2.2.2.1.Phương pháp phân lập tế bào gốc từ đĩa phôi giai đoạn X
cESCs được phân lập từ đĩa phôi giai đoạn X theo phương pháp của Horiuchi
và cộng sự [32]:
Chuẩn bị giấy tách phôi từ giấy lọc với đường kính trong 0,5 cm, đường kính
ngoài 1,0 cm.
Khử trùng vỏ trứng bằng cồn 70o.
Dùng kéo cắt lớp vỏ đá vôi ở đầu to của quả trứng, tách bỏ phần lòng trắng.
Đưa khối noãn hoàng vào đĩa petri, di chuyển đĩa sao cho phôi nằm ở mặt trên. Đặt giấy tách phôi lên sao cho bao quanh đĩa phôi.
Dùng kéo cắt quanh viền giấy, tách lấy phôi và chuyển sang đĩa petri có chứa nước muối sinh lý.
Huyền phù hóa tế bào bằng 2 ml môi trường nuôi cấy (thành phần được trình bày trong Bảng 7), chuyển vào đĩa 35mm đã phủ gelatin (6–8 phôi/đĩa).
Nuôi cấy trong tủ ấm 37oC, 5% CO2, độ ẩm 90%.
Kiểm tra và thay môi trường cho tế bào 24 giờ sau khi phân lập.
Bảng 7. Thành phần môi trường nuôi cấy cESCs
Tên hóa chất Nồng độ
Fetal bovine serum 10% (v/v)
Leukemia inhibitor factor 2000 U/ml
Huyết thanh gà 1% (v/v)
Non–essential amino acid 100 μM
β–mercaptoethanol 100 μM
Sodium pyruvate 1 mM
Sodium bicarbonate 45 mM
Penicillin 100 U/ml
Streptomycin 100 μg/ml
Opti–MEM® Thêm đếnđủ lượng cần pha
2.2.2.2.Phương pháp chuyển gen vào tế bào gốc phôi gà
Khi tế bào sinh trưởng đạt khoảng 80–90% bề mặt đĩa nuôi cấy thì có thể tiến
hành chuyển gen.
Lấy đĩa tế bào ra khỏi tủ nuôi cấy, vệ sinh đĩa bằng cồn 70o. Loại bỏ môi trường nuôi cấy, rửa bằng PBS.
Thêm 0,5 ml Trypsin/EDTA 0,25% vào mỗi đĩa, ủ ở 37oC trong 5 phút. Bất hoạt trypsin bằng 1ml môi trường Opti–MEM® + 5% FBS.
Ly tâm ở 200 g trong 10 phút.
Đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu, pha loãng bằng Opti–MEM® sao cho đạt
nồng độ 0,5x106 tế bào/ml.
Chuyển huyền phù tế bào sang các ống ly tâm 15 ml (1 ml/ống).
Thêm 107 hạt virus vào mỗi ống (trung bình 20 virus/tế bào). Ủ ở 37oC trong 15 phút.
Ly tâm 800 g trong 30 phút. Loại bỏ hoàn toàn dịch nổi.
Huyền phù hóa tế bào lắng đáy bằng 2ml môi trường nuôi cấy.
Chuyển huyền phù vào đĩa nuôi cấy 35 mm chứa sẵn lớp tế bào nuôi, nuôi ở tủ
37oC, 5% CO2.
Tiến hành thay môi trường sau 24 giờ kể từ khi chuyển gen bằng virus. Những
ngày tiếp theo thay môi trường 2 ngày/lần.
2.2.2.3.Phương pháp cấy chuyển tế bào gốc phôi gà
Khi tế bào sinh trưởng đạt khoảng 80–90% bề mặt đĩa nuôi cấy thì có thể tiến
hành cấy chuyển.
Lấy đĩa tế bào ra khỏi tủ nuôi cấy, vệ sinh đĩa bằng cồn 70o. Loại bỏ môi trường nuôi cấy, rửa bằng PBS.
Thêm 0,5ml Trypsin/EDTA 0,25% vào mỗi đĩa nuôi cấy, ủ ở 37oC trong 5 phút. Bất hoạt trypsin bằng 1ml môi trường Opti–MEM® + 5% FBS.
Ly tâm ở 200 g trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi.
Huyền phù hóa tế bào ở đáy bằng 4ml môi trường nuôi cấy.
Chia đều huyền phù vào hai đĩa nuôi cấy mới chứa sẵn lớp tế bào nuôi, nuôi ở tủ
37oC, 5% CO2.
2.2.2.4.Phương pháp kiểm tra sự có mặt gen chuyển trong tế bào
cESCs sau chuyểngen được phân tích PCR nhằm kiểm tra sự có mặt của gen
chuyển trong tế bào. Cặp mồi IL6–F và IL6–R đã thiết kế ở trên được sử dụng để
trong gen ribosome 18S (18S–For: GTC GGC GTC CAA CTT CTT; 18S–Rev: CGA TCC GAG GAC CTC ACT) cũng được sử dụng làm chứng nội. Các bước
thực hiện như sau:
Thu tế bào cần phân tích, tách ADN hệ gen bằng bộ sản phẩm DNA IsolationKit for Cells and Tissues (Roche) theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.
Thành phần phản ứng PCR được trình bày trong Bảng 8.
Bảng 8. Thành phẩn phản ứng PCR phát hiện gen chuyển trong tế bào
Thành phần
Nồng độ
Nhân gen 18S Nhân gen IL–6
dATP, dTTP, dCTP, dGTP 0,25 mM 0,25 mM MgCl2 3 mM 3 mM 18S–For primer 0,5 mM 18S–Rev primer 0,5 mM IL6–F primer 0,5 mM IL6–R primer 0,5 mM
Taq DNA polymerase 0,1 U/µl 0,1 U/µl
PCR buffer 1 X 1 X
Khuôn tổng hợp 2 ng/µl 2 ng/µl
Chu kỳ nhiệt: 94oC trong 7 phút trước chu kỳ đầu tiên
35 chu kỳ
biến tính 94oC trong 30 giây
gắn mồi ở nhiệt độ tối ưu trong 30 giây tổng hợp 72oC trong 30 giây 72oC trong 7 phút sau chu kỳ cuối cùng
Nhuộm bản gel điện di bằng Ethidium bromide 10 g/ml trong 10 phút, tráng
nước rồi quan sát và chụp ảnh, phân tích kết quả.