân tích định lượng.
3.2. Kết quả khảo sát điều kiện thủy phân và dẫn xuất