Gà Lương Phượng (Gallus gallus domesticus)
Đối tượng được sử dụng trong nghiên cứu này là gà Lương Phượng Gallus gallus domesticusđược cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu Gia cầm Thụy Phương,
Viện Chăn nuôi Quốc gia. Trứng gà Lương Phượng là nguồn nguyên liệu được sử
dụng để phân lập tế bào gốc phôi gà (chicken Embryonic Stem Cells – cESCs).
Nguyên bào sợi thai chuột
cESCs có thể duy trì in vitro trong thời gian dài mà vẫn giữ được đặc tính đa
tiềm năng với sự có mặt của lớp tế bào nuôi (feeder cells), những tế bào này vừa là giá thể, đồng thời cung cấp các nhân tố tăng trưởng giúp cESCs tăng sinh không
biệt hóa. Chúng tôi sử dụng nguyên bào sợi thai chuộtđã bất hoạt phân bào làm tế
bào nuôi cESCs. Dòng tế bào này là sản phẩm của đề tài cấp Đại học Quốc gia Hà Nội “Đánh giá hiệu quả chuyển gen cecropin của vector chuyển gen transposon trên dòng tế bào chuột nuôi cấy (Mus Musculus)”, mã số QG 09.18.
Gen mã hóa Interleukin – 6 (IL–6) phân lập từ người
Trong nghiên cứu này, gen IL – 6 ngườiđược chuyển vào cESCs. cADN của
gen có kích thước 639 bp với trình tự như sau:
1– 51– 101– 151– 201– 251– 301– 351–
ATGAACTCCT TCTCCACAAG CGCCTTCGGT CCAGTTGCCT TCTCCCTGGG GCTGCTCCTG GTGTTGCCTG CTGCCTTCCC TGCCCCAGTA CCCCCAGGAG AAGATTCCAA AGATGTAGCC GCCCCACACA GACAGCCACT CACCTCTTCA GAACGAATTG ACAAACAAAT TCGGTACATC CTCGACGGCA TCTCAGCCCT GAGAAAGGAG ACATGTAACA AGAGTAACAT GTGTGAAAGC AGCAAAGAGG CACTGGCAGA AAACAACCTG AACCTTCCAA AGATGGCTGA AAAAGATGGA TGCTTCCAAT CTGGATTCAA TGAGGAGACT TGCCTGGTGA AAATCATCAC TGGTCTTTTG GAGTTTGAGG TATACCTAGA GTACCTCCAG AACAGATTTG
– 50 –100 –150 –200 –250 –300 –350 –400
401– 451– 501– 551– 601–
AGAGTAGTGA GGAACAAGCC AGAGCTGTGC AGATGAGTAC AAAAGTCCTG ATCCAGTTCC TGCAGAAAAA GGCAAAGAAT CTAGATGCAA TAACCACCCC TGACCCAACC ACAAATGCCA GCCTGCTGAC GAAGCTGCAG GCACAGAACC AGTGGCTGCA GGACATGACA ACTCATCTCA TTCTGCGCAG CTTTAAGGAG TTCCTGCAGT CCAGCCTGAG GGCTCTTCGG CAAATGTTG
–450 –500 –550 –600
Vector chuyển gen
Vector được sử dụng để chuyển gen là pLenti6/V5–DEST (có nguồn gốc
lentivirus), trong đó gen IL–6 người cùng trình tự dẫnđược đưa vào thay thế đoạn
ADN giữa hai vị trí attR1–attR2 trên vector gốc. Đây là sản phẩm của đề tài cấp nhà
nước “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ chuyển gen tạo ra động vật sản xuất protein dược liệu” (mã số KC.04.04/06–10). Vector cũng được sử dụng để tổng hợp đầu dò huỳnh quang cho phản ứng FISH.
Bảng 2. Vai trò của một số yếu tố chính của vector pLenti6/V5–DEST Gateway
Yếu tố (vị trí – base) Vai trò
– HIV–1 5’ LTR (230–410) – Cho phép đóng gói virus và phiên mã ngược
của mARN virus
– Tín hiệu đóng gói HIV–1 (521–565) – Tín hiệuđóng gói virus
– Yếu tố đáp ứng Rev HIV–1 (RRE) (1075–1308)
– Tín hiệu rời nhân phụ thuộc yếu tố Rev của mARN virus chưa ghép nối
– CMV promoter (1809–2392) – Cho phép biểu hiện gen quan tâm
– Trình tự attR1 và attR2 (2440– 2564, 4020–4144)
– Trình tự ADN tái tổ hợp từ thực khuẩn thể
cho phép nhân dòng tái tổ hợp của gen quan
tâm từ vector nhân dòng Gateway® – Gen kháng chloramphenicol
(CamR) (2673–3332)
– Cho phép sàng lọc số lượng plasmid
– Gen ccdB (3674–3979) – Cho phép lựa chọn âm tính plasmid
– V5 epitope (4197–4238) – Cho phép phát hiện protein dung hợp tái tổ
hợp bằng kháng thể kháng V5
– SV40 promoter và origin (4293–4602)
– Cho phép biểu hiện cao các điểm đánh dấu
lựa chọn và tái bản ngoài nhân trong tế bào biểu hiện mạnh kháng nguyên T lớn SV40
– Gen kháng blasticidin (blast) (4724–5122)
– Cho phép sàng lọc trên tế bào động vật có vú
– ΔU3/HIV–1 (5208–5261) và HIV–1 3’ LTR (5262–5442)
– Cho phép đóng gói virus nhưng tự bất hoạt
5’LTR cho các mục đích an toàn sinh học
– Tín hiệu polyadenyl hóa của SV40
(SV40 PA) (5514–5645)
– Tín hiệu chấm dứt phiên mã và gắn đuôi
polyadenin của mARN
– Gen kháng ampicillin (6603–7463) – Cho phép sàng lọc plasmid ở E. coli
– pBR322 origin (7608–8281) – Cho phép tái bản hiệu quả cao và duy trì ở E. coli