Sử dụng kỹ thuật fish để kểm tra sự hội nhập của gen IL 6 phân lập từ người trong tế bào gốc phôi gà chuyển gen

Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Mục lục Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm i MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chương 1 – TỔNG QUAN 3 1.1. CHUYỂN GEN Ở GÀ 3 1.1.1. Các phương thức chuyển gen vào tế bào 3 1.1.2. Các phương pháp tạo gà chuyển gen 5 1.1.3. Những ứng dụng của gà chuyển gen 10 1.2. KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ (FISH) 12 1.2.1. Nguyên lý 12 1.2.2. Đầu dò cho phản ứng lai 13 1.2.3. Ưu điểm của kỹ thuật FISH 18 1.2.4. Ứng dụng của kỹ thuật FISH 19 1.3. INTERLEUKIN 6 Ở NGƯỜI 22 1.3.1. Giới thiệu 22 1.3.2. Chức năng 23 1.3.3. Những ứng dụng lâm sàng 24 1.3.4. Gen mã hóa IL–6 ở người 25 Chương 2 – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT 26 2.1.1. Đối tượng – vật liệu nghiên cứu 26 2.1.2. Dụng cụ và vật tư tiêu hao 29 2.1.3. Thiết bị nghiên cứu 29 2.1.4. Hoá chất sử dụng 30 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.2.1. Tổng hợp đầu dò gắn huỳnh quang cho phản ứng lai FISH 32 2.2.2. Thu nhận tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 người 34 2.2.3. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) 38 Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Mục lục Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm ii 3.1. TỔNG HỢP ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR 40 3.1.1. Thiết kế cặp mồi nhân đoạn gen IL – 6 40 3.1.2. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR 46 3.1.3. Kết quả tổng hợp đầu dò bằng phản ứng PCR 49 3.2. THU NHẬN TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ CHUYỂN GEN IL–6 NGƯỜI 50 3.2.1. Phân lập và nhân nuôi tế bào gốc phôi gà 50 3.2.2. Thu nhận và duy trì tế bào gốc phôi gà chuyển gen 52 3.2.3. Kiểm tra sự có mặt gen chuyển trong tế bào bằng phản ứng PCR 54 3.3. KẾT QUẢ LAI FISH PHÁT HIỆN GEN IL–6 TRONG cESCs 55 3.4. THẢO LUẬN 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC A Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Danh mục hình minh họa Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm iii DANH MỤC HÌNH MINH HỌA Hình 1. Chu trình tái bản của retrovirus và cách thức sản xuất vector retrovirus 4 Hình 2. Mô hình chuyển gen thông qua trung gian tế bào ở gà 8 Hình 3. Quy trình của kỹ thuật FISH 12 Hình 4. Cấu trúc một số chất đánh dấu huỳnh quang thường được sử dụng 14 Hình 5. Vị trí của các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào ở kỳ trung gian 19 Hình 6. Kiểu nhân phổ của nhiễm sắc thể tủy xương bệnh nhân đa u tủy 21 Hình 7. Một số ảnh hưởng của IL–6 trong cơ thể 23 Hình 8. Cấu trúc vector pLenti6/V5–DEST Gateway (ViraPower) của Invitrogen 27 Hình 9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 32 Hình 10. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi với cADN của gen IL–6 42 Hình 11. Kết quả xác định vị trí tương đồng giữa cADN và mARN gen IL–6 43 Hình 12. Kết quả kiểm tra vị trí chèn của gen IL–6 trên vector 44 Hình 13. Kết quả kiểm tra vị trí bắt cặp của đầu dò trên vector 45 Hình 14. Kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp giữa đầu dò với hệ gen gà bằng BLASTn 46 Hình 15. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ gắn mồi và nồng độ ion Mg 2+ tới hiệu suất phản ứng PCR 47 Hình 16. Kết quả giải trình tự nucleotide các sản phẩm PCR và so sánh với trình tự đầu dò theo lý thuyết 48 Hình 17. Kết quả điện di sản phẩm PCR tổng hợp đầu dò 49 Hình 18. cESCs 24 giờ nuôi cấy in vitro sau khi phân lập 51 Hình 19. cESCs nuôi cấy trên lớp tế bào nuôi 52 Hình 20. Đánh giá ảnh hưởng của lentivirus tới sự sinh trưởng của cESCs 53 Hình 21. Kết quả phân tích PCR các mẫu tế bào chuyển gen 54 Hình 22. Kết quả phân tích PCR các mẫu tế bào qua các lần cấy chuyển 55 Hình 23. Kết quả lai FISH trên tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 người 56 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Danh mục bảng Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Một số chất đánh dấu huỳnh quang và thuốc nhuộm sử dụng trong FISH 15 Bảng 2. Vai trò của một số yếu tố chính của vector pLenti6/V5–DEST Gateway 28 Bảng 3. Dụng cụ và vật tư tiêu hao được sử dụng trong đề tài 29 Bảng 4. Các thiết bị nghiên cứu được sử dụng trong đề tài 29 Bảng 5. Các hóa chất được sử dụng trong đề tài 30 Bảng 6. Thành phần phản ứng PCR tối ưu hóa điều kiện tổng hợp của mồi IL–6 33 Bảng 7. Thành phần môi trường nuôi cấy cESCs 35 Bảng 8. Thành phẩn phản ứng PCR phát hiện gen chuyển trong tế bào 37 Bảng 9. Kết quả thiết kế cặp mồi sử dụng chương trình Primer3 41 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Bảng ký hiệu và chữ viết tắt Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm v BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Viết đầy đủ ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic BLAST Basic Local Alignment Search Tool BSA Bovine serum albumin cESCs Chicken Embryonic Stem Cells cADN Complementary ADN CMV Cytomegalovirus DAPI 4',6–diamidino–2–phenylindole DIG Digoxigenin DNase Deoxyribonuclease EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FBS Fetal Bovine Serum FISH Fluorescence in situ hybridization HIV Human Immunodeficiency Virus IL–6 Interleukin – 6 LTR Long Terminal Repeats NCBI National Center for Biotechnology Information PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction PGCs Primordial germ cells RNase Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulfate SSC Saline – sodium citrate buffer SSCs Spermatogonial Stem Cells T a Annealing template T m Melting temperature Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Mở đầu Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 1 MỞ ĐẦU Sử dụng động vật chuyển gen để sản xuất các loại protein dược phẩm là hướng đi đã được quan tâm từ lâu. Trong lĩnh vực này, gia cầm chuyển gen đang được chú ý đến với một số lợi thế vượt trội so với động vật có vú như thời gian tạo dòng ngắn, trứng có môi trường vô trùng tự nhiên, thành phần protein lòng trắng trứng đơn giản nên dễ tách sản phẩm chuyển gen,…. Tính đến nay, nhiều protein dược phẩm tái tổ hợp ở người đã được nghiên cứu tạo ra từ gà chuyển gen, trong đó một số sản phẩm đã bước vào giai đoạn thử nghiệm như kháng thể đơn dòng miR24 điều trị khối u ác tính, interferon β–1a chữa trị đa xơ cứng và interferon α–2a có trong thuốc Roferon A chữa viêm gan C, ung thư máu. Những nghiên cứu về gà chuyển gen gần đây tập trung chủ yếu vào phương pháp thông qua các tế bào gốc phôi, với ưu điểm là lựa chọn được ngay từ đầu những tế bào mang gen chuyển mong muốn trước khi tiêm chúng vào phôi nhận, do đó tiết kiệm được thời gian cũng như chi phí cho quá trình sàng lọc cơ thể chuyển gen từ bố mẹ khảm. Để tạo động vật chuyển gen hiệu quả thì cần phải có các hệ thống vector đủ mạnh để chuyển được gen mong muốn với hiệu suất cao, duy trì ổn định trong cơ thể vật chủ. Hệ thống được sử dụng thường xuyên nhất dựa vào retrovirus (virus ARN) trong đó sử dụng các enzyme của bản thân và bộ máy phiên mã trong tế bào chủ để sao chép hệ gen của chúng, sau đó tích hợp nó vào nhiễm sắc thể vật chủ trong quá trình phân bào. Gần đây, một nhóm nhỏ của retrovirus là lentivirus đã được coi như một công cụ hứa hẹn trong chuyển gen. Chúng mang đầy đủ các ưu điểm của retrovirus, hơn nữa còn có khả năng chèn gen vào tế bào không phân chia, loại vector này đặc biệt hiệu quả đối với tế bào gốc phôi do loại tế bào này rất khó chuyển gen bằng các phương pháp khác. Trong quá trình tạo động vật chuyển gen, các bước sàng lọc tế bào hay cơ thể mang gen mong muốn đóng vai trò rất quan trọng. Gen chuyển cần được cài vào ADN trong nhân tế bào để đảm bảo di truyền cho thế hệ sau qua con đường sinh sản hữu tính, đồng thời phải được duy trì bền vững qua nhiều thế hệ động vật. Ngoài ra, Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Mở đầu Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 2 gen chuyển phải nằm ở vị trí thích hợp: trong vùng ADN hoạt động, không chèn vào giữa gen cấu trúc hay các vùng ADN giữ chức năng điều hòa, Vì vậy, các kỹ thuật nhằm xác định vị trí gen trong bộ nhiễm sắc thể đã được phát triển, trong số đó ít tốn kém và dễ thực hiện nhất là kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (fluorescence in situ hybridization – FISH). Cơ sở của kỹ thuật FISH dựa trên sự bắt cặp chính xác giữa giữa ADN đích và đầu dò đánh dấu huỳnh quang có trình tự tương đồng. Đây là một trong những kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong sinh học phân tử và chẩn đoán nhằm phát hiện những bất thường trên nhiễm sắc thể, nghiên cứu cấu trúc và chức năng tế bào, lập bản đồ kiểu nhân, xây dựng hệ thống phát sinh loài, Có thể nói FISH là cầu nối giữa lĩnh vực di truyền học cổ điển với di truyền học hiện đại, kết hợp sự chính xác của các kỹ thuật di truyền phân tử và sự quan sát trực quan từ kính hiển vi. Ở Việt Nam, một số bệnh viện lớn như Bệnh viện K, Bệnh viện Trung ương Quân đội 108, Bệnh viên Nhi Trung ương, đã sử dụng kỹ thuật này để chẩn đoán một số bệnh di truyền ở người. Tuy nhiên trong nghiên cứu cơ bản, việc ứng dụng nó còn rất hạn chế. Đến nay, chưa có báo cáo nào về việc sử dụng để đánh giá sự chèn gen ngoại lai vào hệ gen của tế bào động vật. Mặt khác, trong những nghiên cứu trên, đầu dò sử dụng đều là các sản phẩm thương mại, hoặc được tự thiết kế nhưng đặt tổng hợp tại các hãng nổi tiếng, chưa tự tổng hợp tại phòng thí nghiệm sử dụng chúng. Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá về tiềm năng ứng dụng vector chuyển gen lentivirus đối với tế bào gốc phôi gà, sử dụng kỹ thuật FISH để phát hiện vị trí gen chuyển IL–6 trong tế bào gốc phôi gà chuyển gen, từ đó tạo tiền đề cho việc tạo gà chuyển gen thông qua tế bào gốc. Nghiên cứu này cũng góp phần phát triển kỹ thuật FISH trong nghiên cứu cơ bản ở Việt Nam. Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 3 Chương 1 – TỔNG QUAN 1.1. CHUYỂN GEN Ở GÀ 1.1.1. Các phương thức chuyển gen vào tế bào 1.1.1.1. Chuy ển gen sử dụng vector virus Các hệ thống chuyển gen hiệu quả nhất hiện nay khai thác tiềm năng của virus động vật đã tiến hóa hàng triệu năm qua. Những vector virus được tạo ra bằng cách thay thế một hoặc một số gen của chúng bằng gen mong muốn. Ưu điểm của hệ thống chuyển gen sử dụng virus là hiệu suất chuyển gen khá cao và ổn định. Tuy nhiên, chúng có nhược điểm về độ an toàn, cũng như phản ứng miễn dịch của vật chủ loại bỏ tác nhân virus. Những nhược điểm này đang dần được khắc phục trong những vector tái bản thiếu thế hệ mới [58]. Đối với gia cầm, chuyển gen bằng retrovirus và lentivirus thu được nhiều thành công nhất trừ trước đến nay. Retrovirus có vật chất di truyền là ARN, mang ba gen chính là gag (mã hóa kháng nguyên kết hợp nhóm), env (mã hóa protein vỏ) và pol (mã hóa enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase và enzyme hội nhập intergrase). Sau khi thâm nhiễm vào tế bào chủ (đang trong giai đoạn phân chia), ARN phiên mã ngược thành ADN, từ đó hợp nhất với ADN tế bào chủ, trở thành một bộ phận ổn định và hoạt động như các gen khác trong tế bào, có thể di truyền lại cho các thế hệ sau. Nhờ tín hiệu đóng gói tương thích (), ARN phiên mã từ hệ gen virus kết hợp trở lại với các protein virus (đều được tạo ra nhờ bộ máy tổng hợp của tế bào chủ), tạo nên các hạt virus mới (Hình 1A). Khi thiết kế vector, người ta chỉ sử dụng tín hiệu  và hai trình tự dài lặp lại ở hai đầu (long terminal repeat – LTR), gen chuyển được chèn vào giữa hai LTR này. Vector cần có một dòng tế bào đóng gói chứa retorvirus cải biến, có khả năng tạo ra các protein virus nhưng không có tín hiệu  (Hình 1B). Nhờ vậy, các hạt virus mới được sinh ra chỉ chứa vector chuyển gen quan tâm, không có khả năng tạo nên các virus khác [5, 72, 74]. Gần đây, một nhóm nhỏ của retrovirus là lentivirus cũng được sử dụng rộng rãi trong Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 4 chuyển gen. Chúng mang đầy đủ các ưu điểm của retrovirus, hơn nữa còn có khả năng thâm nhiễm vào tế bào không phân chia [58, 74]. Hình 1. Chu trình tái b ản của retrovirus v à cách th ức sản xuất vector retrovirus Chu trình tái bản của retrovirus (hình trái): Virus xâm nhập vào tế bào chủ, sử dụng enzyme phiên mã ngược để tổng hợp ADN từ ARN của mình; ADN này hội nhập vào hệ gen tế bào, sử dụng bộ máy tổng hợp của tế bào để phiên mã thành ARN và dịch mã tạo các protein virus; các protein này đóng gói ARN lại tạo thành các hạt virus mới và giải phóng vào môi trường. Khi sản xuất vector retrovirus (hình phải), vector đóng gói mang các gen mã hóa protein virus nhưng không có tín hiệu đóng gói (  –), nên vector tạo thành chỉ chứa cấu trúc gen chuyển trong vector retrovirus (chứa tín hiệu đóng gói  +) [72]. 1.1.1.2. Chuy ển gen không d ùng virus Việc chuyển gen không sử dụng virus trên tế bào động vật đã được thực hiện từ cách đây hơn 40 năm, chúng có ưu điểm về độ an toàn, không gây miễn dịch và đơn giản, tuy nhiên hiệu quả thấp hơn nhiều so với khi sử dụng virus. Những phương pháp được sử dụng nhiều hiện nay bao gồm các phương pháp vật lý (vi Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 5 tiêm, xung điện, súng bắn gen, ) hoặc sử dụng hóa chất (calcium phosphate, DEAE–dextran, liposome, ) [77]. Phương pháp vật lý được sử dụng thường xuyên nhất là sử dụng xung điện (electroporation). Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên đặc điểm màng tế bào hoạt động như một tụ điện không cho dòng điện đi qua. Người ta sử dụng hiệu điện thế cao gây sốc trong một thời gian ngắn làm tăng tạm thời điện thế màng tế bào lên xấp xỉ 1V. Kết quả là xảy ra sự tái tổ chức các thành phần trên màng một cách đáng kể, tạo ra những kênh vận chuyển nước hoặc các lỗ. ADN thẩm thấu vào trong tế bào qua đó [34, 66]. Phương pháp này có những ưu điểm như chuyển gen hiệu quả, áp dụng được với đa số các loại tế bào, có thể tiến hành với mô còn nguyên vẹn [77]. Tuy nhiên, xung điện ảnh hưởng lớn tới khả năng sống sót và sinh trưởng của tế bào (sự chuyển nhiễm tối ưu có thể đạt được trong điều kiện gây chết tới 50% số lượng tế bào) [61, 77]. Các phương pháp hóa học đều có bản chất là sự liên kết giữa phần mang điện tích dương của hóa chất sử dụng với gốc phosphate âm của bộ khung acid nucleic, hình thành phức hệ đại phân tử (polyplex). Phức hệ này được đưa vào trong tế bào chủ yếu bằng con đường thực bào. Vì vậy, phương thức này có ưu điểm là không ảnh hưởng lớn tới tế bào, tuy nhiên thao tác thực hiện tương đối phức tạp, đồng thời nhiều loại tế bào khó chuyển nhiễm bằng những hóa chất này. Kết tủa calcium phosphate và DEAE–dextran được sử dụng sớm nhất và hiện nay vẫn còn phổ biến, ngoài ra còn nhiều loại hóa chất khác như các phân tử polycationic (dendrimers polyamidoamine), polypeptide (polylysine, polyornithine, các dạng kết hợp giữa chúng) và polyethylenimine [77]. 1.1.2. Các phương pháp tạo gà chuyển gen 1.1.2.1. Vi tiêm trực tiếp ADN vào đĩa phôi giai đoạn sớm Vi tiêm ADN ngoại lai vào nhân nguyên của trứng mới thụ tinh là phương pháp đầu tiên được sử dụng để tạo động vật có vú chuyển gen và hiện nay vẫn rất phổ biến. Trên gà, phương pháp này cũng thu được thành công nhất định: Love và [...]... fibrinogen, hepcidin, trong khi làm giảm tổng hợp albumin và cytochrome P450 trong tế bào gan IL 6 tăng cường tổng hợp globulin miễn dịch trong các tế bào B hoạt động cũng như sự biệt hóa tế bào TH17 và T độc từ tế bào T nguyên phát Trong tủy xương, IL 6 kích thích sự trưởng thành của tế bào nhân khổng lồ thành tiểu cầu và kích hoạt tế bào gốc tạo máu IL 6 cũng hoạt động trên các tế bào nguyên bào sợi... hình chuyển gen thông qua trung gian tế bào ở gà Các tế bào gốc phôi (ESCs) hoặc tế bào sinh dục nguyên thủy (PGCs) thu nhận từ phôi được chuyển nhiễm với vector mang gen mong muốn, những tế bào mang gen chuyển được sàng lọc và vi tiêm trở lại phôi nhận, từ đó thu được gà khảm Phương pháp tương tự cũng được tiến hành với tế bào gốc tinh nguyên bào (SSCs) thu nhận từ tinh hoàn gà trống, những tế bào. .. quang để đánh dấu các nhiễm sắc thể, từ đó phát triển hai kỹ thuật FISH độc lập nhau là đa màu (Multiplex FISH – M -FISH) và kiểu nhân phổ (Spectral Karyotyping – SKY) Đây đều là những kỹ thuật đột phá, thường xuyên được sử dụng trong chẩn đoán và nghiên cứu [12, 38] 1.2.3 Ưu điểm của kỹ thuật FISH Kỹ thuật FISH được sử dụng phổ biến trong sinh học phân tử và chẩn đoán điều trị Nó có thể được ứng dụng trong. .. nhận từ phôi 2,5 và 5,5 ngày ấp, trong đó chứng minh rằng khả năng truyền lại gen chuyển của gà mái khảm tốt hơn so với gà trống [60 ] Ngoài ra, một số phòng thí nghiệm đã hướng đến sử dụng tế bào gốc tinh nguyên bào (Spermatogonial Stem Cells – SSCs) làm trung gian cho quá trình chuyển gen SSCs mang những đặc điểm đặc trưng của tế bào gốc đa tiềm năng, chiếm khoảng 0,33–0,44% số lượng tế bào trong. .. cấu trúc và chức năng tế bào, Một lợi thế nữa từ kỹ thuật FISH là cho phép quan sát từng nhiễm sắc thể trên kiểu nhân, qua đó nhận dạng được từng gen, nhiễm sắc thể và các bất thường di truyền [90, 91] FISH cũng được ứng dụng để xác định vị trí cài nhập của gen chuyển trong hệ gen tế bào chủ mà không đòi hỏi tách chiết ADN hệ gen cũng như không cần nuôi cấy thêm [29, 79] Kỹ thuật FISH được xem như cầu... với sự có mặt của lớp tế bào nuôi (feeder cells), những tế bào này vừa là giá thể, đồng thời cung cấp các nhân tố tăng trưởng giúp cESCs tăng sinh không biệt hóa Chúng tôi sử dụng nguyên bào sợi thai chuột đã bất hoạt phân bào làm tế bào nuôi cESCs Dòng tế bào này là sản phẩm của đề tài cấp Đại học Quốc gia Hà Nội “Đánh giá hiệu quả chuyển gen cecropin của vector chuyển gen transposon trên dòng tế bào. .. đây, người ta sử dụng các tế bào nuôi cấy in vitro làm trung gian cho quá trình tạo gà chuyển gen, nhờ đó sàng lọc ngay từ đầu những tế bào mang gen chuyển ở vị trí mong muốn, giảm thời gian cũng như chi phí đánh giá và chọn lọc kiểu hình cơ thể biến đổi di truyền [6, 88] Những loại tế bào được quan tâm gồm: tế bào gốc phôi, tế bào sinh dục nguyên thủy và tế bào gốc tinh nguyên bào (Hình 2) Nguyễn Tiến... nhóm nhỏ của tế bào lympho) được phát hiện lần đầu tiên ở gà [ 16] Các dòng gà chuyển gen có thể sử dụng để khám phá chức năng của nhiều gen trong quá trình phát triển phôi thai của động vật có vú nói chung Năm 20 06, nhóm nghiên cứu thuộc Đại học Sheffield (Anh) đã đánh giá khả năng bất hoạt gen của các ARN can thiệp (iARN) trên mô hình phôi gà Kết quả, các iARN có khả năng làm im lặng một số gen trong. .. CAAATGTTG Vector chuyển gen Vector được sử dụng để chuyển gen là pLenti6/V5–DEST (có nguồn gốc lentivirus), trong đó gen IL 6 người cùng trình tự dẫn được đưa vào thay thế đoạn ADN giữa hai vị trí attR1–attR2 trên vector gốc Đây là sản phẩm của đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ chuyển gen tạo ra động vật sản xuất protein dược liệu” (mã số KC.04.04/ 06 10) Vector cũng được sử dụng để tổng hợp... lên trong thời gian dài Vì vậy chúng trở thành công cụ hữu hiệu trong việc tạo động vật chuyển gen [4, 46] Năm 1990, Petitte đã lần đầu tiên tạo được gà khảm bằng phương pháp vi tiêm các tế bào đĩa phôi vào phôi giai đoạn X [68 ] Đến năm 20 06, Wang đã chuyển gen thành công vào ESCs bằng liposome và vector virus Sử dụng các tế bào này tiêm vào phôi nhận, nhóm nghiên cứu đã thu được gà con mang gen chuyển . nuôi tế bào gốc phôi gà 50 3.2.2. Thu nhận và duy trì tế bào gốc phôi gà chuyển gen 52 3.2.3. Kiểm tra sự có mặt gen chuyển trong tế bào bằng phản ứng PCR 54 3.3. KẾT QUẢ LAI FISH PHÁT HIỆN GEN. vị trí gen chuyển IL–6 trong tế bào gốc phôi gà chuyển gen, từ đó tạo tiền đề cho việc tạo gà chuyển gen thông qua tế bào gốc. Nghiên cứu này cũng góp phần phát triển kỹ thuật FISH trong nghiên. bản của retrovirus (hình trái): Virus xâm nhập vào tế bào chủ, sử dụng enzyme phiên mã ngược để tổng hợp ADN từ ARN của mình; ADN này hội nhập vào hệ gen tế bào, sử dụng bộ máy tổng hợp của tế