3.3.1 Thiết bị: − Kính hiển vi quang điện với các vật kính 4X, 10X, 40X, 100X. − Tủ lạnh − Tủấm − Tủ sấy − Máy hấp tiệt trùng − Cân điện có độ chính xác 0,1g − Máy khuấy từ
− Hộp lồng, ống nghiệm, bình nón được hấp tiệt trùng ở 180oC. Đèn cồn, que cấy, trang cấy, lam, lamen.
3.3.2 Hóa chất cần thiết
Các hóa chất phòng và trị nấm: − Milian
− Nystatin − Atorvastatin
− Hydrogen peroxide (oxy già)
3.3.3 Môi trường nuôi cấy nấm:
Sử dụng 2 loại môi trường tổng hợp bán ngoài thị trường là Sabouraud Dextrose Broth và Sabouraud Dextrose Agar (SDA) để nuôi cấy nấm.
Cách đổ môi trường:
- Cân một lượng môi trường SDA cần thiết theo đúng hướng dẫn trên lọ. - Cho môi trường vào bình nón chịu nhiệt, thêm một lượng nước cất thích hợp. - Cho lên máy khuấy từđến khi môi trường tan hết.
- Cho vào máy hấp tiệt trùng để hấp tiệt trùng môi trường (ở 121oC)
- Để môi trường nguội 50 - 55oC , thêm kháng sinh (Ampicilin và Streptomycin 500 µg/L mỗi loại hoặc Ciprofloxacin 500 µg/L), khuấy tan kháng sinh, rồi đổ môi trường ra hộp lồng (20mL/đĩa)
Riêng đối với môi trường thí nghiệm nồng độ NaCl thì cân muối cho vào pha môi trường theo nồng độ thí nghiệm.
Môi trường trong thí nghiệm pH thì chỉ số pH được điều chỉnh bằng giấy quỳ tím.
3.4 Phương pháp phân lập nấm ký sinh trên trứng cá nàng hai 3.4.1 Phương phápthu mẫu 3.4.1 Phương phápthu mẫu
−Địa điểm: Trại thực nghiệm nuôi cá nước ngọt Ninh Phụng- trường Đại học Nha Trang.
−Mẫu: Trong bể ấp trứng cá lựa ra những trứng màu trắng đục, có những sợi bông trắng bao quanh, không nhầy, trứng không nởđược. Đem tất cả trứng vừa thu được cho vào bịch bóng chứa khoảng 300ml nước sạch. Mẫu được chuyển về phòng thí nghiệm Bệnh học thủy sản, trường Đại học Nha Trang để kiểm tra và phân lập nấm.
3.4.2 Phương pháp phân lập nấm
Sử dụng phương pháp phân lập nấm gây bệnh ở động vật thủy sản và định danh nấm dựa vào khóa phân loại của Alexopoulos (1962) và J.A.Von ARX (1974). Nuôi cấy nấm theo hai dạng: nuôi cấy phân lập và nuôi cấy thuần (hình 3.2)
Nuôi cấy phân lập trên môi trường Sabouraud Dextrose Agar (SDA): Trứng bị nhiễm nấm được nuôi cấy trên môi trường SDA nhằm làm tăng số lượng khuẩn ty của nấm có mặt trên mẫu bệnh phẩm. Môi trường nuôi cấy có pha thêm hai loại kháng sinh là streptomycin và ampicillin với nồng độ 500 ppm, hoặc Ciprofloxacin 500 ppm. Sau khi cấy môi trường được đặt ở nhiệt độ phòng.
Nuôi cấy thuần trên môi trường SDA: Các khuẩn lạc của nấm được chuyển sang môi trường nuôi mới để nuôi cấy thuần. Môi trường nuôi cấy giống như môi trường nuôi cấy phân lập.
3.4.3 Phương pháp định danh tên nấm
Để quan sát hình dạng, nấm được nuôi cấy trong môi trường Sabouraud broth và giữ ở nhiệt độ phòng. Sau 12-24h, lấy nấm ra quan sát sự hình thành cơ quan sinh sản vô tính.
Các khuẩn lạc nhỏ của nấm sau khi nuôi cấy 24 được rửa qua nước cất và cho vào đĩa petri chứa nước cất để quan sát sự phóng túi báo tử, bào tử, và sự hình thành cơ quan sinh sản hữu tính.
Lấy các khuẩn lạc nấm đã nuôi cấy thuần trong 4-5 ngày quan sát. Cho những đĩa khuẩn lạc nấm này vào tủ lạnh trong 24h và cho vào tủ ấm giữở 40oC trong 24 h lấy ra quan sát.
Để quan sát sự nảy mầm của bào tử, lọc bào tử bằng lưới lọc và giấy lọc, rồi cho bào tử vào môi trường Sabouraud broth và quan sát sau mỗi 30 phút. Tên nấm được xác định dựa vào hình dạng cơ quan sinh sản vô tính, kiểu giải phóng bào tử, cơ quan sinh sản hữu tính và các đặc điểm hình thái của chúng.
Hình 3.2 Mô hình phân lập và phân loại nấm từ trứng cá nhiễm nấm. Thu mẫu trứng bị nhiễm nấm
Phát hiện nấm dưới kính hiển vi
Nuôi cấy phân lập trên môi trường SA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nuôi cấy thuần trên môi trường SA
Nuôi cấy nấm trong nước cất Nuôi cấy nấm trong môi trường Sabouraud broth
Quan sát đặc điểm hình thái nấm
3.5 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm trong điều kiện thí nghiệm hệ sợi nấm trong điều kiện thí nghiệm
Nấm thuần chủng được nuôi cấy ở môi trường Sabouraud agar ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày để tạo thành những khuẩn lạc lớn. Cắt môi trường thạch có chứa khuẩn lạc thành những lát tròn có đường kính 5 mm từ viền của các khuẩn lạc đặt vào những hộp lồng có chứa môi trường Sabouraud agar đã được điều chỉnh pH ở các mức 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5. Nuôi cấy nấm ở nhiệt độ phòng. Theo dõi sự phát triển của nấm bằng cách đo đường kính khuẩn lạc sau mỗi12h trong vòng 2 ngày. Lặp lại thí nghiệm 3 lần.
3.6 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và độ mặn lên sự
sinh trưởng của hệ sợi nấm trong điều kiện thí nghiệm
Nấm thuần chủng được nuôi cấy ở môi trường Sabouraud agar ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày để tạo những khuẩn lạc lớn. Cắt môi trường thạch có chứa khuẩn lạc thành những lát tròn có đường kính 5mm từ viền của các khuẩn lạc đặt vào những hộp lồng có chứa môi trường Sabouraud agar đã được điều chỉnh độ mặn ở các mức 0, 3 và 6 ppt . Nuôi cấy ở các mức nhiệt độ 20, 25 và 30oC. Theo dõi sự phát triển của nấm bằng cách đo đường kính khuẩn lạc hàng ngày trong vòng 1÷2ngày. Lặp lại thí nghiệm 3 lần. Bố trí nghiệm thức sau:
Độ mặn (‰) Nhiệt độ (oC)
20 25 30
0 NT 0-20 NT 0-25 NT 0-30
3 NT 3-20 NT 3-25 NT 3-30
6 NT 6-20 NT 6-25 NT 6-30
3.7 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của một số hóa chất lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm trong điều kiện thí nghiệm
Với mục đích tìm ra một số chất có hiệu quả kìm hãm, tiêu diệt nấm, thí nghiệm được bố trí như sau:
Dùng 4 loại hóa chất có nồng độ như sau:
+Milian ( thành phần là Methylen blue và Gentian violet): 10, 40, 70, 100 (ppm)
+ Nistatin : 1, 4, 7, 10 (ppm)
+ Atorvastatin: 25, 50, 75, 100 (ppm)
+ Hydrogen peroxyde (H2O 2) : 250, 500, 750, 1000 (ppm)
Nấm thuần chủng được nuôi cấy ở môi trường Sabouraud agar ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày để tạo những khuẩn lạc lớn. Cắt môi trường thạch có chứa khuẩn lạc thành những lát tròn có đường kính 5mm từ viền của các khuẩn lạc, ngâm vào các dung dịch hóa chất đã pha nồng độ trong 60 phút. Sau đó, lấy khuẩn lạc đó đặt vào những hộp lồng có chứa môi trường SDA. Đặt tất cảở nhiệt độ 20oC.Theo dõi sự phát triển của nấm bằng cách đo đường kính khuẩn lạc hàng ngày trong vòng 1÷3 ngày.
3.8 Phương pháp xử lý số liệu
Toàn bộ số liệu thu được ở các thí nghiệm đều được xử lý trên phần mềm SPSS 15.0 for window. Sử dụng phân tích phương sai hai yếu tố để đánh giá tác động của nhiệt độ và độ mặn lên sự phát triển của sợi nấm. Phân tích phương sai một yếu tố để đánh giá tác động của pH lên sự phát triển của sợi nấm và đánh giá hiệu quả kháng nấm của hóa chất.
Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả phân lập nấm từ trứng cá nàng hai nhiễm nấm:
Trong thời gian nghiên cứu, mẫu trứng bị nhiễm nấm trong bểấp được thu để phân lập nấm gây bệnh. Trứng được thu là những trứng có màu trắng đục, có những sợi bông trắng xung quanh, không nhầy, trứng không nởđược.
Hình 4.1Trứng cá nàng hai bị nhiễm nấm
Khi quan sát tiêu bản tươi của các trứng thu mẫu, thấy xuất hiện nhiều sợi nấm không có vách ngăn, ăn sâu vào màng trứng và bao phủ cả bề mặt trứng. Quan sát thấy sợi nấm mập mạp, không có vách ngăn, phân nhánh, có một ít túi bào tử tròn.
Từ mẫu trứng nhiễm nấm cấy trên môi trường SDA đã phân lập được một loài nấm có đặc điểm như sau:
Khuẩn lạc: màu trắng. Nấm phát triển rất nhanh, chỉ sau 24 h, ở 30oC đường kính khuẩn lạc là 38 mm và sau 64 h khuẩn lạc là 87 mm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khuẩn ty: không vách ngăn, mập mạp, bề rộng đạt 3 ÷ 6 µm, phân nhánh mạnh, màu trắng. Sợi nấm dài, sợi nấm phát triển lên cao (sợi khí sinh), chỉ sau 24h sợi nấm phát triển cao lên đầy nắp hộp lồng.
Nấm sinh sản bằng hai hình thức:
Sinh sản hữu tính: Bằng hình thức tiếp hợp giữa hai sợi nấm để hình thành bào tử tiếp hợp (hình 4.4, hình 4.5 và hình 4.6). Đây là đặc điểm để chúng tôi xếp nấm phân lập được vào lớp Zygomycetes.
Sinh sản vô tính: Bằng túi bào tử (sporangia) bên trong có chứa bào tử bất động (Aplanospores). Đây là căn cứ để chúng tôi xếp nấm này vào họ Mucorales. Và với đặc điểm không có sợi bò, không có rễ giả, phần cuối của túi bào tử không có mẩu và ở mỗi túi bào tử nhỏ (sporangiola) chứa từ 10-20 bào tử bất động nên chúng tôi cho rằng đây là nấm tiếp hợp thuộc giống Helicostylum.
-Bào tử bất động hình tròn (với đường kính 1÷2 µm) hoặc hình bầu dục (với kích thước 1÷2 µm x 2 ÷ 3 µm). Túi bào tử hình tròn hay hình quả lê, có gai hoặc không có gai có kích thước lần lượt là: từ 6 ÷ 12 µm, hoặc 6 ÷ 10 µm x 10 ÷12 µm.
Các túi bào tử nhỏ được nâng khỏi sợi nấm nhờ một cuống gọi là cuống bào tử. Cuống này mọc trên một bọng phình to gọi là trụ nang, có dạng dạng hình quả lê hay hình cầu méo, ởđầu mỗi sợi nấm hay đầu của mỗi nhánh sợi nấm. Trụ nang có kích thước 8 ÷14 µm x 12 ÷16 µm.
Cơ quan sinh sản vô tính được hình thành sau khoảng 12h nuôi cấy trên môi trường SDA. Các nang bào tử bắt đầu giải phóng khỏi cuống bào tử sau 12h. Sau 72 h quan sát trên khuẩn lạc thấy xuất hiện các bào tử bất động nhưng số lượng ít.
Các bào tử bất động được giải phóng khỏi các túi bào tử nhỏ bằng cách: các túi bào tử vỡ ra giải phóng các bào tử nội sinh..
− Ngoài ra, nấm này còn sinh sản vô tính bằng bào tử lớn, Bào tử này có gai hoặc không có gai, hình tròn với kích thước lớn hơn nhiều bào tử bất động ( đường kính bào tử lớn 6 ÷10 µm). Các bào tử lớn này có thể mọc ởđầu hoặc giữa sợi nấm đơn độc. Trong điều kiện thường cũng có xuất hiện bào tử lớn này nhưng với số lượng ít. Khi nâng nhiệt độ lên cao khoảng 40oC thì bào tử lớn có gai xuất hiện rất nhiều.
Sau khi cho vào trong môi trường Sabouraud brouth sau khoảng 3 h thì bào tử bắt đầu mọc mầm.
Hình 4.2 Khuẩn lạc nấm trong môi trường SDA
Hình 4.4 Cơ quan sinh sản hữu tính giai
đoạn còn non (100X)
Hình 4.5 Cơ quan sinh sản hữu tính sau khi tiếp hợp (100X)
Hình 4.7 Cuống túi bào tử và túi bào tử
không có gai (100X)
Hình 4.8 Cuống túi bào tử và túi bào tử
có gai (100X)
Hình 4.9 Túi bào tử giải phóng bào tử nhỏ
(100X)
Hình 4.10 Bào tử lớn có gai và bào tử nhỏ
(100X)
Hình 4.11 Bào tử lớn không có gai và bào tử
nhỏ (100X) Hình 4.12 Bào t
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 0h 12h 24h 36h 48h Thời gian (h) Đ ư ờ ng k ín h kh u ẩ n l ạ c (m m ) pH 5 pH 5,5 pH 6 pH 6,5 pH 7 pH 7,5 pH 8 pH 8,5
4.2 Tác động của pH lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm:
Kết quả thí nghiệm cho thấy pH có ảnh hưởng rõ rệt đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Helicostylum sp (p<0,001). Hệ sợi nấm có khả năng sinh trưởng trong khoảng pH5,5-pH8,5 (bảng 4.1 và hình 4.12) nhưng ở môi trường hơi axit (pH từ 5,5-6,5) nấm sinh trưởng nhanh hơn (p<0,001).
Bảng 4.1: Đường kính khuẩn lạc nấm sau 48 h nuôi cấy ở các môi trường SDA có chỉ số pH khác nhau. Số liệu hiển thị là TB ± SD. Trên cùng một cột, các chữ cái khác nhau biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê của các giá trị từ pH5,5- pH8,5 (p<0,002)
Đường kính (mm) khuẩn lạc sau pH 0 h 12 h 24 h 36 h 48 h 5 5 5 5 5 5 5,5 5 17,67±0,58b 36,67±1.15b 59,00±1.00b 73,33±0.58b 6 5 19,33±0.58a 38,33±0.58a 60,67±0.58a 77,00±0.00a 6,5 5 17,33±0.58b 36,33±0.58b 57,33±0.58b 72,00±1.00b 7 5 16,33±0.58bc 36,33±0.58 b 57,33±0.58 b 72,33±0.58 b 7,5 5 15,67±0.58c 35,00±0.00c 54,33±0.58c 68,33±0.58c 8 5 11,00±0.00d 24,33±0.58d 40,00±1.00d 55,67±1.15d 8,5 5 9,33±0.58e 22,67±1.15e 36,67±1.15e 50,67±1.15e
Hình 4.13 Đường kính khuẩn lạc nấm sau 48 h nuôi cấy ở các môi trường SDA có chỉ số pH khác nhau. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong điều kiện thí nghiệm, hệ sợi nấm có khả năng sinh trưởng tốt nhất ở pH6 (p< 0,001), khuẩn lạc nấm đạt đường kính 60,25 mm sau 36 h trong khi tại pH 8,5 chỉđạt đường kính 37,82 mm và 51,82 mm sau 36 h và 48 h.
Ở môi trường pH5,5 hệ sợi nấm sinh trưởng chậm hơn pH6 (p=0,001), ở pH5 nấm không sinh trưởng và sự sinh trưởng của hệ sợi nấm giảm dần khi pH tăng từ 6-8,5 (p<0,001).
Khoảng pH tối thích cho sự phát triển của hệ sợi nấm được phân lập này cũng giống với khoảng pH tối thích cho sự phát triển của hệ sợi một số loài Saprolegnia cũng phân lập từ trứng và cá đã được nghiên cứu. Chúng đều phát triển tốt trong môi trường hơi axit như: Saprolegnia diclina pH thích hợp từ 5,0-6,8 (Chong, 1973), S. parasitica pH thích hợp ở 5,5-8,0 (W.N.Tiffney, 1963) [9].
Như vậy, kết quả nghiên cứu cho thấy, nấm Helicostylum sp sinh trưởng tốt nhất ở môi trường pH6, và giảm khi pH giảm xuống đến 5,5 và khi pH của môi trường nuôi cấy tăng dần đến 8,5. Mặc dù vậy ở môi trường có pH 5,5 và pH 8,5 nấm vẫn còn phát triển rất mạnh. Trong khi cá nàng hai có ngưỡng pH phát triển thích hợp là 5,5-8,5 [4], [5], [6]. Do đó, không thể kiểm soát sự phát triển của nấm bằng việc điều chỉnh chỉ số pH môi trường nuôi.
4.3 Tác động của nhiệt độ và NaCl lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm 4.3.1.Tác động của nhiệt độ 4.3.1.Tác động của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng mạnh đến sự phát triển của hệ sợi nấm phân lập từ trứng cá nàng hai (p< 0,001) (bảng 4.2 và hình 4.13)
Bảng 4.2: Đường kính khuẩn lạc của nấm nuôi cấy ở các mức nhiệt độ khác nhau sau 48 h. Số liệu hiển thị là TB±SD. Trên cùng một hàng, các chữ cái khác nhau biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê của các giá trị (p<0,001).
Đường kính (mm) khuẩn lạc nấm ở môi trường có nhiệt độ Thời gian nuôi
cấy (h) 20oC 25 oC 30 oC
24 h 19.89 ± 2.80 a 24.94±2.74b 33.61± 3.91c
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 20 25 30Nhiệt độ (oC) Đ ư ờ n g k ín h k h u ẩ n l ạ c ( m m ) a 40,16 b 53,00
Hình 4.14 Đường kính khuẩn lạc nấm nuôi cấy 48h ở các mức nhiệt độ khác nhau. Số liệu hiển thị là TB ±SD. Các chữ cái biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa các giá trị (p<0,001).
Hệ sợi nấm phân lập có khả năng sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ 20-30oC (p< 0,001). Trong ba mức nhiệt độ 20, 25, 30 oC thì nấm sinh trưởng tốt nhất ở 30oC, khuẩn lạc nấm đạt đường kính 66,11mm sau 48 h nuôi cấy, và có xu hướng giảm dần khi nhiệt độ giảm đến 20oC (p<0,001).
So sánh với kết quả nghiên cứu của hầu hết các loài nấm phân lập trên trứng và cá khác như nghiên cứu của Koeypudsa, W. và ctv (2005), Saprolegnia phân lập trên trứng cá hồi có khả năng phát triển từ 5- 30oC, nhưng phát triển tốt nhất ở 18- 25oC [26]; vùng nhiệt độ thích hợp cho Saprolegnia sp theo Powell & ctv (1972) là 18-30 oC, Saprolegnia diclina là 20-28oC (Chong, 1973); Nguyễn Thị Huyền (2006)
Achlya sp phân lập từ trứng cá tra, cá ba sa nhiệt độ tối ưu là 25oC [9] thì loài nấm