giáo trình mô đun pha chế chuẩn bị môi trường nghề vi nhân giống một số loại hoa

1 TUYÊN BỐ BẢN QUYỀN Tài liệu thuộc loại sách giáo trình nên nguồn thơng tin phép dùng nguyên trích dẫn dùng cho mục đích đào tạo tham khảo Mọi mục đích khác mang tính lệch lạc sử dụng với mục đích kinh doanh thiếu lành mạnh bị nghiêm cấm Mã tài liệu: MĐ 02 LỜI GIỚI THIỆU Pha chế dung dịch chuẩn bị môi trường bước quan trọng, ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm vi nhân giống hoa Modun Pha chế dung dịch chuẩn bị môi trường vi nhân giống nhằm trang bị cho học viên kiến thức kỹ bản: - Trình bày phương pháp xác định hóa chất, xác định danh mục hóa chất phù hợp trình bày phương pháp pha chế bảo quản dung dịch mẹ, môi trường vi nhân giống - Lựa chọn, pha chế bảo quản dung dịch, môi trường vi nhân giống hoa Để đạt mục tiêu mô đun, với thời lượng 90 tiết, nội dung biên soạn bao gồm 03 bài: - Bài 1: Xác định loại hóa chất dùng cho vi nhân giống - Bài 2: Pha chế bảo quản dung dịch mẹ - Bài 3: Pha chế bảo quản môi trường vi nhân giống Modun sở cho giáo viên soạn giảng để giảng dạy, tài liệu nghiên cứu học tập học viên học nghề “Vi nhân giống hoa” Các thơng tin modun có giá trị hướng dẫn giáo viên thiết kế tổ chức giảng dạy cách hợp lý Giáo viên vận dụng cho phù hợp với điều kiện bối cảnh thực tế trình dạy học Trong q trình biên soạn nội dung modun chắn khơng tránh khỏi sai sót, Ban chủ nhiệm tác giả mong nhận nhiều ý kiến đóng góp nhà khoa học, cán kỹ thuật, đồng nghiệp để modun hoàn thiện Xin chân thành cảm ơn! Tham gia biên soạn Trần Văn Dư - chủ biên Kiều Thị Thuyên Nguyễn Thị Thao Nguyễn Quang Thạch MỤC LỤC LỜI GIỚI THIỆU MỤC LỤC MÔ ĐUN: PHA CHẾ D.DỊCH VÀ CHUẨN BỊ MT CHO VI NHÂN GIỐNG Bài Xác định loại hóa chất dùng vi nhân giống Các loại hoá chất cần dùng vi nhân giống Phân loại hóa chất: 10 2.1 Nhóm hóa chất khử trừng 10 2.2 Nhóm ngun tố tạo mơi trường dinh dưỡng 11 2.3 Các chất bổ sung khác 11 2.4 Nhóm hóa chất làm đơng cứng mơi trường 11 Vai trò đặc tính lý, hố học sinh học hoá chất dùng vi nhân giống 12 3.1 Nguyên tố đa lượng 12 3.2 Nguyên tố vi lượng 12 3.3 Các vitamin 13 3.4 Nguồn bon: 13 3.5 Các chất điều hoà sinh trưởng 13 3.6 Các chất bổ sung khác: 15 3.7 Chất làm đông cứng môi trường: 15 Danh mục chất cho nuôi cấy cần dùng vi nhân giống 16 Bài Pha chế bảo quản dung dịch mẹ 19 Pha chế bảo quản hoá chất 19 Pha chế bảo quản dung dịch mẹ 20 2.1 Pha chế bảo quản nguyên tố đa lượng 20 2.2 Pha chế bảo quản vi lượng 21 2.3 Pha chế bảo quản vitamin 21 2.4 Pha chế bảo quản chất điều hoà sinh trưởng 22 Bài Pha chế bảo quản môi trường nuôi cấy 25 Pha chế môi trường nuôi cấy: 25 1.1 Chuẩn bị vật tư dụng cụ để pha chế môi trường: 25 1.2 Các bước thực pha chế môi trường 25 1.3 Pha chế số loại môi trường nuôi cấy cụ thể 27 Khử trùng môi trường 28 Bảo quản môi trường 28 ́ ́ CÁC THUẬT NGỮ CHUYÊN MÔN, CHỮ VIÊT TĂT MS Môi trường Murashige & Skoog VW Vacin & Went B5 Môi trường Gamborg B5 Medium WP Môi trường McCown Woody Plant Medium IBA –Indol butyric axit IAA Indo acetic axit NAA Napthyl acetic axit Kinetin – Furfuryl aminopurine- C10H9NO5 BAP 6- benzyl amino purine Zip Izopentenyl adenin GA3 Gibberellic axit MÔ ĐUN: PHA CHẾ DUNG DỊCH VÀ CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG CHO VI NHÂN GIỐNG Mã mô đun: MĐ 02 Giới thiệu mô đun: Mô đun nhằm trang bị cho học viên kiến thức kỹ xác định, pha chế, bảo quản hóa chất môi trường dùng nghề Vi nhân giống hoa Thời lượng mô đun 90 giờ; lý thuyết 16; thực hành 66; kiểm tra Bài Xác định loại hóa chất dùng vi nhân giống Mã bài: MĐ 02 – 01 Giới thiệu: Bài học trang bị cho học viên danh mục, tính chất tác dụng hóa chất dùng vi nhân giống Mục tiêu:  Trình bày vai trị, đặc tính lý, hóa học loại hóa chất dùng vi nhân giống  Nhận biết hóa chất phân theo nhóm: Nguyên tố đa lượng, Vi lượng; Vitamin; Axit amin; Chất điều tiết sinh trưởng; Chất khử trùng; Các chất sung khác  Liệt kê loại hóa chất cần dùng vi nhân giống A Nội dung chính: Các loại hoá chất cần dùng vi nhân giống Trong trình vi nhân giống mơi trường ni cấy xem vấn đề định thành bại trình ni cấy Mơi trường ni cấy cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho tăng trưởng phân hố suốt q trình ni cấy Mơi trường vi nhân giống đa dạng gồm số thành phần sau: - Các muối khoáng đa lượng vi lượng - Các vitamin - Nguồn bon: Một số loại đường - Các chất điều hoà sinh trưởng - Các chất bổ sung khác - Chất làm thay đổi trạng thái môi trường: Các loại thạch Hình 2.1: Một số loại hóa chất dùng vi nhân giống Phân loại hóa chất: Nhìn chung khó phân loại cách rõ ràng loại hóa chất sử dụng cho nhiều mục đích khác phân loại cách tương đối sau: 2.1 Nhóm hóa chất khử trừng Sự phát triển nấm, vi khuẩn bất lợi cho trình vi nhân giống Vì vậy, mẫu cấy cần khử trùng trước vào mẫu để tiến hành vi nhân giống Một số hóa chất khử trùng phổ biến: 2.1.1 Cồn Cồn dùng để khử trùng mẫu cấy loại cồn 70% Cồn thương phẩm bán thị trường thường cồn 96%, nên sử dụng cần pha cồn từ 96%-70% Ngoài ra, cồn dùng nhiều để vệ sinh tay, dụng cụ cấy…trong tiến hành vi nhân giống 2.1.2 Các hóa chất khử trùng khác Các hóa chất khử trùng khác thường sử dụng như: H2O2, NaClO, Ca(ClO)2 , HgCl2 … Các hóa chất thường dùng để khử trùng loại mẫu cấy giai đoạn vào mẫu(giai đoạn ni cấy khởi động) 2.2 Nhóm ngun tố tạo mơi trường dinh dưỡng Là nhóm nguyên tố cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho trình vi nhân giống - Nguồn cacbon: Các loại đường: Saccaroza, glucoza… - Nhóm nguyên tố đa lượng: Gồm nguyên tố: Mg, Ca, P, S, N, K - Nhóm nguyên tố vi lượng: Gồm nguyên tố: Fe, B, Cl, Cu, Mn, Mo, Zn… - Các Vitamin - Nhóm chất điều tiết sinh trưởng - Nhóm chất auxin - Nhóm chất cytokinin 2.3 Các chất bổ sung khác Dung dịch hữu có thành phần khơng xác định nước dừa, dịch chiết nấm men bổ sung vào mơi trường… 2.4 Nhóm hóa chất làm đơng cứng môi trường Đối với nuôi cấy tĩnh sử dụng mơi trường lỏng, mơ bị chìm chết thiếu oxi Để tránh tình trạng mơi trường nuôi cấy làm đặc lại thạch agar ( loại Polysacharid tảo) Vai trò đặc tính lý, hố học sinh học hoá chất dùng vi nhân giống 3.1 Nguyên tố đa lượng Các nguyên tố đa lượng gồm nguyên tố, Mg, Ca, P, N, S K cần thiết thay đổi tuỳ vào đối tượng nuôi cấy Nhìn chung nhu cầu thực vật với nguyên tố nồng độ > 0,5 mM Nguyên tố đa lượng có nồng độ cao mơi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Các nguyên tố đa lượng có chức cung cấp nguyên liệu để mô tế bào thực vật xây dựng thành phần cấu trúc chức sinh tổng hợp protein( Như N S), tổng hợp Nucleotit (như P, N, S), tổng hợp thành tế bào(Ca) giúp cho trình trao đổi chất tế bào thực vật với mơi trường thuận lợi Hình 2.2: Một số hóa chất thuộc nhóm đa lượng 3.2 Nguyên tố vi lượng Nhóm nguyên tố vi lượng gồm: Fe, Mn, Zn, Cu, Mo, Co, B, I, Ni, Cl, Al bào chúng đóng vai trị quan trọng hoạt động enzim Các 10 nguyên tố sử dụng nồng độ thấp (nồng độ < 0,5 mM) để bảo đảm sinh trưởng phát triển bình thường 3.3 Các vitamin Tất tế bào ni cấy có khả tổng hợp tất loại vitamin thường với số lượng mức u cầu để mơ có sức sinh trưởng tốt phải bổ sung vào môi trường hay nhiều loại vitamin Các vitamin cần thiết cho phản ứng sinh hoá Các vitamin sau sử dụng phổ biến: inositol, thiamin HCl (B1), pyridoxine HCl (B6), nicotinic axit vitamin B1 thiếu sử dụng hầu hết môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Inositol thường nói đến vitamin kích thích cách tích cực sinh trưởng phát triển thực vật, khơng phải vitamin cần thiết trường hợp Các vitamin khác đặc biệt nicotinic axit (B3), canxi pantothenate (B5) biotin sử dụng để nâng cao sức sinh trưởng mô nuôi cấy Ảnh hưởng vitamin lên phát triển tế bào nuôi cấy in vitro loài khác nhau khác chí cịn gây hại 3.4 Nguồn bon: Trong nuôi cấy mô, tế bào chưa có khả quang hợp để tổng hợp nên chất hữu nên người ta phải đưa vào môi trường lượng hợp chất cacbon định để cung cấp lượng cho tế bào mô Nguồn bon loại đường khoảng 20 – 30mg/l có tác dụng giúp đỡ mơ tế bào thực vật tổng hợp chất hữu cơ, giúp tế bào tăng sinh khối, ngồi cịn có vai trị chất thẩm thấu mơi trường Người ta thường sử dụng hai loại đường: Saccarose glucoze 3.5 Các chất điều hoà sinh trưởng Các phytohormon chất có tác dụng điều hồ sinh trưởng phát triển thực vật Chúng đóng vai trị quan trọng trình sinh trưởng phát triển thực vật như: Phân chia, biệt hố tế bào Ngồi cịn ảnh hưởng đến q trình lão hố mơ nhiều q trình khác Các phytohormon chia thành nhóm: Auxin, Cytokinin, Giberilin, Ethylen, Abscisic Axit 18 2.2 Pha chế bảo quản vi lượng Các chất vi lượng pha làm hai dung dịch mẹ dung dịch vi lượng dung dịch sắt Lượng lấy cho cho 1l dd l môi mẹ (mg/l) trường(ml/l) KI 0,83 116 H3BO3 6,2 1240 MnSO4.4H2O 22,3 4460 ZnSO4.7H2O 6,8 1360 CuSO4 5H2O 0,025 5 CoCl2 6H2O 0,025 5 Na2MoO4.2H20; 0,025 5 FeSO4.7H2O 27,8 5560 Na2EDTA.2H2O Khối lượng (mg/l) Khối lượng cho 1l môi trường Stt Thành phần 37,2 7440 Dung dịch vi lượng Dung dịch sắt Chú ý: Vì FeSO4.7H2O khó tan nên pha phải pha nước ấm, khuấy tan cho Na2EDTA.2H2O vào chuẩn thể tích Sau pha thấy dung dịch có mầu vàng rơm - Cách bảo quản dung dịch vi lượng: để bảo quản nhiệt độ từ – 60C Riêng dung dịch sắt phải bảo quản bình tối bọc bình túi bóng đen để dung dịch không bị phân huỷ 2.3 Pha chế bảo quản vitamin Khối lượng cho 500ml dd mẹ Lượng lấy cho 1l môi trường(mg/l) Thành phần Khối lượng cho 1l môi (mg/l) trường(ml/l) 1000 50 Myo – inositol 100,00 pyridoxine HCl 0,50 19 Glycine 2,00 200 Nicotin axit 0,50 50 Thiamin HCl 0,10 100 Cách bảo quản dung dịch vitamin : để bảo quản nhiệt độ từ – 60C 2.4 Pha chế bảo quản chất điều hoà sinh trưởng chất kích thích sinh trưởng BAP IAA Cách pha dung dịch mẹ Hoà 50mg ml HCl 0,1 N cho thêm nước cất hai lần để thể tích cuối 50ml Hồ 50mg ml NaOH 0,1 N thêm nước cất hai lần để thể tích cuối 50ml Kinitin Hồ 50mg 10 ml NaOH 0,1 N thêm nước cất hai lần để thể tích cuối 50ml NAA Hoà 50mg ml NaOH 0,1 N thêm nước cất hai lần để thể tích cuối 50ml IBA Hoà 50mg ml NaOH 0,1 N thêm nước cất hai lần để thể tích cuối 50ml Cách bảo quản chất điều hoà sinh trưởng : để bảo quản nhiệt độ từ – 60C Chú ý tiến hành pha dung dịch MS trên: - Cân hóa chất bảng với số lượng ghi trình tự tiến hành theo thứ tự hóa chất ghi bảng - Với hoá chất cân với số lượng có đơn vị (g) dùng cân kỹ thuật, đơn vị mg phải dùng cân phân tích - Khi pha dung dịch mẹ pha với lượng vừa phải tránh tượng kết tủa hoá chất dung dịch MS Mỗi dung dịch MS nên để lọ đựng dung dịch riêng rẽ bảo quản tủ lạnh ngăn 40C để tránh hỏng hóa chất - Phải đánh tan hố chất cốc thuỷ tinh nhỏ với lượng nước vừa đủ sau tráng lại kỹ( với tổng cộng lượng nước phải khơng lớn tổng thể tích MS cần thiết,