ảnh hưởng của ph, nhiệt độ, nacl và một số hóa chất lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm phân lập từ trứng cá nàng hai (chilata onata gray, 1813) tại ninh phụng trong điều kiện thí nghiệm

Từ thực tế đó, đồng thời giúp sinh viên làm quen với phương pháp nghiên cứu khoa học, áp dụng lý thuyết đã học vào thực tế và hoàn thành đề tài tốt nghiệp, được sự đồng ý của Bộ môn Bệnh

Tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc tới Thầy ThS Trần Vĩ Hích đã dìu dắt tôi trên con đường nghiên cứu khoa học, trực tiếp hướng dẫn tận tình, chu đáo trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài và viết luận văn

Xin cảm ơn Cô TS Nguyễn Thị Hà, Thầy ThS Lê Anh Tuấn đã cho tôi những lời khuyên quý báu để đề tài được hoàn thành

Xin cảm ơn Thầy ThS Lương Công Trung, ThS Bùi Thanh Tuấn đã giúp đỡ tôi trong quá trình thu mẫu làm đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động viên, giúp đỡ về tinh thần và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành đợt thực tập tốt nghiệp này

Xin gửi lời cảm ơn, lời chúc sức khỏe và thành công chân thành nhất đến tất

cả mọi người

Nha Trang, tháng 11 năm 2008 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Trang

MỤC LỤC

Trang Lời cảm ơn i

Mục lục .ii

Danh mục các bảng iv

Danh mục các hình v

Giải thích thuật ngữ và chữ viết tắt vii

Phần 1: Mở đầu 1

Phần 2: Tổng quan 3

2.1 Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh và gây bệnh trên cá và trứng cá nước ngọt 3

2.2 Một số đặc điểm sinh thái của cá nàng hai .7

2.3 Những bệnh nấm thường xảy ra trên trứng cá, cá nước ngọt và một số đặc điểm của nấm trên trứng và cá nước ngọt 8

2.3.1 Những bệnh do nấm thường xảy ra trên cá và trứng cá nước ngọt 8

2.3.2 Một số đặc điểm của nấm thường ký sinh và gây bệnh trên trứng cá và cá nước ngọt…… .10

2.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, NaCl và một số hóa chất thường dùng trị nấm trên trứng cá và cá nước ngọt 11

2.4 Đặc điểm chung và tình hình nghiên cứu nấm Zygomycetes…… 14

2.4.1 Đặc điểm chung của nấm Zygomycetes 14

2.4.2 Tình hình nghiên cứu Zygomycetes 16

Phần 3: Phương pháp nghiên cứu 19

3.1 Thời gian, đối tượng và địa điểm nghiên cứu 19

3.2 Sơ đồ khối nghiên cứu của đề tài 19

3.3 Thiết bị, hóa chất và môi trường nuôi cấy 20

3.3.1 Thiết bị 20

3.3.2 Hóa chất cần thiết 20

3.3.3 Môi trường nuôi cấy nấm 20

3.4 Phương pháp phân lập nấm ký sinh trên trứng cá nàng hai: 20

3.4.1 Phương pháp thu mẫu 20

3.4.2 Phương pháp phân lập nấm 21

3.4.3 Phương pháp định danh tên nấm 21

3.5 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của pH ……… .22

3.6 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và độ mặn 23

3.7 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của một số hóa chất 23

3.8 Phương pháp xử lý số liệu 24

Phần 4: Kết quả và thảo luận 25

4.1 Kết quả phân lập nấm từ trứng cá nàng hai nhiễm nấm 25

4.2 Tác động của pH lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm 30

4.3 Tác động của nhiệt độ và NaCl lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm 31

4.3.1 Tác động của nhiệt độ 31

4.3.2 Tác động của NaCl 32

4.3.3 Tác động của nhiệt độ và độ mặn 34

4.4 Tác động của hóa chất lên sự phát triển của hệ sợi nấm 34

4.4.1 Tác động của Milian lên sự phát triển của hệ sợi nấm 34

4.4.2 Tác động của Nistatin 36

4.4.3 Tác động của Atorvastatin 37

4.4.4 Tác động của H2O2 38

4.4.5Tác động của các hóa chất lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm 39

Phần 5: Kết luận và đề xuất ý kiến 41

5.1 Kết luận 41

5.2 Đề xuất ý kiến 41

Tài liệu tham khảo 43 Phụ lục

có chỉ số pH khác nhau 30 Bảng 4.2: Đường kính khuẩn lạc của nấm nuôi cấy ở các mức nhiệt độ khác nhau sau 48 h 31 Bảng 4.3: Đường kính khuẩn lạc của nấm nuôi cấy ở các mức nồng độ NaCl khác nhau sau 48 h 33 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ mặn lên sự sinh trưởng của hệ sợi

nấm sau 48h 34

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Chu trình sống của nấm tiếp hợp Zygomycetes 16

Hình 3.1 Sơ đồ khối của đề tài 19

Hình 3.2 Mô hình phân lập và phân loại nấm từ trứng cá nhiễm nấm 22

Hình 4.1 Trứng cá nàng hai bị nhiễm nấm 25

Hình 4.2 Khuẩn lạc nấm trong môi trường SDA 27

Hình 4.3 Khuẩn ty nấm trong môi trường SDA (100X) 27

Hình 4.4 Cơ quan sinh sản hữu tính giai đoạn còn non (100X) 28

Hình 4.5 Cơ quan sinh sản hữu tính sau khi tiếp hợp (100X) 28

Hình 4.6 Cơ quan sinh sản hữu tính sau khi tiếp hợp và túi bào tử (100X) 28

Hình 4.7 Cuống túi bào tử và túi bào tử không có gai (100X) 28

Hình 4.8 Cuống túi bào tử và túi bào tử có gai (100X) 28

Hình 4.9Túi bào tử giải phóng bào tử nhỏ (100X) 29

Hình 4.10 Bào tử lớn có gai và bào tử nhỏ (100X) 29

Hình 4.11 Bào tử lớn không có gai và bào tử nhỏ (100X) 29

Hình 4.12 Bào tử mọc mầm (100X) 29

Hình 4.13 Đường kính khuẩn lạc nấm sau 48 h nuôi cấy ở các môi trường SDA có chỉ số pH khác nhau 30

Hình 4.14 Đường kính khuẩn lạc nấm nuôi cấy 48h ở các mức nhiệt độ .32

Hình 4.15 Đường kính khuẩn lạc nấm sau khi nuôi cấy 48h ở các nồng độ NaCl 33

Hình 4.16 Đường kính khuẩn lạc nấm sau khi nuôi cấy 48h ở các mức nhiệt độ và nồng độ NaCl khác nhau ………34

Hình 4.17 Đường kính khuẩn lạc nấm sau khi ngâm trong các nồng độ Milian và nuôi cấy sau 72 h 35

Hình 4.18 Đường kính khuẩn lạc nấm sau khi ngâm trong các nồng độ Milian và nuôi cấy được 72 h 35

Hình 4.19 Đường kính khuẩn lạc nấm sau khi ngâm trong các nồng độ Nistatin và nuôi cấy sau 72 h 36

Hình 4.20 Đường kính khuẩn lạc nấm sau khi ngâm trong các nồng độ Nistatin

và nuôi cấy được 72 h 36 Hình 4.21 Đường kính khuẩn lạc nấm sau khi ngâm trong các nồng độ

Atorvastatin và nuôi cấy sau 72 h 37 Hình 4.22 Đường kính khuẩn lạc nấm sau khi ngâm trong các nồng độ

Atorvastatin, nuôi cấy được 72 h 37 Hình 4.23 Đường kính khuẩn lạc nấm sau khi ngâm trong các nồng độ H2O2

và nuôi cấy sau 72 h 38 Hình 4.24 Đường kính khuẩn lạc nấm sau khi ngâm trong các nồng độ H2O2

và nuôi cấy được 72 h 38 Hình 4.25 Đường kính khuẩn lạc nấm sau khi ngâm trong các hóa chất ở các

nồng độ cao nhất và nuôi cấy sau 72 h 40

Phần 1: MỞ ĐẦU

Trong thời gian qua, ngành thuỷ sản ngày càng phát triển và dần trở thành ngành kinh tế mũi nhọn của nhiều quốc gia và là nguồn cung cấp thực phẩm quan trọng cho cộng đồng các dân cư trên toàn thế giới.Trong đó có Việt Nam-một nước

có tiềm năng lớn về NTTS: bờ biển dài 3260km, diện tích mặt nước nội địa khoảng

1 triệu ha,vùng triều 0,7 ha và hệ thống đầm phá ven biển, cùng điều kiện thuận lợi của khí hậu nhiệt đới gió mùa Tuy nhiên, ở Việt Nam, nghề NTTS chỉ mới tập trung vào một số đối tượng quen thuộc: tôm sú, cá tra, cá ba sa và các đối tượng truyền thống: cá chép, mè, trôi…dẫn đến hiệu quả kinh tế còn hạn chế, chưa khai thác hết tiềm năng hiện có Để phát triển một cách toàn diện hơn chúng ta cần đa dạng hóa đối tượng nuôi, nâng cao hiệu quả sản xuất, đáp ứng nhu cấu thực phẩm ngày càng tăng của thị trường trong nước và xuất khẩu

Cá nàng hai (Chitala ornata Gray, 1831)-một loài thuộc họ cá thát lát (Notopteridae), là một đối tượng nuôi mới có nhiều ưu điểm hơn so với các loài cá khác trong họ cá thát lát: kích thước lớn, thịt thơm ngon, càng nuôi lâu càng có hiệu quả kinh tế, tỉ lệ thịt philê rất cao [4], [5], [6] Từ năm 2004, phong trào nuôi cá nàng hai phát triển mạnh nhưng con giống không đáp ứng đủ nhu cầu của người nuôi Nên việc đẩy mạnh phát triển sản xuất giống cá nàng hai là rất cần thiết Nhưng trở ngại lớn nhất trong quá trình sản xuất các đối tượng thủy sản nói chung và sản xuất cá nàng hai nói riêng hiện nay là vấn đề dịch bệnh Có thể nói bệnh là hiểm họa đối với nghề nuôi.Bệnh thường gặp là bệnh do vi khuẩn, nấm, virus, ký sinh trùng Trong đó bệnh nấm được xem là một trong những bệnh nguy hiểm Bệnh này có thể lây nhiễm rất nhanh, làm chết hàng loạt, thậm chí phải hủy

bỏ toàn bộ đợt sản xuất nếu không phát hiện bệnh kịp thời Mà bệnh này thường xảy

ra ở hầu hết các trại sản xuất giống trong quá trình ấp trứng- là khâu đầu tiên, rất quan trọng trong quá trình sản xuất giống Nên nó ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sản xuất Do đó, việc phát hiện bệnh kịp thời, tìm ra tác nhân gây bệnh và phương

pháp tổng hợp để phòng bệnh là một vấn đề hết sức cần thiết nhằm góp phần ngăn ngừa những thiệt hại do dịch bệnh gây ra

Từ thực tế đó, đồng thời giúp sinh viên làm quen với phương pháp nghiên cứu khoa học, áp dụng lý thuyết đã học vào thực tế và hoàn thành đề tài tốt nghiệp, được

sự đồng ý của Bộ môn Bệnh học Thủy sản, khoa Nuôi trồng Thủy sản, trường Đại học Nha Trang, tôi thực hiện đề tài :“Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, NaCl và một

số hóa chất lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm phân lập từ trứng cá nàng hai

(Chilata onata Gray, 1813) tại Ninh Phụng trong điều kiện thí nghiệm” Với các

nội dung như sau:

1 Phân lập nấm ký sinh trên trứng cá nàng hai

2 Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm phân lập từ trứng cá nàng hai

3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và NaCl lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm phân lập từ trứng cá nàng hai

4 Ảnh hưởng của một số hóa chất lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm phân lập

từ trứng cá nàng hai

Tôi hy vọng kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ đóng góp thêm những nghiên cứu cơ bản về nấm ký sinh và gây bệnh trên trứng cá nước ngọt và là cơ sở khoa học cho người sản xuất đưa ra những biện pháp phòng trị bệnh nấm, góp phần nâng cao tỉ lệ trứng nở trong quá trình sản xuất giống cá nàng hai Do còn thiếu kinh nghiệm, đề tài được thực hiện trong khoảng thời gian ngắn, nên khó tránh khỏi những thiếu sót, kính mong được sự chỉ dạy, góp ý của quý thầy cô và các bạn Tôi xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, tháng 11 năm 2008 Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Thị Trang

Phần 2: TỔNG QUAN 2.1 Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh và gây bệnh trên cá và trứng cá nước ngọt

Trong các tác nhân gây nhiễm bệnh cho ĐVTS thì tác nhân do nấm là rất quan trọng, có thể gây ra cũng gây ra những hậu quả nặng nề, chúng làm giảm đáng kể tỉ

lệ trứng nở, cá bột và cá trưởng thành.Trong một số trường hợp sự nhiễm nấm trên trứng trong một bể ấp nếu nghiêm trọng có thể phải hủy hoàn toàn bể ấp.Trong trường hợp hình thành dịch bệnh, chúng có thể ảnh hưởng đến kinh tế của vùng [9] Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về nấm ký sinh và gây bệnh trên trứng

và cá nước ngọt Theo Chukanhom K.& Hatai K.(2003) bệnh do nấm thường xuyên xảy ra ở giai đoạn trứng trên nhiều loài cá khác nhau Tỉ lệ trứng hỏng trong quá trình ấp do sự nhiễm nấm đôi khi đạt đến 80%-100% tổng số trứng ấp [12], [14] Các công trình nghiên cứu về nấm chủ yếu được thực hiện theo ba hướng chính là: xác định tác nhân gây bệnh, nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố sinh thái (pH, nhiệt độ, nồng độ NaCl) lên sự phát triển của nấm và thử nghiệm nhằm tìm ra những hóa chất có hiệu quả phòng trị bệnh nấm trên trứng cá và cá

Có rất nhiều công trình nghiên cứu về các loài nấm gây bệnh trên nhiều loài cá khác nhau Tuy nhiên sự hiện diện và gây bệnh của những loài nấm rất khác biệt theo từng vùng địa lý khác nhau, có những loài ký sinh hay gây bệnh trên loài cá này nhưng vô hại đối với loài cá khác [9], [14]

Nấm ký sinh trên cá xuất hiện ở nhiều nơi trên thế giới, tùy vào từng vị trí địa

lý mà thành phần loài có sự khác nhau Ví dụ như đối với giống Saprolegnia: ở Châu Âu đặc biệt là nước Anh, nó chiếm ưu thế trong nước ngọt nhưng ở Châu Phi thì không có sự hiện diện của loài này Trong nghiên cứu về họ Saprolegniaceae tại những hồ và suối ở Nigeria và Alabi chỉ thấy xuất hiện Achlya, Aphanomyces, Brevilegnia, Dictyuchus, Pythiosis,Thraustotheca và Geolegnia [9]

Nhiều nghiên cứu về nấm gây bệnh trên cá cho kết quả là do các loài nấm thuộc họ Saprolegniaceae, ví dụ như kết quả phân lập được giống nấm Achlya và Saprolegnia (Scott và Narren, 1964), Achlya và Dictyuchus từ vết thương của

những con cá nhiệt đới bị chết [9]; Achlya, Aphanomyces, Dictyuchus và Saprolegnia trên cá bị bệnh ở Ấn Độ [51].Achlya klebsiana từ những vết loét trên thân cá lóc tại Myanmar [25]

Nghiên cứu của Bazyli Czeczuga và ctv (2001), đã tìm thấy 127 loài nấm nước, trong đó có 28 loài được biết là ký sinh trên cá nước ngọt, chủ yếu là thuộc giống Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces trong những mẫu lấy từ 32 loài côn trùng dưới nước ở Ba Lan [14]

Nghiên cứu của B Czeczuga, B Kiziewicz (1999) về nấm trên trứng cá

Carassius carassius, kết quả phân lập được một số giống loài nấm mới, hiếm thấy

hoặc chưa thấy trên trứng cá như Brevilegnia unisperma, Chytridium lagenula,

Olpidiopsis achliae, Olpidiopsis varians, Phyctochytrium aureliae, Pythiopsis humpreyana, Pythium gracile, Rhizophydium keratinophilum và Woronina

polycystis[28]

Khi đã phân lập được chủng nấm cũng chưa khẳng định được chúng có phải là tác nhân gây bệnh chính, tác nhân đầu tiên hay tác nhân cơ hội Nhiều công trình đã được tiến hành nhằm nghiên cứu vấn đề này

Monsma (1936) tiến hành một chuỗi nuôi cấy các loài thuộc

Saprolegniaceae trên trứng và cá hồi thuộc hai loài là Micropterus dolomieu và

Lepomis pallidus Những trứng sống của giống Micropterus dolomieu không bị xâm

nhập bởi các loài thuộc họ Saprolegniaceae dùng trong thí nghiệm Không có con cá hồi nào của cả hai loài bị nhiễm khi nuôi chung với 4 loài Achlya và 3 loài Saprolegnia Và ông cũng chứng minh đã gây nhiễm thành công với những con cá được gây viết thương trước khi chúng được đem đi thí nghiệm [9]

Thí nghiệm cảm nhiễm nấm Achlya và Saprolegnia trên cá Lebistes

reticlatus và Xiphophorus helleri bị rạch vết thương trước của Norland và Tintigner

(1973) cho 75% cá bị nhiễm nấm trong lô cá thí nghiệm Thí nghiệm của Nish (1976, 1997) cảm nhiễm nấm Saprolegniaceae lên cá hồi và khẳng định vết thương không phải là điều kiện chủ yếu cho sự lây nhiễm nấm mà do một vài nhân tố khác làm suy yếu cơ chế phòng thủ tự nhiên của cá, tạo điều kiện cho nấm xâm nhập

như: stress, mật độ nuôi dày hay bị sốc nhiệt; ngoài ra khi bỏ đói cá hồi trưởng thành kết hợp với các nhân tố trên càng làm cho cá dễ dàng nhiễm nấm Năm 1980, Nish và Hughes nhấn mạnh hơn nữa tầm quan trọng của stress trong việc gây nhiễm nấm trên cá [9]

Song song với những nghiên cứu về xác định tác nhân gây gệnh nấm trên cá và trên trứng, cũng có những nghiên cứu về đặc điểm sinh thái của những loài nấm này

để tìm ra ngưỡng sinh thái mà chúng có thể phát triển Theo nghiên cứu của Kitancharoen và ctv (1997) nếu bằng phương pháp ngâm trứng cá hồi (trong 1h, 2 lần/ tuần và có sục khí) thì với NaCl 25 ppt thì tỉ lệ trứng nở cao nhất (78,7%), trứng bị nhiễm nấm ít nhất (chỉ 2,3%); còn nếu ấp trứng bằng nước với nồng độ NaCl: 3, 5, 7 ppt thì đều có hiệu quả phòng, trị nấm nhưng hiệu quả nhất ở 7ppt [24]

Jonson T.W và ctv (2002) đã đưa ra các bảng thống kê về: vùng nhiệt độ và

vùng pH cho sự phát triển của hệ sợi các loài Saprolegnia phân lập từ cá và trứng

cá (ở bảng 2.1 trang 12, bảng 2.2 trang 13) [9]

Koeypudsa, W và ctv (2005) nghiên cứu về ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, nồng

độ NaCl lên sự phát triển của Saprolegnia sp cho kết quả Saprolegnia sp phát triển tối ưu ở pH 7-10, nhiệt độ 25oC, nồng đô NaCl là 0-5 ppt [26]

Cùng với những công trình nghiên cứu về xác định tác nhân gây bệnh nấm, ảnh hưởng của các yếu tố sinh thái (nhiệt độ, pH, nồng độ NaCl) lên sự phát triển của nấm trên cá và trên trứng cá, nhiều thử nghiệm nhằm tìm ra những hóa chất có hiệu quả phòng trị nấm trên trứng cá và cá nước ngọt cũng được thực hiện

Năm 1994, Hong-Kyu-Min và ctv đã tiến hành nghiên cứu về khả năng ức

chế của hợp chất Chitosan đối với nấm Saprolegnia parasite gây bệnh trên cá

nước ngọt với kết quả:0.06% Chitosan ức chế sự phát triển bào từ động, 0.05% Chitosan ức chế sự phát triển của khuẩn lạc nấm trên môi trường GY nhưng lai không có tác dụng ức chế sự phóng thích bào tử động từ túi bào tử [27]

Năm 1997, Kitancharoen và ctv, đã nghiên cứu hiệu quả kháng nấm của NaCl trên trứng cá hồi bị nấm thủy mi [24]; Kishio Hatai và ctv đã thử nghiệm hiệu quả

kháng nấm của Hydrogen Peroxyde (nước oxi già- H2O2) ở tỉ lệ hoạt tính là 31% trên trứng cá hồi Kết quả cho thấy ở nhiệt độ 13oC, trong thời gian 60 phút, H2O2 ở nồng độ ≤ 1000 µl/ml không gây hại cho trứng cá hồi Đặc biệt là khi dùng H2O2 ở nồng độ 250 – 1000 µl/ml có khả năng ức chế, kìm hãm, tiêu diệt sự phát triển của

nấm Saprolegnia và Achlya Vậy H2O2 là một loại hóa chất có tác dụng tiêu diệt

nấm ở ĐVTS Tuy vậy, tác giả cũng khẳng định tùy theo điều kiện nhiệt độ mà lựa chọn nồng độ cho phù hợp [9], [20]

Năm 1998, Nilubol Kitancharoen, Atsushi Yamamoto và Kishio Hatai đã thử nghiệm về ảnh hưởng của Sodium Clorid (NaCl), H2O2 và Xanh Malachite trên trứng cá hồi nhiễm nấm đã kết luận không có sự khác biệt đáng kể trong nghiên cứu giữa H2O2 1000 µl/ml và Xanh Malachite 2 µl/ml Đối với NaCl 25 ppt kém hiệu quả hơn Xanh Malachite 2 µl/ml [21]

Năm 2003, Brian C Small và William R Wolters đã thử nghiệm sử dụng

H2O2 trong bể ấp trứng cá da trơn và kết quả nghiên cứu cho thấy những cải tiến quan trọng bằng việc sử dụng H2O2 như một chất có hiệu quả kinh tế trong việc gia tăng tỉ lệ nở của trứng cá da trơn thay cho việc sử dụng formalin [29]

Ở nước ta, bệnh nấm cũng gây thiệt hại nhiều cho nghành nuôi trồng thủy sản, nhất là nấm xuất hiện trong thời ký ấp trứng

Nguyễn Thị Hà (1997), trong “Điều tra nghiên cứu bệnh nấm ở cá trắm cỏ

Ctenopharygodon idellus nuôi ở vùng Tiền Sơn, Bắc Ninh” đã xác định được 3 giống nấm là Saprolegnia, Achlya, Branchiomyces Trong đó, nấm Saprolegnia nhiễm trên trứng là 52,5%, Achlya chiếm 47, 5% thường thấy trên cá trắm cỏ bị

bệnh đốm đỏ, lở loét Tỷ lệ nhiễm nấm Branchiomyces sp trên cá hương là 50%, cá giống là 46,7% [8]

Bùi Quang Tề (1998) đã phân lập được 51 mẫu cá nhiễm nấm từ 68 mẫu cá trắm cỏ thu từ các địa phương với tỷ lệ nhiễm 75%, 114 mẫu cá nhiễm nấm từ 140 mẫu cá trắm cỏ nuôi ở Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1, với tỷ lệ nhiễm

74,3% Các giống nấm đã phân lập được là Saprolegnia sp, Achya sp,

Aphanomyces sp, Phoma, Pythirium [1]

Đỗ Thị Hòa và ctv (2004) trình bày trong cuốn Bệnh học Thủy sản, ở Việt Nam hội chứng lở loét đã xuất hiện ở cá nuôi và cá tự nhiên ở hầu hết các địa phương khác nhau từ năm 1990; nấm thủy mi thường phát triển vào mùa nhiệt độ thấp (18-25oC), Branchiomyces cũng xuất hiện trên nhiều loài cá nước ngọt ở Việt Nam [2]

Năm 2006, Nguyễn Thị Huyền đã nghiên cứu xác định nấm thủy mi nhiễm trên trứng cá tra ,cá ba sa và thử nghiệm hiệu quả phòng Ngoài ra, cũng trong năm

2006 trong hội thảo Quốc tế Thủy sản tại Nha Trang, TS Lý Thị Thanh Loan đã báo

cáo kết quả khảo sát vòng đời của Achlya sp nhiễm trên trứng cá tra và cá ba sa;

trong hội thảo Quốc tế Công nghệ sinh học Nông nghiệp, đã báo cáo kết quả thử

nghiệm sàng lọc một số loại hóa dược có khả năng ức chế Achlya sp nhiễm trên

trứng cá tra, ba sa [9]

2.2 Một số đặc điểm sinh thái của cá nàng hai

Mai Đình Yên & ctv (1979) đã phân loại cá nàng hai Chitala ornata (Gray,

1831) và mô tả đặc điểm như sau:

Loài: Chitala ornata Gray, 1831

Một số tên khoa học thường gọi khác: Notopterus chitala Hamilton, 1822

Chitala chitala Hamilton, 1822

Đặc điểm hình dạng ngoài: nhìn chung hình thái ngoài họ cá thát lát Notopteridae có dạng: thân dẹp ngang, viền lưng cong rất rõ, viền bụng có gai, đầu nhỏ, vây bụng thoái hóa, vây lưng nằm khoảng giữa thân, vây hậu môn liền với vây đuôi, vẩy tròn nhỏ, đường bên hoàn toàn [5], [6]

Qua nghiên cứu của Nguyễn Chung (2006), đây là loài cá dữ và môi trường thích hợp cho cá nàng hai sinh trưởng và phát triển là: độ mặn dưới 6 ‰, pH 5,5 ÷ 8,5, nhiệt độ nước 20 ÷ 30oC, Oxy từ 3 ÷ 8 mg/L Môi trường thích hợp cho cá nàng hai sinh trưởng và phát dục là: nhiệt độ 20 ÷ 30oC, pH 5,5 ÷ 7,5, Oxy ≥ 3 mg/L…

Cá có tập tính làm tổ đẻ trứng dính Trứng cá có kích thước khá lớn, đường kính trứng giai đoạn IV có thể đạt 2 ÷ 3 mm Ở nhiệt độ 28 – 30oC, thời gian ấp trứng là

7 ngày [4], [5], [6]

Hiện nay, trên thế giới đang phát triển việc sinh sản nhân tạo cá nàng hai nhưng việc nghiên cứu còn nhiều hạn chế, hầu hết mới chỉ dừng lại ở việc mô tả các hoạt động sinh sản của cá trong tự nhiên hay bố trí tạo điều kiện cho cá đẻ tự nhiên Thái Lan và Việt Nam là hai nước đi đầu trong công tác nghiên cứu sinh sản nhân tạo cá nàng hai (Lê Quý Cường, 2006) [5], [6]

2.3 Những bệnh nấm thường xảy ra trên trứng cá, cá nước ngọt và một số

đặc điểm của nấm trên trứng và cá nước ngọt

2.3.1 Những bệnh do nấm xảy ra trên cá và trứng cá nước ngọt

Trên cá và trứng cá nước ngọt, thường xảy ra các bệnh: bệnh nấm hạt Dermocystidiosis, Bệnh nấm mang Branchiomycosis, hội chứng lở loét (EUS) và

nấm thủy mi [2], [32], [33]

• Bệnh nấm hạt Dermocystidiosis: do Dermocystidium spp, thường ký sinh

trên vây, dưới da và mang cá chép, cá trắm, cá lóc [2], và tìm thấy những u hạt cả trong nội tạng của cả cá cảnh, cá rô phi, cá chép, cá hồi [32] Những chỗ bị bệnh sưng tấy màu hồng, xung quanh có các đốm viêm nhỏ, chứa các bào tử Bệnh bùng phát lần đầu tiên vào mùa xuân năm 1991, gây chết 80 con cá bố mẹ ở Estonia [19]

và bệnh không xảy ra ở Châu Phi [32] Bệnh không gây chết hàng loạt động vật thủy sản mà là tác nhân mở đường Bệnh thường xuất hiện vào mùa xuân [2]

• Bệnh nấm mang ở cá: do một số loài thuộc giống Branchiomyces, trong đó chủ yếu là do hai loài B sanguinis và B demigrans Các bào tử nấm bám vào mang

phát triển thành các sợi nấm, sau đó sợi nấm xuyên sâu vào các tổ chức của mang

và phân nhánh luồn vào các mao huyết quản, làm mất tác dụng hô hấp của mang

Khi cá bệnh nặng, các khuẩn ti và bào tử nấm theo mạch máu di chuyển đến tim và một số bộ phận khác [2], [32], [34] Tuy vậy, bệnh chỉ biết đến từ giai đoạn sợi nấm phát triển trong mang [32] Bệnh thường xảy ra ở dạng cấp tính, làm cá giống chết hàng loạt Bệnh xảy ra trên các loài cá nước ngọt như: cá trắm, cá mè, cá trôi, cá diếc Bệnh phát triển mạnh vào mùa có nhiệt độ cao [2],[32], [34]…

• Hội chứng lở loét trên cá (EUS): có nhiều loại tác nhân gây bệnh: virus, vi khuẩn, ký sinh trùng, nấm nhưng nấm được coi là nguyên nhân chính và

Aphanomyces invadans là nguyên nhân cần thiết [2], [3] Một số giống nấm bậc

thấp như Aphanomyces spp, Saprolegnia spp và Achlya cũng được tìm thấy trên

cơ thể cá bị bệnh EUS Cá bị bệnh có vết mòn màu xám hoặc các đốm đỏ phát triển

ở đầu, thân, các vây và đuôi, dần dần lan rộng và sâu thành những vết loét, vẩy rụng, xuất huyết và viêm Nội tạng cá bệnh rất bình thường Bệnh được thông báo đầu tiên ở Nhất Bản, sau đó là Úc [3] Bệnh thường xảy ra vào mùa mưa lũ, có nhiệt

độ thấp.EUS ảnh hưởng đến các loài cá nước ấm, ngọt và lợ Một số loài có tính nhạy cảm cao: cá lóc, cá trôi, cá trê, cá đối, cá diếc…[2], [3]

• Bệnh nấm thủy my: Đây là bệnh gây nhiều thiệt hại nghiêm trọng trên nhiều loài cá nước ngọt, nhất là giai đoạn ấp trứng [10] Gây bệnh là một số loài thuộc các

giống: Saprolegnia, Leptolegnia và Achlya; họ Saprolegniaceae; bộ Saprolegniales

Đó là họ phổ biến trong môi trường nước cả ở dạng ký sinh và hoại sinh trên cá và động vật giáp xác [10], [13].Cá bị bệnh trên da cá xuất hiện các vùng trắng xám, sau

đó sợi nấm mọc và phát triển lên thành từng búi nấm trắng như bông, 1 đầu sợi nấm bám vào da của cá, đầu kia tự do ngoài môi trường nước

Nấm thủy my có thể ký sinh làm ung trứng cá Phần gốc của sợi nấm cắm sâu vào màng trứng, phần ngoài của sợi nấm lơ lửng trong nước tủa ra xung quanh Trứng cá bị nhiễm nấm thường chết (ung), với nhân trứng chuyển sang màu trắng đục Trong bể ấp, nấm phát triển đầu tiên ở các trứng ung, sau lây sang các trứng khỏe và làm trứng bị chết Bệnh thường xảy ra vào mùa có nhiệt độ thấp, thích hợp

ở nhiệt độ nước từ 18- 25oC Tuy vậy, có một số loài Achlya có thể phát triển tốt ở nhiệt độ cao hơn thế [1]

Như vậy, trong các bệnh do nấm trên cá nước ngọt thì bệnh nấm thủy mi và hội chứng EUS thường gặp nhất trên cá nước ngọt và gây thiệt hại lớn nhất Nhưng bệnh thường xảy ra nhất trên trứng và cá nước ngọt là bệnh nấm thủy mi [2], [7]

2.3.2 Một số đặc điểm của nấm thường ký sinh và gây bệnh trên trứng cá

và cá nước ngọt

Có nhiều loài nấm có khả năng gây bệnh trên cá như Branchiomyces,

Democystidium,…Tuy nhiên, gây bệnh trên cá và trứng cá thường là nấm ở bộ mốc

nước (Saprolegniales) thuộc lớp nấm noãn (Oomycetes) Trong đó, quan trọng là họ Saprolegniaceae là thuộc họ mốc nước phổ biến trong môi trường nước cả dạng ký sinh và hoại sinh trên cá, và gây bệnh nấm thủy my trên trứng cá Đặc biệt là các giống Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces, Leptolegnia thường xuyên gặp trên trứng và cá nước ngọt [13] Các giống này được phân loại dựa theo hình thái: có thể dựa vào hình thức sinh sản vô tính để phân biệt đến giống và dựa trên hình thức sinh sản hữu tính để phân loại đến loài [9], [18]

− Đối với giống Saprolegnia: động bào tử sơ cấp (có dạng hạt với hai roi ở sau) được phóng thích ra khỏi túi sinh bào tử và di chuyển trong môi trường nước, sau một thời gian ngắn chúng sẽ bị bao lại hình thành bào nang sơ cấp Sau đó động bào tử thứ cấp (dạng thận với hai roi nằm bên) sẽ được phóng thích khỏi bào nang

sơ cấp Động bào tử thứ cấp tồn tại lâu hơn và cũng được bao lại thành bào nang thứ cấp Bào tử thứ cấp này có thể chết đi hoặc nảy chồi tạo thành hệ sợi mới và trong một số trường hợp chúng có thể phóng thích trở lại động bào tử thứ cấp khi gặp điều kiện không thuận lợi cho sự nảy chồi [12], [18]

− Giống Achlya: khác với giống Saprolegnia, bào tử sơ cấp của Achlya ngay lập tức được bao lại thành bào nang khi vừa phóng thích ra khỏi miệng túi sinh bào

tử, các bào nang sơ cấp này tụ lại trên miệng túi bào tử thành một khối có dạng hình cầu Sau một thời gian, động bào tử thứ cấp sẽ được giải phóng khỏi bào nang

sơ cấp và di chuyển trong nước, sau đó chúng dừng lại hình thành bào nang thứ cấp, bào nang này sẽ chết đi hoạc nảy chồi thành sợi nấm mới Tuy nhiên các loài thuộc giống Achlya bào nang thứ cấp của chúng không có khả năng phóng thích ngược

trở lại bào tử thứ cấp như Saprolegnia Có sự gia tăng về đường kính khuẩn ty khi biến đổi thành cuống sinh bào tử vô tính ở hai giống Achlya và Saprolegnia[9]

− Giống Aphanomyces: Các loài thuộc giống này có cách phóng bào tử giống như Achlya (bào tử sau khi phóng thích tụ lại trên miệng túi bào tử, sau một thời gian giải phóng động bào tử thứ cấp) Nhưng túi bào tử của Aphanomyces không phình ra kích thước hệ sợi và túi bào tử vô tính khoảng 10 µm) và các động bào tử

sơ cấp trong túi bào tử vô tính chỉ xếp thành một hàng [9], [23]

− Giống Leptolegnia: Túi bào tử vô tính dạng sợi mảnh, kích thước tương tự với túi bào tử vô tính của Aphanomyces nhưng cách phóng thích bào tử lại giống với Saprolegnia, nghĩa là bào tử sơ cấp dạng hạt sẽ di chuyển ngay vào môi trường nước khi vừ ra khỏi túi sinh bào tử vô tính Ngoài ra, bào tử vô tính hình thành theo một hàng rất rời rạc, mỗi bào tử vô tính cách nhau khoảng 50 µm [9]

Đặc điểm về hình thức sinh sản hữu tính là yếu tố quan trọng để định danh tới loài, bằng cách: dựa vào vị trí của bào tử hữu tính trong túi bào tử hữu tính (lệch tâm, trung tâm hay dưới tâm), số lượng bào tử hữu tính trong túi noãn, số lượng

hùng khí, cách thức tiếp hợp mà phân loại ra loài trong cùng một giống [9], [18]

2.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, NaCl lên sự phát triển của hệ sợi nấm và một số hóa chất thường dùng trị nấm trên trứng cá và cá nước ngọt

Giống như những vi sinh vật khác trong hệ sinh thái, nấm cũng chịu ảnh hưởng rất lớn bởi yếu tố nhiệt độ, pH, nồng độ NaCl trong quá trình sinh trưởng và phát triển Ngoài ra, những đặc điểm này còn có tầm quan trọng trong việc định danh của một số loài nấm [9] Sự phân loại nấm đặc biệt là nấm gây bệnh trên cá và trứng cá

là một phần quan trọng của việc chẩn đoán bệnh Từ đó thử những hóa chất trị nấm,

để đưa ra phương pháp điều trị thích hợp cho từng loại bệnh Nghiên cứu ngưỡng nồng độ NaCl có tác dụng quan trọng là tìm ra nồng độ có tác dụng trị nấm trên trứng cá và cá Hơn nữa, đặc điểm sinh học khác nhau có thể là kết quả về mức độ lây truyền bệnh và tính đặc hiệu ký chủ [22]

• Yếu tố nhiệt độ: Nấm chỉ phát triển trong phạm vi nhiệt độ giới hạn nằm

giữa hai cực -10oC và +90oC Trong phạm vi này nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ

sinh trưởng, nhu cầu dinh dưỡng và ở một mức độ nhất định thì ảnh hưởng cả đến thành phần enzim và thành phần hóa học của tế bào

Ảnh hưởng của nhiệt độ là rất quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của mỗi loài nấm ký sinh và gây bệnh trên trứng cá và cá, đặc biệt là đối với nấm thủy mi Đối với từng loài nấm sự ảnh hưởng của nhiệt độ là khác nhau [18] (bảng 2.1)

Bảng 2.1: Khoảng nhiệt độ cho sự phát triển hệ sợi của Saprolegnia được phân

lập từ cá và trứng cá [9], [18] (*: không phát triển ở mức này)

Nhiệt độ (oC) Loài

<10

1

20-28 10-25

21

- 27,5 13,8-17,9 18-30 Khoảng 25

W.N.Tiffney, 1963 Rucker, 1944 Hoshina & ctv,1960 Powell & ctv,1972 Duff, 1929

Ở mỗi giai đoạn phát triển, nhiệt độ tối ưu là khác nhau ví dụ như với loài nấm

Aphanomyces frigidophilus sp nov đượ c tìm thấy trên trứng cá Salvelinus

leucomaenis khi khảo sát trong phòng thí nghiệm cho thấy động bào tử phát triển tốt nhất tại 10oC, khuẩn lạc phát triển tốt nhất ở 25oC và tại nhiệt độ 35oC nấm sẽ

ngừng phát triển [20], [23].Còn theo Haitai và ctv (2005), Saprolegnia sp phát triển

ở ngưỡng nhiệt độ: từ 5- 30oC, trên 30oC nấm rất ít phát triển và chết ở >35oC, nhiệt độ tối thích là 25oC [26]

• Yếu tố pH: pH có vai trò quan trọng trong sinh trường và phát triển của

nấm

Một số tác giả đã cho rằng pH môi trường có ảnh hưởng tới sự hiện diện của

một số loài nấm Ví dụ như đối với Achlya americana xuất hiện trong môi trường

có pH 3,6 ÷4,8(theo R.E Roberts 1963), Aphanomyces stellatus có trong pH 6,0 6,5

(Stpiczynska 1962) [9] Đối với mỗi loài nấm đều có khoảng tối thích cho sự phát triển Trong cùng một loài, nhưng phân lập từ nhiều nguồn khác nhau thì khoảng

pH phù hợp cho sự phát triển khác nhau Điều này có thể thấy trong loài

Saprolegnia parasitice (bảng 2.2)

Bảng 2.2: Vùng pH cho sự phát triển hệ sợi của Saprolegnia được phân lập từ cá

và trứng cá [9], [18] (*: không phát triển ở mức này)

pH Loài Thấp nhất * Thích hợp Cao nhất* Tác giả

<3,0 _

<3,0 5,2

5,0-6,8 _ 5,5-8,0 4,0-7,0 4,0-8,0 6,2-6,6

_ _

>8,0

>9,0

>10,0 8,0

Chong, 1973 Hatai & Egusa, 1977 W.N.Tiffney, 1963 Arasaki &ctv, 1895a Powell & ctv,1972 Duff, 1929

• Nồng độ NaCl: Nồng độ NaCl ảnh hưởng rất lớn đến sự sống, sinh trưởng

phát triển của nấm Dựa trên nồng độ NaCl trong môi trường sống của nấm mà phân thành 3 nhóm: nấm sống trong nước mặn, trong nước ngọt và trong nước lợ Đối với từng giống loài nấm thì ngưỡng nồng độ NaCl thích hợp khác nhau Dựa trên ngưỡng nồng độ NaCl đó của từng loài nấm (đặc biệt đối với nấm ký sinh và gây bệnh trên cá và trứng cá) mà NaCl được dùng phòng, trị nấm Ví dụ đối với nấm

Saprolegnia sp vẫn có khả năng phát triển ở khoảng nồng độ NaCl là 0- 30 ppt, nhưng nấm có khả năng phát triển mạnh nhất ở 0- 5 ppt, >15 ppt nấm phát triển kém và không mọc ở 30 ppt [26] Thường trị nấm này trên trứng bằng cách tắm trứng trong NaCl 20- 30 ppt trong 5-15 phút, tắm 2 lần/ngày [2]

• Một số hóa chất thường dùng trị nấm trên trứng và cá nước ngọt:

Do mới chỉ nghiên cứu về nấm thủy mi trên trứng cá nước ngọt nên các hóa chất thường dùng trị nấm trên trứng cũng là trị nấm thủy mi Trước đây, đối với cá bệnh có thể dùng: Malachite Green (0,15-0,2ppm), Methylen (2-3ppm); đối với trứng cá nhiễm nấm: NaCl (2-3 %), Malachite Green (0,15-2ppm), Methylen (2-3ppm), formol 1/500-1/1000, H2O2 [2], [3], [9], [20], [21]

Trong đó, Malachite Green được cho là chất kháng nấm hiệu quả và thường được sử dụng nhất (Cline and Post, 1972; Hatai, 1998) [20] Theo Schreier T M., Rach J J và ctv (1996), Haitai (1997) trứng nhiễm nấm ngâm trong H2O2 nồng độ 250-1000 µg/mL, 60 phút ở 13oC có hiệu quả tốt như Malachite Green [20], [21], [23]…

Nhưng dù Malachite Greenlà 1 chất rẻ tiền, dễ tìm mà lại cho kết quả rất tốt trong NTTS nhưng trên thế giới hiện nay rất nhiều nước đã cấm sử dụng, trong đó

có Việt Nam (theo danh mục các chất cấm sử dụng của Bộ Thủy Sản Việt Nam

trong sản xuất kinh doanh thủy sản ký ngày 2/2/2005) do có tiềm năng gây ung thư cho người [20]

2.4 Đặc điểm chung của nấm Zygomycetes và tình hình nghiên cứu nấm Zygomycetes

2.4.1 Đặc điểm chung của nấm Zygomycetes

Zygomycetes là lớp nấm mà có sinh sản bằng bào tử bất động (bào tử nội sinh) là hình thức sinh sản vô tính chính, và sinh sản hữu tính là kết quả của sự hợp nhất các túi giao tử đực và cái tạo thành bào tử tiếp hợp

Nấm có hệ sợi phân nhánh phát triển nhưng chưa có vách ngăn ngang, cũng

có loài khi già hình thành vách ngăn ngang Sợi nấm có màu nâu, xám, trắng Tế bào nấm chứa đầy đủ các thành phần: ti thể, nhân, ri bộ thể, hạt lipid, mạng nội mạc, không có trung thể [7], [16]…

Hình thức sinh sản:

− Zygomycetes sinh sản vô tính bằng bào tử nội sinh (bào tử kín) được đựng trong bọc (nang bào tử, các nang bào tử này thường được nâng khỏi sợi nấm nhờ cuống nang bào tử) [7]

− Sinh sản hữu tính là tiếp hợp (zygogamy), hai cơ quan tiếp hợp hình thành

trên hai sợi nấm khác dấu (sợi – và +) cùng gốc (sinh ra từ một bào tử) hay khác gốc (sinh ra từ hai bào tử) [2], [7] Các túi giao tử thường giống nhau về các đặc điểm hình thái học nhưng đôi khi có sự sai khác lớn về kích thước [16] Sau khi tiếp hợp có thể kết hợp nhân ngay hoặc xếp thành đôi, sau một thời gian mới kết hợp Hợp tử có vách dày phát triển, còn hai cơ quan tiếp hợp teo đi và được gọi là dây treo Bào tử tiếp hợp chống chịu sự khô hạn và những yếu tố bất lợi của môi trường Hầu hết nấm tiếp hợp khi sinh sản hữu tính không tạo thành quả thể, hợp tử nằm rải rác trong giá thể [7], [16]

Lớp này có 4 bộ là: Mucorales, Entomophthorales, Zoopagales và Endogonales, với khoảng 400 loài nấm ký sinh trên cả động vật, thực vật, và nấm khác [3, 18] Màng tế bào chủ yếu là chitosan-chitin Chitosan có nhiều ở bộ Mucorales và Entomophthorales, nhưng không có ở bộ Zoophagales [18], [70] Entomophthorales và Zoopagales sinh sản vô tính duy nhất bằng bào tử đính, túi giao tử không tham gia vào thành phần vách bào tử tiếp hợp, và ký chủ đặc trưng là côn trùng, động vật không xương sống và những động vật khác, một số có thể sống hoại sinh:

− Entomophthorales: Hệ sợi có thể có vách ngăn khi già Sinh sản sinh dưỡng bằng cách tách các tế bào giống như hình thành bào tử Sinh sản vô tính bằng đính bào tử [1] Điều đặc biệt là nếu bào tử được phóng ra trong môi trường không thuận lợi thì chúng có thể phóng thích trở lại thành đính bào tử thứ cấp nhỏ hơn Điều này có thể lặp lại nhiều lần Các loài của bộ thường gây bệnh trên một số loài côn trùng, trên thực vật và động vật Nhiều loài ký sinh trên côn trùng và động vật phát triển mạnh hệ men phân giải protein [16]

− Zoopagales: Sinh sản vô tính bằng đính bào tử Đính bào tử đơn độc hoặc trong chuỗi Cũng có nhiều loài có hệ men phân giải protein ký sinh trên côn trùng

và động vật [7], [16]

− Mucorales: chỉ một số ít loài có vách ngăn ngang tạo hệ sợi đa bào, một số khi già hình thành vách ngăn ngang còn đại đa số chỉ có vách ngăn để tách cơ quan sinh sản với sợi sinh dưỡng Hầu hết sinh sản vô tính bằng bào tử nội sinh, chỉ những loài sống ký sinh có bào tử vô tính ngoại sinh [1] Vách phía bên ngoài bào

tử tiếp hợp do vách túi giao tử biến thành Hầu hết sống hoại sinh, một số giống nấm tấn công nấm khác và trong một số trường hợp chúng tấn công lên cả thực vật

và động vật Trong Mucorales nguyên thủy, không yêu cầu vitamin hay nhân tố sinh trưởng nào, chúng có thể phát triển trong môi trường có nitơ, khoáng và một ít đường Trong lớp tiến hóa hơn như Pilobolus, sự tăng trưởng nhất thiết phải có sắc

tố sắt [16]

• Chu trình sống của nấm tiếp hợp:

Hình 1.1 Chu trình sống của nấm tiếp hợp Zygomycetes [16]

2.4.2 Tình hình nghiên cứu Zygomycetes

Zygomycetes phát triển rất nhanh [2], [15] Chúng ký sinh trên cả động vật,thực vật và người [7], [11], [15], [31].Chúng gây ra nhiều thiệt hại trong sản xuất nông nghiệp và chúng được biết đến như những tác nhân cơ hội gây ra bệnh nấm

Zygomycosis trên người và động vật [28], [31] Đó là bệnh truyền nhiễm nhanh, thường xuyên xuất hiện trong những vật chủ bị suy yếu hệ thống miễn dịch [20],

[11]

Zygomycetes ký sinh và gây bệnh thuộc bộ Mucorales và Entomophthorales Theo Wolf, J C và Smith, S A (1999), những giống thuộc bộ Mucorales thường

gặp bao gồm: Absidia, Mortierella, Rhizopus, Mucor và Rhizomucor [31]

Entomophthorales bao gồm các Basidiobolus và Conidiobolus sp [15], [31]

Tuy nhiên, hiện nay những nghiên cứu về bệnh Zygomycosis hầu hết trên người Theo Dannaoui E và CTV (2003) trên cơ thể người bệnh có tìm thấy các giống Rhizomucor, Cunninghamella, Apophysomyces và Saksenaea thuộc Zygomycetes nhưng tác nhân chủ yếu gây bệnh Zygomycois mà phân lập từ bất kỳ bệnh nhân nào bị bệnh đều có là nấm thuộc về các giống Rhizopus, Absidia và

Mortierella.Trong đó, Rhizopus là loài chiếm hơn 70% trong sự gây cảm nhiễm

Zygomycetes trên người [11]

Bệnh Zygomycosis gây ra hậu quả nghiêm trọng do việc phát hiện, chẩn đoán bệnh rất chậm cùng với khả năng kháng cố hữu của nấm Zygomycetes với những chất kháng nấm truyền thống [11] Do đó, song song với các nghiên cứu tìm tác nhân gây bệnh, là những nghiên cứu tìm ra hóa chất có tính kháng nấm được thực hiện Theo nghiên cứu của Dannaoui, E và CTV (2003) về độ nhạy của Zygomycetes với một số chất kháng nấm truyền thống và chất kháng nấm mới, cho kết quả: trong điều kiện thí nghiệm, Zygomycetes là nhóm không đồng nhất về khả năng nhạy cảm với các chất kháng nấm và cũng chỉ có một số chất kháng nấm có hiệu quả , trong đó Amphotericin B là chất có hiệu quả nhất đối với các chủng Zygomycetes được nghiên cứu [15] Chamilos, G và ctv (2006) đã nghiên cứu hiệu quả kháng nấm của lovastatin (LOV) và đã kết luận Lovastatin là chất có hiệu quả kháng nấm Zygomycetes rất tốt ở nồng độ tối thiểu là 48 µg/mL, do Lovastatin có hoạt chất với tên khoa học là 3-hydroxy-3-methyglutaryl-coenzymA có tác dụng chống lại nấm Zygomycetes, nhưng mới chỉ bước đầu được nghiên cứu [11]

Trên động vật, bệnh do zygomycetes rất ít được nghiên cứu Các zygomycetes thường được tìm thấy trên da, lông của chó, mèo khỏe nhưng ít khi gây bệnh Chỉ những năm gần đây mới có báo cáo về bệnh Zygomycosis trên bò với tác nhân là

Absidia corymbifera, Rhizopus oryzae và Rhizopus pusillus (Jensen và CTV, 1994)

ở Việt Nam

PHẦN 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian, đối tượng và địa điểm nghiên cứu

• Thời gian: Đề tài được thực hiện từ 28/7/2008 đến 01/11/2008

• Đối tượng: Nấm trên trứng cá nàng hai (Chilata onata Gray, 1813)

• Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bệnh học thủy sản, trường Đại học Nha Trang

3.2 Sơ đồ khối nghiên cứu của đề tài

Hình 3.1 Sơ đồ khối của đề tài

Ảnh hưởng của một số hóa chất lên

sự sinh trưởng của

hệ sợi nấm

Thu mẫu trứng cá có dấu hiệu nhiễm nấm

Phát hiện nấm dưới kính hiển vi

Nuôi cấy phân lập nấm

Nuôi cấy thuần nấm

Phân lập nấm

Ảnh hưởng của pH

lên sự sinh trưởng

của hệ sợi nấm

Kết luận và đề xuất ý kiến

Ảnh hưởng của nhiệt

độ và NaCl lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm

3.3 Thiết bị, hóa chất và môi trường nuôi cấy:

− Hộp lồng, ống nghiệm, bình nón được hấp tiệt trùng ở 180oC Đèn cồn, que

cấy, trang cấy, lam, lamen

− Hydrogen peroxide (oxy già)

3.3.3 Môi trường nuôi cấy nấm:

Sử dụng 2 loại môi trường tổng hợp bán ngoài thị trường là Sabouraud Dextrose Broth và Sabouraud Dextrose Agar (SDA) để nuôi cấy nấm

Cách đổ môi trường:

- Cân một lượng môi trường SDA cần thiết theo đúng hướng dẫn trên lọ

- Cho môi trường vào bình nón chịu nhiệt, thêm một lượng nước cất thích hợp

- Cho lên máy khuấy từ đến khi môi trường tan hết

- Cho vào máy hấp tiệt trùng để hấp tiệt trùng môi trường (ở 121oC)

- Để môi trường nguội 50 - 55oC , thêm kháng sinh (Ampicilin và Streptomycin 500 µg/L mỗi loại hoặc Ciprofloxacin 500 µg/L), khuấy tan kháng sinh, rồi đổ môi trường ra hộp lồng (20mL/đĩa)

- Bảo quản môi trường trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4-5oC

Riêng đối với môi trường thí nghiệm nồng độ NaCl thì cân muối cho vào pha môi trường theo nồng độ thí nghiệm

Môi trường trong thí nghiệm pH thì chỉ số pH được điều chỉnh bằng giấy quỳ tím

3.4 Phương pháp phân lập nấm ký sinh trên trứng cá nàng hai

3.4.1 Phương pháp thu mẫu

− Địa điểm: Trại thực nghiệm nuôi cá nước ngọt Ninh Phụng- trường Đại học

Nha Trang

− Mẫu: Trong bể ấp trứng cá lựa ra những trứng màu trắng đục, có những sợi bông trắng bao quanh, không nhầy, trứng không nở được Đem tất cả trứng vừa thu được cho vào bịch bóng chứa khoảng 300ml nước sạch Mẫu được chuyển về phòng thí nghiệm Bệnh học thủy sản, trường Đại học Nha Trang để kiểm tra và phân lập

nấm

3.4.2 Phương pháp phân lập nấm

Sử dụng phương pháp phân lập nấm gây bệnh ở động vật thủy sản và định danh nấm dựa vào khóa phân loại của Alexopoulos (1962) và J.A.Von ARX (1974) Nuôi cấy nấm theo hai dạng: nuôi cấy phân lập và nuôi cấy thuần (hình 3.2)

Nuôi cấy phân lập trên môi trường Sabouraud Dextrose Agar (SDA): Trứng bị nhiễm nấm được nuôi cấy trên môi trường SDA nhằm làm tăng số lượng khuẩn ty của nấm có mặt trên mẫu bệnh phẩm Môi trường nuôi cấy có pha thêm hai loại kháng sinh là streptomycin và ampicillin với nồng độ 500 ppm, hoặc Ciprofloxacin

500 ppm Sau khi cấy môi trường được đặt ở nhiệt độ phòng

Nuôi cấy thuần trên môi trường SDA: Các khuẩn lạc của nấm được chuyển sang môi trường nuôi mới để nuôi cấy thuần Môi trường nuôi cấy giống như môi trường nuôi cấy phân lập

3.4.3 Phương pháp định danh tên nấm

Để quan sát hình dạng, nấm được nuôi cấy trong môi trường Sabouraud broth

và giữ ở nhiệt độ phòng Sau 12-24h, lấy nấm ra quan sát sự hình thành cơ quan sinh sản vô tính

Các khuẩn lạc nhỏ của nấm sau khi nuôi cấy 24 được rửa qua nước cất và cho vào đĩa petri chứa nước cất để quan sát sự phóng túi báo tử, bào tử, và sự hình thành

cơ quan sinh sản hữu tính

Lấy các khuẩn lạc nấm đã nuôi cấy thuần trong 4-5 ngày quan sát Cho những đĩa khuẩn lạc nấm này vào tủ lạnh trong 24h và cho vào tủ ấm giữ ở 40oC trong 24

h lấy ra quan sát

Để quan sát sự nảy mầm của bào tử, lọc bào tử bằng lưới lọc và giấy lọc, rồi cho bào tử vào môi trường Sabouraud broth và quan sát sau mỗi 30 phút Tên nấm được xác định dựa vào hình dạng cơ quan sinh sản vô tính, kiểu giải phóng bào tử,

cơ quan sinh sản hữu tính và các đặc điểm hình thái của chúng

Hình 3.2 Mô hình phân lập và phân loại nấm từ trứng cá nhiễm nấm

Thu mẫu trứng bị nhiễm nấm

Phát hiện nấm dưới kính hiển vi

Nuôi cấy phân lập trên môi trường SA

Nuôi cấy thuần trên môi trường SA

Nuôi cấy nấm trong nước cất Nuôi cấy nấm trong môi trường Sabouraud broth

Quan sát đặc điểm hình thái nấm

Xác định tên và vị trí phân loại nấm

3.5 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của

hệ sợi nấm trong điều kiện thí nghiệm

Nấm thuần chủng được nuôi cấy ở môi trường Sabouraud agar ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày để tạo thành những khuẩn lạc lớn Cắt môi trường thạch có chứa khuẩn lạc thành những lát tròn có đường kính 5 mm từ viền của các khuẩn lạc đặt vào những hộp lồng có chứa môi trường Sabouraud agar đã được điều chỉnh pH

ở các mức 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5 Nuôi cấy nấm ở nhiệt độ phòng Theo dõi sự phát triển của nấm bằng cách đo đường kính khuẩn lạc sau mỗi12h trong vòng 2 ngày Lặp lại thí nghiệm 3 lần

3.6 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và độ mặn lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm trong điều kiện thí nghiệm

Nấm thuần chủng được nuôi cấy ở môi trường Sabouraud agar ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày để tạo những khuẩn lạc lớn Cắt môi trường thạch có chứa khuẩn lạc thành những lát tròn có đường kính 5mm từ viền của các khuẩn lạc đặt vào những hộp lồng có chứa môi trường Sabouraud agar đã được điều chỉnh độ mặn

ở các mức 0, 3 và 6 ppt Nuôi cấy ở các mức nhiệt độ 20, 25 và 30oC Theo dõi sự phát triển của nấm bằng cách đo đường kính khuẩn lạc hàng ngày trong vòng 1÷2ngày Lặp lại thí nghiệm 3 lần Bố trí nghiệm thức sau:

Dùng 4 loại hóa chất có nồng độ như sau:

+Milian ( thành phần là Methylen blue và Gentian violet): 10, 40, 70, 100

(ppm)