1.2.2.1. Thủy phân mẫu
Trên 80% lượng THC-COOH có trong nước tiểu dưới dạng liên hợp glucuronic. Do vậy phải tiến hành thủy phân để tách gốc glucuronic ra khỏi THC- COOH. Đối với mẫu cần sa, thủy phân trong môi trường kiềm cho hiệu quả cao và ổn định hơn các phương pháp thủy phân trong môi trường axit và men.
1.2.2.2. Phương pháp chiết
Sau khi tiến hành thủy phân để tách THC-COOH ra khỏi dạng liên hợp của nó với axit glucuronic, thì việc quan trọng tiếp theo là phải tách chúng ra khỏi nước tiểu, hiệu quả tách càng cao đồng nghĩa với việc phân tích càng chính xác. Có nhiều phương pháp tách chiết, tuy nhiên cần lựa chọn phương pháp sao cho phù hợp với đối tượng mẫu, yêu cầu phân tích cũng như điều kiện phòng thí nghiệm. Một số phương pháp phù hợp để chiết THC-COOH từ nước tiểu là chiết lỏng-lỏng, chiết pha rắn, vi chiết pha rắn.
Quá trình tách trong chiết pha rắn cũng tương tự như chiết lỏng- lỏng và phương pháp sắc ký, chủ yếu dựa trên định luật phân bố chất tan giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau. Chiết pha rắn thuận lợi hơn so với việc chiết pha lỏng, nhưng trong đề tài này để phù hợp với điều kiện nghiên cứu tại nhiều phòng thí nghiệm Kỹ thuật hình sự ở Công an các tỉnh thành trong cả nước, chúng tôi lựa chọn chiết pha lỏng để tách THC-COOH ra khỏi nước tiểu.
1.2.2.3. Kỹ thuật dẫn xuất
Dẫn xuất: Kỹ thuật dẫn xuất hóa đóng vai trò quan trọng trong sắc ký khí nhằm phân tích các chất khó bay hơi, đặc biệt là các hợp chất chứa một hoặc nhiều nhóm chức, mà có khả năng hấp phụ đặc trưng gây ra sự giãn pic và làm biến dạng pic, đặc biệt ở nồng độ thấp. Việc dẫn xuất hóa không chỉ tạo nên các pic cân đối mà còn làm tăng độ phân giải, giúp định lượng chính xác. Các kiểu dẫn xuất thường dùng là trialkyl silan hóa, este hóa, alkyl hóa…[1]
THCCOOH là hợp chất phân cực, chứa proton H+, nên sử dụng dẫn xuất alkylsilyl là phù hợp. Trong quá trình dẫn xuất, phản ứng phải được thực hiện
dưới điều kiện không có nước, trong lọ thủy tinh có nút xoáy với đệm teflon. BSTFA ( N,O-bis- (trimetylsilyl) trifloaxetamit) được sử dụng nhiều trong sắc ký khí, thúc đẩy sự tạo thành các ete enol-TMS ngoại trừ các nhóm keton được bảo vệ. Phản ứng xảy ra chậm ở nhiệt độ phòng, nên có thể thúc đẩy bằng cách thêm xúc tác trimetylclosilan (TMCS).
1.2.2.4. Phương pháp phân tích định tính và định lượng
Việc phân tích THC-COOH trong nước tiểu phù hợp với khả năng của thiết bị sắc ký khí (GC) kết nối detector khối phổ (MS), vì thế kết quả phân tích có độ chính xác cao.
Nguyên tắc hoạt động của sắc ký khí: Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích lên hai pha: một pha thường đứng yên, có khả năng hấp thu chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động; do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
Trong sắc ký khí, mẫu được tách do sự phân bố giữa pha tĩnh và pha động nhờ cơ chế hấp phụ, phân bố hoặc kết hợp cả hai cơ chế này.
Khi pha tĩnh là một chất hấp phụ rắn, thì kỹ thuật phân tích gọi là sắc ký khí - rắn (GSC). Khi pha lỏng được gắn lên bề mặt của chất mang trơ hoặc được phủ dưới dạng một lớp phim mỏng lên thành cột mao quản, thì kỹ thuật này gọi là sắc ký khí -lỏng (GLC) [1].
Sắc ký khí là phương pháp có hiệu quả tách rất cao, thời gian phân tích nhanh, đối với những detector phù hợp, giới hạn phát hiện của phương pháp có thể đạt 0,1ppb.
Tuy nhiên phương pháp có hạn chế là chỉ phù hợp với các hợp chất dễ bay hơi [2]. Chính vì vậy, trước khi phân tích THC-COOH bằng GC, cần dẫn xuất nó để tạo hợp chất dễ bay hơi nhằm phù hợp với phương pháp.
Hình 1.6. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí và vận hành
- Phương pháp phân tích định tính:
Nguyên tắc của các phép phân tích định tính là dựa vào một yếu tố đặc trưng của tín hiệu tương ứng với mỗi cấu tử để nhận diện chúng. Trong sắc kí khí người ta sử dụng yếu tố đặc trưng là thời gian lưu để nhận diện các cấu tử bằng cách so sánh thời gian lưu của chúng với thời gian lưu của chất chuẩn. Sử dụng phương pháp GC/MS, ngoài việc nhận diện các cấu tử thông qua yếu tố thời gian lưu, chất cần phân tích còn được nhận diện thông qua việc so sánh các mảnh phổ khối đặc trưng và cường độ vạch phổ của chất chuẩn với chất cần phân tích [1].
- Phương pháp phân tích định lượng:
Trong sắc kí, hai phương pháp thường được sử dụng để định lượng chất phân tích là phương pháp nội chuẩn và phương pháp ngoại chuẩn.
Phương pháp nội chuẩn dựa trên sự so sánh cường độ tín hiệu của chất cần phân tích với tín hiệu của chất nội chuẩn. Các chất dùng làm chất nội chuẩn là các chất không có trong thành phần của mẫu, cho tín hiệu ổn định và khoảng thời gian lưu nằm gần khoảng thời gian lưu của chất phân tích. Chất nội chuẩn được đưa vào mẫu cần phân tích với nồng độ đã biết. Khi tính toán máy sẽ dựa vào tỉ lệ tín hiệu của chất cần phân tích với tín hiệu của chất nội chuẩn
Thiết bị sắc ký khí 5 6 2 3 7 1 4
Sơ đồ chức năng thiết bị sắc kí khí
1- Nguồn khí mang 5 - Detector 2- Điều chỉnh áp suất 6 - Máy ghi
3 - Bộ phận bơm mẫu 7 - Phần mềm và computer 4- Cột tách
để tính ra nồng độ. Phương pháp này có độ chính xác cao vì nó loại bỏ được các yếu tố gây ảnh hưởng đến tín hiệu phân tích (yếu tố nền, sự sai khác về thể tích bơm mẫu giữa các lần đo).
Nguyên tắc của phương pháp ngoại chuẩn là so sánh trực tiếp độ lớn của các tín hiệu (diện tích hay chiều cao pic thu được) trong mẫu chưa biết với dung dịch chuẩn của chất đó.
Trước tiên cần bơm dung dịch chuẩn của chất cần phân tích với các nồng độ thích hợp. Từ các kết quả thu được ta xây dựng đường chuẩn có dạng: y = a + bx. Đo diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất cần phân tích (giá trị y) và áp vào đường chuẩn ta có thể tính ra nồng độ cấu tử cần phân tích (giá trị x).
Với thiết bị phân tích hiện đại GC-MS Agilent 7000 các thông số làm việc của máy như nhiệt độ, tốc độ dòng…có độ ổn định tốt, các lần bơm mẫu có độ lặp lại cao nên chúng tôi dùng phương pháp ngoại chuẩn để phân tích định lượng. [1] 1.3. Một số các nghiên cứu về phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký khí đã được công bố (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dưới đây là bảng một số các nghiên cứu về phân tích THC-COOH với các điều kiện về thủy phân, phương pháp chiết, dung môi chiết, chất dẫn xuất, thiết bị phân tích, chất nội chuẩn sử dụng, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, hiệu suất thu hồi và khoảng tuyến tính của đường chuẩn.
Bảng 1.5. Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký khí
STT Tác nhân và nhiệt
độ thủy phân Chiết Dẫn xuất
Thiết bị
phân tích Nội chuẩn
LOD (ng/ml) LOQ (ng/ml) H (%) Khoảng tuyến tính (ng/ml) 1 [18] KOH 10N 50-60oC/15phút Pha rắn PFPA/PFPOH GC-MS THC- COOH-d9 0,875 1,75 95 0,875-900 (r=0,993) 2 [12] NaOH 6M 56oC/20 phút Pha lỏng n-hexan/etylaxetat MSTFA GC-MS THC- COOH-d9 1,0 1,7 - 10-100 (r=0,9998) 3 [19] NaOH 6M to phòng/ 20 phút Pha lỏng Metanol/ hỗn hợp n-hexan/etylaxetat PFPA/PFPOH GC-MS THC- COOH-d9 1,0 2,0 - 1,2-1500 (r=0,9978) 4 [14] NaOH Pha lỏng n-hexan/etylaxetat BSTFA GC- MS/MS THC- COOH-d3 - - - 5-50 5 [22] KOH 10M 60oC/15phút Pha rắn TMS GC-MS THC- COOH-d3 - - 87- 97 10-300 (r=0,999) 6
[7] β-glucuronidase Pha rắn MSTFA GC-MS
THC- COOH-d3; THC- COOH-d9 3 3 - 0,1-500 (r=1)
1.4. Nguyên tắc phương pháp nghiên cứu xác định THC-COOH bằng GC-MS Hoạt chất chính của cần sa khi được đưa vào trong cơ thể người là THC, Hoạt chất chính của cần sa khi được đưa vào trong cơ thể người là THC, qua quá trình chuyển hóa sẽ chuyển thành THC-OH rồi sau đó chuyển sang dạng liên hợp glucuronic của THC-COOH, tiến hành thủy phân trong môi trường kiềm mạnh để chuyển dạng liên hợp glucuronic của THC-COOH về dạng tự do, sau đó dẫn xuất THC-COOH bằng chất dẫn xuất BSTFA với chất dẫn xuất TMCS để làm tăng khả năng phản ứng.
Chất dẫn xuất BSTFA chứa nhóm -TMS thay thế cho 2 nguyên tử hydro linh động của THC-COOH tạo thành THC-COOH-2TMS và được phân tích trên GC-MS. Quá trình phản ứng được thể hiện qua sơ đồ sau:
Hình 1.7. Sự tạo thành và dẫn xuất THC-COOH
1.5. Cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS
THC-COOH-2TMS với khối lượng phân tử m/z = 488, sau khi đưa vào phân tích trên GC-MS có thể phân mảnh theo cơ chế sau:
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM
2.1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu 2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu
Để xác định THC-COOH trong nước tiểu, cần khảo sát các điều kiện thủy phân, môi trường pH để chiết lỏng - lỏng, dung dịch chiết, hiệu suất chiết, chất dẫn xuất và điều kiện dẫn xuất trước khi đưa vào phân tích bằng máy GC-MS.
Phân tích hàm lượng THC-COOH trong nước tiểu bằng quy trình đã lựa chọn được trên GC-MS.
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu
Các mẫu nước tiểu nghi sử dụng cần sa. Các mẫu nước tiểu đều được thử phản ứng miễn dịch với kít thử cần sa. Thông tin về một số mẫu nước tiểu bị thu giữ theo lời khai của đối tượng như sau:
Bảng 2.1. Thông tin một số mẫu nước tiểu bị bắt giữ
Ký
hiệu Đặc điểm
Thể tích mẫu
Thông tin mẫu
(theo lời khai của đối tượng)
M1 Đậm màu, đục
(Dương tính) 250 ml
Lấy mẫu sau 7 ngày sử dụng bằng cách hút, hút không thường xuyên.
M2 Đậm màu, đục (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(Dương tính) 250 ml
Lấy mẫu sau 5 ngày sử dụng bằng cách hút, hút không thường xuyên.
M3 Nhạt màu, không
đục (Dương tính) 200 ml
Lấy mẫu sau 1 ngày sử dụng bằng cách hút, hút không thường xuyên.
M4 Nhạt màu, không
đục (Dương tính) 230 ml
Lấy mẫu sau 2 ngày sử dụng bằng cách hút, hút thường xuyên trong 1 năm.
M5 Nhạt màu, không
đục (Dương tính) 80 ml
Lấy mẫu sau 3 ngày sử dụng bằng cách hút, hút 5 lần.
M6 Đậm màu, không
đục (Âm tính) 90 ml
Lấy mẫu sau 5 ngày sử dụng bằng cách hút, mới hút 1 lần.
2.1.3. Nội dung nghiên cứu
Sau khi dẫn xuất THC-COOH, tiến hành bơm dung dịch này để phân tích trên GC-MS. Cùng với sự kế thừa các nghiên cứu về phân tích THC-COOH, để xây dựng quy trình phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ, trong luận văn này các vấn đề sau đây được nghiên cứu:
- Lựa chọn và khảo sát lại điều kiện thủy phân và dẫn xuất. - Khảo sát dung môi chiết.
- Khảo sát môi trường chiết (pH). - Đánh giá hiệu quả chiết.
- Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn phát hiện (LOQ) - Xây dựng đường chuẩn của THC-COOH.
- Đánh giá tính phù hợp của phương pháp: Độ lệch chuẩn tương đối, hiệu suất thu hồi…
- Ứng dụng: Phân tích trên các mẫu nước tiểu nghi sử dụng Cần sa bị bắt giữ. 2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.1. Hóa chất
* Mẫu chuẩn THC-COOH Arlesheim, Thụy Sỹ do Liên hợp quốc cấp với lượng chính xác là 0,1 mg.
* Các hóa chất còn lại đều là hóa chất tinh khiết dùng trong phân tích (đạt tiêu chuẩn PA):
- Dung dịch HCl 36,5% (dùng để pha dung dịch HCl 2M và dung dịch đệm), (Merck, Đức).
- NaOH, axit xitric (C6H8O7.H2O) để pha các dung dịch đệm Xitrat pH = 1, pH = 2, pH = 3, pH =4.
- KOH (dùng để pha dung dịch KOH 10M).
- Muối khan Na2SO4 (Merck, Đức) được nung ở 2500 C trong 2h trước khi sử dụng.
- Nước cất hai lần.
- Khí N2 kỹ thuật 99% dùng để đuổi dung môi. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Khí He tinh khiết dùng làm khí mang cho thiết bị GC/MS.
- Chất dẫn xuất N,O-bis- (trimetylsilyl) trifloaxetamit (BSTFA) chứa 1% trimetylclosilan (TMCS) hãng Sigma-Aldrich.
- Các dung môi tinh khiết: Xyclohexan, etylaxetat, dietylete, methanol, n- hexan, isooctane, metylencloride, 2-propanol, (Merck, Đức).
- Kít thử miễn dịch Acon, Mỹ.
* Cách pha các dung dịch chuẩn và dung dịch đệm như sau:
+ Dung dịch chuẩn gốc THC-COOH nồng độ 2000 ng/ml được chuẩn bị như sau: 0,1 mg chuẩn THC-COOH được pha với hỗn hợp dung môi n- hexan/etylaxetat (9:1, v/v), định mức đến 50 ml. Dùng dung dịch chuẩn này để pha loãng với các dung dịch chuẩn có nồng độ nhỏ hơn nằm trong khoảng từ 10 ÷ 2000 ng/ml bao gồm: 10; 50; 250; 500; 1000; 1500; 2000 ng/ml. Các dung dịch chuẩn này sau đó được làm khô bằng dòng khí nitơ, thêm dung dịch BSTFA chứa
1% TMCS rồi dẫn xuất và phân tích trên sắc ký. Sau khi phân tích và dựng đường chuẩn, sẽ sử dụng các kết quả nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn cho mục đích phân tích định lượng THC-COOH có mặt trong nước tiểu của đối tượng sử dụng cần sa.
+ Dung dịch đệm pH=1: Cho vào bình định mức loại 250 ml các hóa chất sau: 0,388 gam NaOH; 1,019 gam axit xitric và 1,547 ml dung dịch HCl 36,5%, thêm 100 ml nước cất, lắc cho tan rồi định mức đến 250 ml.
+ Dung dịch đệm pH=2: Cho vào bình định mức loại 250 ml các hóa chất sau: 0,562 gam NaOH; 1,608 gam axit xitric và 1,470 ml dung dịch HCl 36,5%, thêm 100 ml nước cất, lắc cho tan rồi định mức đến 250 ml.
+ Dung dịch đệm pH=3: Cho vào bình định mức loại 250 ml các hóa chất sau: 0,806 gam NaOH; 2,118 gam axit xitric và 1,263 ml dung dịch HCl 36,5%, thêm 100 ml nước cất, lắc cho tan rồi định mức đến 250 ml.
+ Dung dịch đệm pH=4: Cho vào bình định mức loại 250 ml các hóa chất sau: 1,120 gam NaOH; 3,724 gam axit xitric và 0,931 ml dung dịch HCl 36,5%, thêm 100 ml nước cất, lắc cho tan rồi định mức đến 250 ml.
Tất cả các dung dịch đệm sau khi pha đều được kiểm tra lại bằng máy đo pH. 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị
- Lọ thủy tinh có nắp loại 100 ml.
- Pipet, ống đong các loại, phễu chiết, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh bình định mức các loại.
- Máy đo pH Thermo scientific. - Tủ sấy, tủ ấm.
- Cân phân tích Sartorius CPA 225D có độ chính xác 10-5. - Máy điều nhiệt Memmer, Germany.
- Máy cô quay Eyela, Japan. - Máy siêu âm Branson 1510. - Máy lắc Unitwist 300.
- GC Agilent Techologies 7890A.
- Agilent Technologies 7693 Autosample.
- Cột HP-5MS-5% phenyl metyl silox (30m x 250µm x 0,25µm). 2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu.
Mẫu trắng được lấy từ những người khỏe mạnh, không sử dụng bất cứ loại ma túy nào. Mẫu thực tế được lấy từ các đối tượng nghi đã sử dụng cần sa của các đơn vị bắt được, sau đó kiểm tra sơ bộ bằng que thử, mẫu nào dương tính với cần sa sẽ dùng để tiến hành phân tích.
Các mẫu đều ghi đầy đủ thông tin về tên, độ tuổi, tiền sử sử dụng và ngày sử dụng gần đây nhất và ngày lấy mẫu. Các mẫu đều được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ -20oC đến khi phân tích.