Công nghệ Nuôi cấy tạo cây đơn bội từ tế bào sinh dục

CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT Đề tài: Nuôi cấy tạo cây đơn bội từ tế bào sinh dục ĐẶT VẤN ĐỀ Trong chọn tạo giống cây trồng việc tạo ra được dòng đồng hợp tử tuyệt đối là một vấn đề rất được quan tâm. Các dòng này đã được tạo ra bằng nhiều con đường khác nhau như: tự phối, nuôi cấy tạo cây đơn bội từ tế bào sinh dục… Trong đó tạo cây đơn bội từ tế bào sinh dục là một kĩ thuật mới có nhiều ưu điểm so với các kĩ thuật khác. KHÁI NIỆM CHUNG VỀ THỂ ĐƠN BỘI • Các thể đơn bội là những cá thể thường là của những loài nhị bội hay đa bội khác nguồn mà trong tế bào soma của chúng số lượng nhiễm sắc thể bằng nửa số lượng NST của loài khởi đầu, trong mỗi cặp NST tương đồng nó chỉ có một NST. • Các cách hình thành thể đơn bội: Trinh sinh (gynogensis) và sinh sản đơn tính đực (androgensis). Loại trừ nhiễm sắc thể và giảm nhiễm sắc thể soma. Nuôi cấy thể đơn bội in vitro. Một số đặc điểm của thể đơn bội. • Trong cơ thể thực vật chỉ có thể giao tử (hạt phấn, noãn) là những tế bào đơn bội. Nếu chúng phát triển thành cây thì cây đó có mức bội thể đơn bội (n). • Ở thể đơn bội thì kiểu hình của cây phản ánh trung thực kiểu gen. Vì vậy thể đơn bội là nguyên liệu lý tưởng cho công tác chọn giống cây trồng. Khó khăn của việc tạo dòng thuần và hướng khắc phục. • Trong chọn giống thực vật để tạo ra dòng thuần chủng người ta tiến hành tự thụ phấn bắt buộc qua nhiều thế hệ, việc này tốn rất nhiều thời gian. • Vì vậy vấn đề đặt ra là làm thế nào trong một thời gian ngắn, chúng ta có thể tạo ra được dòng thuần chủng. Năm 1934, Stow đã phát hiện ra sự phát triển khác thường của hạt phấn thành những cấu trúc giống túi phôi đã xảy ra ở một số loài thực vật ở Hyacinthus. Hiện tượng này đã cho thấy các hạt phấn có khả năng phân chia để hình thành các tế bào mới hoặc các mô khi được sinh trưởng trong các điều kiện thích hợp và chúng tiếp tục phát triển thành cây đơn bội Ưu thế của việc tạo dòng thuần chủng từ nuôi cấy bao phấn, hạt phấn. • Tính đồng hợp tử có được chỉ sau một đời nuôi cấy trong khi đó chọn dòng thuần thông thường phải mất 5 6 đời tự thụ phấn. • Cây lưỡng bội hoá tính đồng hợp tử tuyệt đối, trong khi tự thụ phấn thông thường qua nhiều đời mà vẫn còn tồn dư dị hợp tử. • Sự đa dạng di truyền ở quần thể cây lưỡng bội hoá từ nuôi cấy bao phấn hạt phấn lớn hơn quần thể tự thụ phấn tạo dòng thuần sau các đời tự thụ. • Những gen lặn có thể bị che khuất ở các cây nhị bội dị hợp tử nhưng ở cây đơn bội hoặc lưỡng bội hóa từ hạt phấn lại có cơ hội biểu hiện ngay ra thành kiểu hình. • Cây đơn bội có thể dùng trong chọn lọc hồi quy để tạo giống chống bệnh. • Cấy truyền liên tục các dòng callus từ nuôi cấy bao phấn có thể tạo ra biến dị giao tử là nguyên liệu cho chọn giống. Khả năng ứng dụng của cây đơn bội. • Nghiên cứu di truyền về mối tương tác của các gen. • Tạo đột biến ở mức đơn bội. • Tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ cho công tác chọn giống cây trồng. Sơ đồ các hướng ứng dụng đơn bội Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn Nguyên lý: Dựa trên cơ sở của sự sinh sản đơn tính đực (androgensis), người ta nuôi cấy các hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tách rời hay các bao phấn có chứa các hạt phấn đơn nhân trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để kích thích hạt phấn phát triển thành cây đơn bội. Các phương thức sinh sản vô tính đực invitro tạo cây đơn bội  Sinh sản đơn tính trực tiếp (thuốc lá, cà độc dược). Hạt phấn đơn nhân  phôi 1n cây 1n  Sinh sản đơn tính đực gián tiếp (lúa, ngô) Hạt phấn đơn nhân  mô sẹo 1n  chồi 1n cây1n  Sinh sản vô tính đực hỗn hợp: quá trình này diễn ra tương tự như sinh sản vô tính đực gián tiếp, nhưng sự tạo thành mô sẹo ngắn, khó nhận biết. Ví dụ: cà chua. Các phương pháp cơ bản Có 2 phương pháp cơ bản được sử dụng trong nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là:  Phương pháp1: Các bao phấn được nuôi cấy trên môi trường có agar hoặc môi trường lỏng và sự phát sinh phôi xảy ra trong bao phấn. Kỹ thuật nuôi cấy Kỹ thuật này bao gồm những bước chính như sau: • Chọn bao phấn: Bao phấn thích hợp nhất có chứa hạt phấn bắt đầu từ thể tứ bào tử đến ngay sau lần nguyên phân thứ nhất. Bao phấn của các hoa đầu tiên cho kết quả tốt hơn bao phấn của hoa muộn. • Xử lý nụ hoa: Cần xử lý ở nhiệt độ thích hợp các nụ hoa sau khi cắt khỏi cây và trước khi tách bao phấn để nuôi cấy, nhằm kích thích sự phân chia của hạt phấn và từ đó tạo cây đơn bội. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo cây đơn bội trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn in vitro Tình hình nghiên cứu, thành tựu và hiện trạng. Tình hình nghiên cứu: 1964 Guka và Maheshwasi lài hai nhà khoa học Ấn Độ lần đầu tiên đã tạo thành công cây đơn bội qua nuôi cấy bao phấn cây cà độc dược. Kĩ thuật đơn bội được ứng dụng rất rộng rãi ở hầu hết các nước có công nghệ chọn giống trên thế giới. Công nghệ đơn bội đã được áp dụng đối với hầu hết các cây trồng quan trọng và mang lai hiệu quả kinh tế cao. Đối với một số cây như lúa, ngô, đại mạch, măng tây…thì đây là công nghệ không thể thiếu được trong chọn tạo giống. Ở nước ta từ năm 1975 đến nay đã tạo được nhiều loại cây trồng bằng nuôi cấy đơn bội như ngô, bắp cải, thuốc lá. Thành tựu:  Các cây đơn bội có nguồn gốc hạt phấn đã được tạo ra ở 216 loài thuộc 78 giống, 31 họ và nhiều loài khác cũng được nghiên cứu thành công (Hu và Zhang, 1985).  Thông qua nuôi bao phấn đã tạo các giống lúa thuần như Khao 85, Khao 1105, VH2. Đặc biệt thông qua chọn dòng tế bào soma thu được các giống DR1, DR2, DR3 đang mở rộng ra qui mô sản xuất. Kết hợp biến dị tế bào soma với gây đột biến đã tạo giống lúa KDM39. Trong nghiên cứu lúa lai đang áp dụng kỹ thuật lai xa, cứu phôi, đột biến tạo dòng TGMS và CMS mới. Trong lĩnh vực nông nghiệp, các kết quả nghiên cứu về công nghệ tế bào mô phôi thực vật giúp chúng ta nhanh chóng tạo ra các giống cây trồng thuần. Hàng loạt dòng thuần ở lúa (ĐV2, MT4, DT26...) đã được tạo ra bằng kĩ thuật đơn bội nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy noãn. Đặc biệt, chúng ta đã sản xuất được dòng lúa thuần mang gene quý như gen bất dục đực tế bào chất, bất dục đực nhân (gen TGMS, PGMS). Đối với ngô, đã tạo được 5 dòng ngô thuần và hai tổ hợp ngô lai có triển vọng. Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào phát triển nhanh và ngày càng hiện đại mở tiềm năng to lớn cho cho nuôi cấy bao phấn hạt phấn tạo cây đơn bội từ đó tạo dòng thuần, đáng chú ý là ở các đối tượng có tầm quan trọng như: lúa gạo, lúa mạch, đại mạch, thuốc lá, ngô, khoai tây… Ưu điểm của việc tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn và hạt phấn • Nuôi cấy bao phấn:  Vì bao phấn có kích thước lớn nên thao tác dễ dàng.  Môi trường nuôi cấy đơn giản. • Nuôi cấy hạt phấn:  Giống tạo ra có tính đồng hợp tử cao.  Phát sinh phôi dễ dàng trong quá trình nuôi cấy.  Tạo cây đơn bội thuận lợi cho việc nghiên cứu di truyền.  Tóm lại, nuôi cấy bao phấn, hạt phấn ra đời đã làm giảm thời gian, đồng thời làm tăng vọt số lượng các cá thể đơn bội thu được. TẠO CÂY ĐƠN BỘI BẰNG NUÔI CẤY NOÃN CHƯA THỤ TINH Khái niệm:  Tạo cây đơn bội từ nuôi cấy noãn chưa thụ tinh là sự kích thích tế bào trứng hay các tế bào đối cực,tế bào kèm trong noãn phát triển và tái sinh thành cây đơn bội.Sự hình thành từ noãn chưa thụ tinh được gọi là sự sinh sản đơn tính cái hay trinh nữ sinh  Đã có nhiều thành công trong nghiên cứu tạo các cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn. Nhưng ở một số loại cây như hành,hoa hướng dương hay củ cải đường… thì phương pháp này tỏ ra không hiệu quả. Chính vì vậy trong những năm 70 các nhà nghiên cứu đã tiến hành tạo cây đơn bội bằng noãn chưa thụ tinh và đã giành được một số kết quả đáng kể. Quy trình tạo cây đơn bội bằng noãn chưa thụ tinh Những nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy noãn chưa thụ tinh  Kĩ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh còn gặp nhiều khó khăn và phức tạp do việc tách noãn khó và dễ gây tổn thương  Nhằm tăng hiệu quả của quá trình này người ta đang tập trung nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy để tạo cây đơn tính mong muốn  Kiểu gen của cây mẹ • là một trong những nhân tố quan trọng nhất đối với quá trình nuôi cấy • Người ta nhận thấy mỗi một kiểu gen có phản ứng khác nhau trong quá trình sinh trưởng nên phải xác định quy trình riêng cho từng loại cây cụ thể của từng kiểu gen • nhân tố này đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau như lúa,hoa đồng tiền.  Giai đoạn phát triển của noãn • Giai đoạn phát triển của noãn có ý nghĩa đặc biệt đối với việc tạo thể đơn bội • Túi phôi thành thục là giai đoạn phù hợp cho hiệu quả cao trong nuôi cấy noãn • Tuy nhiên việc xác định giai đoạn phát triển của thể giao tử cái là rất phức tạp vì túi phôi nằm trong bầu quả do đó khó quan sát trực tiếp để xác định được thì phải sử dụng các phương pháp tế bào học như tách túi phôi,nhuộm màu bằng lát cắ mỏng  Môi trường nuôi cấy • Các môi trường như MS, B5, MF thừng được sử dụng làm môi trường nuôi cấy noãn chưa thụ tinh • Môi trường này chủ yếu ở dạng đặc • Để cảm ứng được sự trinh sinh cần thiết thì phải bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng thực vật • Ngoài ra nồng độ đường cũng là một yếu tố cần được quan tâm,nồng độ phải phù hợp cho từng loại cây • Trong nhiều trường hợp việc bổ sung thêm một số chất phụ gia như nước dừa có tác dụng tạo callus phát sinh phôi và tái sinh cây  Điều kiện nuôi cấy • Quá trình nuôi cấy thường được duy trì ở nhiệt độ ổn định 2528 độ • Đối với đa số loài thường ở giai đạn đầu của quá trình nuôi cấy tiến hành trong điều kiện tối, giai đoạn tái sinh cây yêu cầu ánh sáng 20003000 lux Những thành tựu đạt được trong phương pháp tạo cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh  Tỉ lệ tạo cây đơn bội theo phương pháp này có nhiều khả quan như ở hành và củ cải đường :520%,ở dâu tằm là 36%  Cây tái sinh ít bị bạch tạng ngay ở cả họ hòa thảo,trong khi nếu nuôi cấy bằng bao phấn và hạt phấn có tỉ lệ bạch tạng 6090%

KHÁI NIỆM CHUNG VỀ THỂ ĐƠN BỘI

• Các thể đơn bội là những cá thể thường là của những loài nhị bội hay đa bội khác nguồn mà trong tế bào soma của chúng số lượng nhiễm sắc thể bằng nửa số lượng NST của loài khởi đầu, trong mỗi cặp NST tương đồng nó chỉ có một NST

• Các cách hình thành thể đơn bội:

- Trinh sinh (gynogensis) và sinh sản đơn tính đực (androgensis)

- Loại trừ nhiễm sắc thể và giảm nhiễm sắc thể soma

- Nuôi cấy thể đơn bội in vitro

Một số đặc điểm của thể đơn bội

• Trong cơ thể thực vật chỉ có thể giao tử (hạt phấn, noãn) là những tế bào đơn bội Nếu chúng phát triển thành cây thì cây đó có mức bội thể đơn bội (n)

• Ở thể đơn bội thì kiểu hình của cây phản ánh trung thực kiểu gen Vì vậy thể đơn bội là nguyên liệu lý tưởng cho công tác chọn giống cây trồng

Khó khăn của việc tạo dòng thuần và hướng khắc phục

• Trong chọn giống thực vật để tạo ra dòng thuần chủng người ta tiến hành tự thụ phấn bắt buộc qua nhiều thế hệ, việc này tốn rất nhiều thời gian

• Vì vậy vấn đề đặt ra là làm thế nào trong một thời gian ngắn, chúng ta có thể tạo

ra được dòng thuần chủng Năm 1934, Stow đã phát hiện ra sự phát triển khác thường của hạt phấn thành những cấu trúc giống túi phôi đã xảy ra ở một số loài thực vật ở

Hyacinthus Hiện tượng này đã cho thấy các hạt phấn có khả năng phân chia để hình thành các tế bào mới hoặc các mô khi được sinh trưởng trong các điều kiện thích hợp và chúng tiếp tục phát triển thành cây đơn bội

Ưu thế của việc tạo dòng thuần chủng từ nuôi cấy bao phấn, hạt phấn

• Tính đồng hợp tử có được chỉ sau một đời nuôi cấy trong khi đó chọn dòng thuần thông thường phải mất 5 - 6 đời tự thụ phấn

• Cây lưỡng bội hoá tính đồng hợp tử tuyệt đối, trong khi tự thụ phấn thông thường qua nhiều đời mà vẫn còn tồn dư dị hợp tử

• Sự đa dạng di truyền ở quần thể cây lưỡng bội hoá từ nuôi cấy bao phấn hạt phấn lớn hơn quần thể tự thụ phấn tạo dòng thuần sau các đời tự thụ

• Những gen lặn có thể bị che khuất ở các cây nhị bội dị hợp tử nhưng ở cây đơn bội hoặc lưỡng bội hóa từ hạt phấn lại có cơ hội biểu hiện ngay ra thành kiểu hình

• Cây đơn bội có thể dùng trong chọn lọc hồi quy để tạo giống chống bệnh

• Cấy truyền liên tục các dòng callus từ nuôi cấy bao phấn có thể tạo ra biến dị giao tử là nguyên liệu cho chọn giống

Khả năng ứng dụng của cây đơn bội

• Nghiên cứu di truyền về mối tương tác của các gen

• Tạo đột biến ở mức đơn bội

• Tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ cho công tác chọn giống cây trồng

Sơ đồ các hướng ứng dụng đơn bội

Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn

Nguyên lý:

Dựa trên cơ sở của sự sinh sản đơn tính đực (androgensis), người ta nuôi cấy các hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tách rời hay các bao phấn có chứa các hạt phấn đơn nhân trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để kích thích hạt phấn phát triển thành cây đơn bội

Các phương thức sinh sản vô tính đực invitro tạo cây đơn bội

 Sinh sản đơn tính trực tiếp (thuốc lá, cà độc dược)

Hạt phấn đơn nhân  phôi 1n cây 1n

 Sinh sản đơn tính đực gián tiếp (lúa, ngô)

Hạt phấn đơn nhân  mô sẹo 1n  chồi 1n cây1n

 Sinh sản vô tính đực hỗn hợp: quá trình này diễn ra tương tự như sinh sản vô tính đực gián tiếp, nhưng sự tạo thành mô sẹo ngắn, khó nhận biết Ví dụ: cà chua

Các phương pháp cơ bản

Có 2 phương pháp cơ bản được sử dụng trong nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là:

 Phương pháp1: Các bao phấn được nuôi cấy trên môi trường có agar hoặc môi trường lỏng và sự phát sinh phôi xảy ra trong bao phấn

Kỹ thuật nuôi cấy

Kỹ thuật này bao gồm những bước chính như sau:

• Chọn bao phấn: Bao phấn thích hợp nhất có chứa hạt phấn bắt đầu từ thể tứ bào tử đến ngay sau lần nguyên phân thứ nhất Bao phấn của các hoa đầu tiên cho kết quả tốt hơn bao phấn của hoa muộn

• Xử lý nụ hoa: Cần xử lý ở nhiệt độ thích hợp các nụ hoa sau khi cắt khỏi cây và trước khi tách bao phấn để nuôi cấy, nhằm kích thích sự phân chia của hạt phấn và từ đó tạo cây đơn bội

Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo cây đơn bội trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn in vitro

Tình hình nghiên cứu, thành tựu và hiện trạng

- Ở nước ta từ năm 1975 đến nay đã tạo được nhiều loại cây trồng bằng nuôi cấy đơn bội như ngô, bắp cải, thuốc lá

Thành tựu:

 Các cây đơn bội có nguồn gốc hạt phấn đã được tạo ra ở 216 loài thuộc 78 giống,

31 họ và nhiều loài khác cũng được nghiên cứu thành công (Hu và Zhang, 1985)

 Thông qua nuôi bao phấn đã tạo các giống lúa thuần như Khao 85, Khao 1105, VH2 Đặc biệt thông qua chọn dòng tế bào soma thu được các giống DR1, DR2, DR3 đang mở rộng ra qui mô sản xuất Kết hợp biến dị tế bào soma với gây đột biến đã tạo

giống lúa KDM39 Trong nghiên cứu lúa lai đang áp dụng kỹ thuật lai xa, cứu phôi, đột biến tạo dòng TGMS và CMS mới

Trong lĩnh vực nông nghiệp, các kết quả nghiên cứu về công nghệ tế bào - mô phôi thực vật giúp chúng ta nhanh chóng tạo ra các giống cây trồng thuần Hàng loạt dòng thuần ở lúa (ĐV2, MT4, DT26 ) đã được tạo ra bằng kĩ thuật đơn bội nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy noãn Đặc biệt, chúng ta đã sản xuất được dòng lúa thuần mang gene quý như gen bất dục đực tế bào chất, bất dục đực nhân (gen TGMS, PGMS) Đối với ngô,

đã tạo được 5 dòng ngô thuần và hai tổ hợp ngô lai có triển vọng

Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào phát triển nhanh và ngày càng hiện đại mở tiềm năng to lớn cho cho nuôi cấy bao phấn hạt phấn tạo cây đơn bội từ đó tạo dòng thuần, đáng chú ý

là ở các đối tượng có tầm quan trọng như: lúa gạo, lúa mạch, đại mạch, thuốc lá, ngô, khoai tây…

Ưu điểm của việc tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn và hạt phấn

• Nuôi cấy bao phấn:

 Vì bao phấn có kích thước lớn nên thao tác dễ dàng

 Môi trường nuôi cấy đơn giản

• Nuôi cấy hạt phấn :

 Giống tạo ra có tính đồng hợp tử cao

 Phát sinh phôi dễ dàng trong quá trình nuôi cấy

 Tạo cây đơn bội thuận lợi cho việc nghiên cứu di truyền

 Tóm lại, nuôi cấy bao phấn, hạt phấn ra đời đã làm giảm thời gian, đồng thời làm tăng vọt số lượng các cá thể đơn bội thu được

TẠO CÂY ĐƠN BỘI BẰNG NUÔI CẤY NOÃN

CHƯA THỤ TINH

Khái niệm:

 Tạo cây đơn bội từ nuôi cấy noãn chưa thụ tinh là sự kích thích tế bào trứng hay các tế bào đối cực,tế bào kèm trong noãn phát triển và tái sinh thành cây đơn bội.Sự hình thành từ noãn chưa thụ tinh được gọi là sự sinh sản đơn tính cái hay trinh nữ sinh

 Đã có nhiều thành công trong nghiên cứu tạo các cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn Nhưng ở một số loại cây như hành,hoa hướng dương hay củ cải đường… thì

phương pháp này tỏ ra không hiệu quả Chính vì vậy trong những năm 70 các nhà nghiên cứu đã tiến hành tạo cây đơn bội bằng noãn chưa thụ tinh và đã giành được một số kết quả đáng kể

Quy trình tạo cây đơn bội bằng noãn chưa thụ tinh

Những nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy noãn chưa thụ tinh

 Kĩ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh còn gặp nhiều khó khăn và phức tạp do việc tách noãn khó và dễ gây tổn thương

 Nhằm tăng hiệu quả của quá trình này người ta đang tập trung nghiên cứu các yếu

tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy để tạo cây đơn tính mong muốn

 Kiểu gen của cây mẹ

• là một trong những nhân tố quan trọng nhất đối với quá trình nuôi cấy

• Người ta nhận thấy mỗi một kiểu gen có phản ứng khác nhau trong quá trình sinh trưởng nên phải xác định quy trình riêng cho từng loại cây cụ thể của từng kiểu gen

• nhân tố này đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau như lúa,hoa đồng tiền

 Giai đoạn phát triển của noãn

• Giai đoạn phát triển của noãn có ý nghĩa đặc biệt đối với việc tạo thể đơn bội

• Túi phôi thành thục là giai đoạn phù hợp cho hiệu quả cao trong nuôi cấy noãn

• Tuy nhiên việc xác định giai đoạn phát triển của thể giao tử cái là rất phức tạp vì túi phôi nằm trong bầu quả do đó khó quan sát trực tiếp để xác định được thì phải sử dụng các phương pháp tế bào học như tách túi phôi,nhuộm màu bằng lát cắ mỏng

 Môi trường nuôi cấy

• Các môi trường như MS, B5, MF thừng được sử dụng làm môi trường nuôi cấy noãn chưa thụ tinh

• Môi trường này chủ yếu ở dạng đặc

• Để cảm ứng được sự trinh sinh cần thiết thì phải bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng thực vật

• Ngoài ra nồng độ đường cũng là một yếu tố cần được quan tâm,nồng độ phải phù hợp cho từng loại cây

• Trong nhiều trường hợp việc bổ sung thêm một số chất phụ gia như nước dừa có tác dụng tạo callus phát sinh phôi và tái sinh cây

 Điều kiện nuôi cấy

• Quá trình nuôi cấy thường được duy trì ở nhiệt độ ổn định 25-28 độ

• Đối với đa số loài thường ở giai đạn đầu của quá trình nuôi cấy tiến hành trong điều kiện tối, giai đoạn tái sinh cây yêu cầu ánh sáng 2000-3000 lux

Những thành tựu đạt được trong phương pháp tạo cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh

 Tỉ lệ tạo cây đơn bội theo phương pháp này có nhiều khả quan như ở hành

và củ cải đường :5-20%,ở dâu tằm là 3-6%

 Cây tái sinh ít bị bạch tạng ngay ở cả họ hòa thảo,trong khi nếu nuôi cấy bằng bao phấn và hạt phấn có tỉ lệ bạch tạng 60-90%

 Ở các loại cây ngũ cốc ở VN thì biện pháp này tương đối đơn giản và dễ thành công như ở cây ngô

So sánh

Giống nhau:

 Đều dùng giao tử để tạo tế bào đơn bội

 Đều nhằm tạo ra những cây đơn bội qua sự cảm ứng phát sinh phôi từ những phân chia lặp lại của các bào tử đơn bội,các tiểu bào tử, các hạt phấn non

Khác nhau

 Phương pháp nuôi cấy hạt phấn tách rời tạo tế bào đơn bội cần phải tách rời các hạt phấn khỏi bao phấn khi nuôi cấy Các hạt phấn này thường được nuôi cấy trên môi trường lỏng kèm theo chế độ lắc hay nuôi cấy chìm trong môi trường bán lỏng

 Phương pháp nuôi cấy bao phấn được áp dụng trên nhiều đối tượng thực vật khác nhau: ngô, lúa, thuốc lá… nhưng không áp dụng trên các cây hành, củ cải đường, hoa hướng dương

 Phương pháp nuôi cấy noãn chưa thụ tinh chủ yếu trên các đối tượng hành, củ cải đường, ngô, các cây ngũ cốc Tuy nhiên kỹ thuật này còn gặp nhiều khó khăn và phức tạp

do việc tách vách tế bào trứng rất khó và dễ gây thương tổn do vậy người ta đang tập trung nghiên cứu các yếu tố như kiểu gen cây mẹ, giai đoạn phát triển của túi phôi, chế

độ xử lý nhiệt độ, môi trường nuôi cấy…

Hiện trạng

 Hiện tại người ta mới nuôi cấy hạt phấn trưởng thành để tạo cây đơn bội thành công qua con đường phôi hoá, hoặc tạo thành mô sẹo, từ đó tạo cây đơn bội Còn nuôi

cấy hạt phấn non chưa đạt được nhiều hiệu quả, hiện tại chỉ có một số kết quả về nuôi cấy hạt phấn non thành công như nuôi cấy hạt phấn non cây Trillium electum (Saparov và cs,1955), cây hành Allium cepa (Vasil,1959), ở cây Atropa belladonna (Bajaj,1974).

 Hầu hết các cây ngũ cốc và các cây họ đậu nuôi cấy bao phấn rẩt khó thành công hoặc tỉ lệ thành cây thấp, tỉ lệ cây bạch tạng cao

 Nhiều gen có khả năng thành cây thấp thường không được ứng dụng trong nuôi cấy bao phấn nhưng có khi gen lại có giá trị kinh tế cao Ví dụ cấy bao phấn giống lúa Japonica dễ thành công hơn hơn giống lúa Indica, tuy nhiên giống Indica lại có vai trò quan trọng hơn nhiều giống Japonica

Nuôi cấy bao phấn thuốc lá

Nguyên liệu và thiết bị:

– Nụ hoa thuốc lá (Nicotiana tabacum)

– Nước cất 2 lần vô trừng

– Etanol 90%

– Dung dịch hipoclorit natri 10% (V/v)

– Thuốc nhuộm acetocacmin

– Agar

– Đĩa petri

– Môi trường MS hoặc môi trường NN

– Kính hiển vi giải phẫu

– Dao, kéo, panh, Dùng cho nuôi cấy

– Một số hóa chất để pha môi trường lỏng: saccarozo, KNO3,…

• Rửa các nụ hoa vài lần trong nước cất 2 lần vô trùng Dùng dao, kim và panh giải phẫu cẩn thận nụ hoa và lấy ra các bao phấn (có thể sử dụng kính hiển vi giải phẫu để hỗ trợ cho quá trình thao tác

• Lấy 1 bao phấn của mỗi nụ hoa và ép trong acetocacmin để xác định giai đoạn phát triển của hạt phấn Nếu hạt phấn ở giai đoạn phát triển thích hợp thì các bao phấn còn lại của nụ hoa được dùng trong nuôi cấy

• Các bao phấn có thể được nuôi cấy theo 2 cách:

• Trên môi trường MS đặc (có 0,6-1,0%(W/v) agar)

• Nuôi cấy nổi trên môi trường lỏng gồm: KNO3-950(mg/l); NH4NO3- 825(mg/l); MgSO4.7H2O- 185(mg/l); CaCl2- 220 (mg/l);KH2PO4-85 (mg/l); FeSO4.7H2O-27,8 (mg/l)

; Na2EDTA-37,3 (mg/l);saccarozo-20000 (mg/l)

6 Quá trình nuôi cấy được duy trì ở nhiệt độ 25oC trong tối hoặc ở ánh sáng yếu Cường độ ánh sáng thích hợp khoảng 300lux Sau 4-6 tuần nuôi cấy, các cây con sẽ xuất hiện từ một số bao phấn

Khi mô bao phấn đạt 3mm thì tách cây con ra khỏi mô và chuyển sang môi trường tạo rễ (có thể dùng môi trường MS với thành phần khoáng giảm 1 nửa) Cường độ ánh sáng cao hơn thời gian chiếu sáng khoảng 10-12h/ngày

Đề tài: “Bảo quản nguồn gen thực vật in vitro”

MỤC LỤC

 II Nội dung

1 Bảo tồn nguồn gen thực vật

2 Sõ lýợc về các phýõng pháp bảo tồn nguồn gen

3 Các cách bảo quản nguồn gen thực vật in vitro

4 Ýu thế và hạn chế của kỹ thuật bảo quản nguồn gen thực vật in vitro

5 Khả nãng ứng dụng của bảo quản nguồn gen thực vật in vitro

6 Phýõng pháp bảo quản nguồn gen invitro đối với giống hoa Lilium

 Hiện nay có nhiều phýõng pháp bảo quản nguồn gen thực vật, song bảo quản nguồn gen thực vật in vitro là giải pháp công nghệ có triển vọng, nhất là với các cây nhân giống vô tính và các hạt mức sức nảy mầm ở nhiệt độ và ẩm độ thấp

Vì vậy, chúng tôi tiến hành tìm hiểu đề tài: “Bảo quản nguồn gen thực vật in vitro”

Nội dung

1.1 Mục đích

 Bảo vệ sự đa dạng sinh học, thể hiện ở 3 mức:

+) Sự đa dạng của các hệ sinh thái

+) Đa dạng của các loài

+) Sự đa dạng di truyền hay sự đa dạng của các nguồn gen trong loài

 Đánh giá, khai thác sử dụng các nguồn gen có giá trị để phục vụ con ngýời 1.2 Ý nghĩa

 Là một việc làm cấp thiết và thýờng xuyên để phục vụ nhiệm vụ trýớc mắt và lâu dài của công tác cải thiện giống, vừa góp phần quan trọng vào công tác bảo tồn thiên nhiên, bảo vệ sự đa dạng sinh học.

 Bảo tồn nguồn gen ngăn chặn sự mất mát các gen, các phức hợp gen ngăn chặn sự tuyệt chủng của các nòi địa lý, các xuất xứ và trong trýờng hợp cực đoan đó

là sự tuyệt chủng của loài.

2 Các phýõng pháp bảo tồn nguồn gen từ trýớc đến nay

2.1 Bảo tồn ngoại vi (ex - situ conservation)

Đây là hình thức bảo tồn chủ yếu hiện nay trên thế giới, một hình thức bảo tồn ngoài phạm vi cý trú tự nhiên của các loài

2.1.1 Bảo quản hạt

Gồm:

 Bảo quản ngắn hạn (hạt giống đýợc làm khô tới độ ẩm 9%, thời gian 5 năm)

 Bảo quản trung hạn (độ ẩm hạt 7%, bảo quản trong dụng cụ bao gói và kho chuyên dụng ở độ ẩm 10%, t 0 là - 1 đến - 5 0 C)

 Bảo quản dài hạn (độ ẩm hạt 3%, đựng trong hộp kim loại, bảo quản trong kho lạnh sâu, t 0 C là - 15 0 C đến - 20 0 C, thời gian từ 20 - 30 năm).

2.1.2 Bảo quản trên đồng ruộng

Đối týợng: cây lâu năm nhý cây ăn quả, cây công nghiệp, cây thuốc, cây sinh sản vô tính, hữu tính khác…

 Ýu điểm: Dễ tiếp cận nghiên cứu, đánh giá và sử dụng

 Nhýợc điểm: Dễ mất mát do điều kiện không thuận lợi, đòi hỏi diện tích đất đai lớn và nguồn nhân lực

2.1.3 Bảo quản in vitro

Đối týợng bảo quản in vitro:

- Vật liệu sinh sản vô tính (chuối, dứa, mít, khoai sọ, khoai lang…)

- Các loại cây có hạt recalcitrant - hạt khó bảo quản (xoài, mít, na, sầu riêng, nhãn, vải và cây có múi…)

- Các vật liệu dùng để nhân nhanh phục vụ các chýõng trình chọn tạo và nhân giống, hạt phấn và ngân hàng DNA…

2.1.3 Bảo quản in vitro

Gồm

 Bảo quản ngắn hạn: Thực vật đýợc phát triển bình thýờng trong điều kiện

vô trùng của phòng thí nghiệm, vật liệu đýợc bảo quản để cung cấp cho các nhu cầu chọn tạo giống và nghiên cứu của mỗi cõ sở.

 Bảo quản trung hạn (bảo quản bằng sinh trýởng chậm) thì tốc độ sinh

trýởng của vật liệu đýợc làm giảm một cách đáng kể bằng cách giữ ở nhiệt độ ánh sáng thấp hoặc giảm nồng độ oxy.

=> Cả 2 phýõng pháp này áp dụng cho vật liệu là: chồi, mô phân sinh và cây con 2.1.3 Bảo quản in vitro

2.1.3 Bảo quản in vitro

- Bảo quản dài hạn: Bảo quản dài hạn là bảo quản trong hoặc trên bề mặt nitõ lỏng (- 176 0 C đến - 196ºC), với điều kiện này mọi quá trình sống bị đình chỉ hoàn toàn.

Đối týợng: mô sẹo, tế bào hạt phấn, phôi của một số loài thực vật… 2.2 Bảo tồn nội vi (bảo tồn tại chỗ, in-situ conservation)

 Là bảo tồn nguồn gen trong môi trýờng sinh sống.

 Đối týợng: bất kì thực vật nào, chủ yếu là các loài tổ tiên của cây trồng, các loài hoang dại có quan hệ gần gũi với cây trồng.

 Với 1 số giống địa phýõng đýợc hình thành do quá trình chọn lọc và trồng trọt lâu đời tại 1 địa phýõng cũng có thể bảo quản tại chỗ trên đồng ruộng của nông dân hoặc bảo quản dựa vào cộng đồng.

3 Các cách bảo quản nguồn gen thực vật in vitro

 Đây là giải pháp công nghệ có triển vọng trong việc bảo quản nguồn gen thực vật, nhất là với các cây nhân giống vô tính và cả hạt khó bảo quản có nhiệt độ và độ

ẩm thấp.

 Trong vòng 20 năm gần đây, công nghệ này đã đýợc phát triển rộng và áp dụng với hõn 1000 loài khác nhau (F.Engelmann, 1997).

+ Bảo quản sinh trýởng chậm

+ Biện pháp ngừng sinh trýởng tạm thời

3.1 Bảo quản sinh trýởng chậm

 Gồm bảo quản ngắn hạn và trung hạn

 Vật liệu thích hợp là chồi, mô phân sinh và cây con

 Để giảm tốc độ sinh trýởng của cây trong ống nghiệm, ngýời ta đã thay đổi một số yếu tố:

+ Hạ thấp nhiệt độ nuôi cấy, đýa thêm các chất ức chế sinh trýởng + Chất làm tăng áp suất thẩm thấu

+ Và làm nghèo thành phần dinh dýỡng trong môi trýờng nuôi cấy

3.2 Biện pháp ngừng sinh trýởng tạm thời

 Đây là phýõng pháp bảo quản dài hạn các vật liệu trong hoặc trên bề mặt nitõ lỏng (- 176 0 C đến - 196 0 C ).

 Bảo quản đông lạnh trong, trên nitõ lỏng có thể đýợc chia ra các công đoạn sau:

+ Tiền sinh trýởng, xử lý với 5 - 10 % proline, 3 - 6 % manitol.

+ Xử lý bảo vệ chống đóng băng.

3.2 Biện pháp ngừng sinh trýởng tạm thời

 Đýa vào bảo quản trong hoặc trên mặt nitõ lỏng (- 196 0 C – 158 0 C).

 Làm tan tuyết, xử lý ở nhiệt độ 35 – 40 0 C trong điều kiện phòng thí nghiệm bình thýờng.

 Phục hồi sinh trýởng, tái sinh cây.

3.2 Biện pháp ngừng sinh trýởng tạm thời

 Biện pháp ngừng sinh trýởng tạm thời áp dụng thành công cho các đối

týợng:

+ Mô sẹo + Tế bào hạt phấn + Mô phân sinh

 Ví dụ: ngýời ta đã nghiên cứu mô phân sinh của khoai tây và đýa vào bảo quản đông lạnh cho tỉ lệ phục hồi tái sinh cao xấp xỉ 36%

4 Ýu thế và hạn chế của kỹ thuật bảo quản nguồn gen thực vật in vitro

 Sử dụng các bộ phận nhỉ nhý hạt, chồi, mô, nên có thể tiết kiệm đýợc không gian bảo quản.

 Có khả năng tạo ra biến dị Soma với tần số biến dị khác nhau và ít lặp lại

 Chi phí bảo quản lớn, đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao và trang thiết bị hiện đại

 Chýa xác định đýợc khoảng thời gian tối đa một cách an toàn trong quá trình bảo quản bằng sinh trýởng chậm cho từng loài cây trồng

5 Khả nãng ứng dụng của bảo quản nguồn gen thực vật in vitro

Ngày nay ngýời ta phân biệt đýợc bốn nhóm đối týợng mà chúng có thể bảo quản invitro có lợi

 Nhóm vật liệu nuôi cấy bảo quản invitro bắt buộc bao gồm các nhân giống vô tính, các loại cây có hạt recalcitrant…

 Nhóm vật liệu bảo quản trong điều kiện invitro gồm các dòng độc nhất và nguyên liệu đã đýợc làm sạch bệnh.

 Vật liệu bảo quản invitro có thể có lợi trong từng thời điểm chẳng hạn nhân nhanh một kiểu gen, phục vụ chýõng trình tạo giống hoặc khảo sát đánh giá trong điều kiện invitro.

 Vật liệu cần bảo quản invitro có liên quan đến kĩ thuật gen và sản xuất các chất thứ cấp.

Ví dụ: Phýõng pháp bảo quản nguồn gen invitro đối với giống hoa Lilium x

formolongo

 Đối týợng nghiên cứu: Lilium x formolongo

 Phýõng pháp nghiên cứu:

- Thu thập mẫu

- Tách và nuôi cấy vảy củ

- Cấy chuyển và bảo quản nguồn gen

 Môi trýờng nuôi cấy:

Trong thí nghiệm sử dụng môi trýờng vào mẫu là MS + 30g saccarose/l + 6.5g agar/l, 1ml α NAA, pH là 5.7

 Môi trýờng cấy chuyển: MS + 30g saccarose/l + 6.5g agar/l, pH là 5.7

 Tiến hành:

Mẫu sau khi thu thập đýợc đýa về phòng thí nghiệm, tiến hành khử trùng mẫu.

Hóa chất dùng để vô trùng : Clorua thủy ngân với nồng độ sử dụng là 0.1 – 1% (W/v) trong thời gian tử 10 – 15 phút

Sau khi mấu đýợc khử trùng, tiến hành vào mẫu Thời gian từ khi vào mẫu tới khi cây ra rễ là 3 tuần Cấy chuyển nhiều lần với môi trýờng MS + 30g saccarose/l + 6.5g agar/l, pH là 5.7

Cấy chuyển tới khi cây đạt tiêu chuẩn nhất định, tăng nồng độ đýờng tới 60g saccarorose + 6.5g agar/l, pH = 5.7

 Tiến hành bảo quản trong phòng nuôi:

+ Nhiệt độ phòng nuôi: 10 0 C + Thời gian chiếu sáng: 16h + Cýờng độ chiếu sáng: 1800lux + Độ ẩm phòng nuôi: 50 – 60%

Nhờ tăng nồng độ đýờng từ 30g/l đến 60g/l kết hợp với nhiệt độ phòng nuôi thấp, thời gian và cýờng độ chiếu sáng thấp…, thời gian cấy chuyển giống Lilium Formolongo đã tăng từ 4 tuần lên đến 10 tuần.

III Kết luận

Bảo quản invitro đặc biệt có giá trị với những cây trồng sinh sản hữu tính, nhýng hạt của chúng không thể bảo quản đýợc ở ẩm độ, nhiệt độ thấp và cây trồng nhân giống vô tính, việc duy trì chúng trên đồng ruộng đang có nhiều nguy cõ mất giống.

Ở nýớc ta, công tác bảo quản invitro đã býớc đầu tiến hành có kết quả đối với một số cây trồng nhân giống vô tính trong nông nghiệp Nhýng nhu cầu phát triển sử dụng, bảo quản invitro rất lớn Do đó cần phải lựa chọn một chiến lýợc bảo quản thích hợp, sử dụng những thành tựu của công nghệ sinh học, phát triển những giải pháp mới, nuôi cấy bảo quản invitro để hỗ trợ các phýõng pháp cổ truyền nhý ngân hàng gen hạt và trên đồng ruộng nhằm bảo quản tốt hõn nguồn tài nguyên của chúng ta.

bào trong đó vật chất chính là các thông tin di truyền chứa trong nhân của tế bào đã quyết định mọi đường hướng của quá trình thực hiện tính toàn năng của tế bào Vì thế,hoàn toàn có thể nuôi cấy tạo cây hoàn chỉnh từ khối nguyên sinh chất chứa nhân của tế bào

Từ đấy đưa đến khái niệm nuôi cấy tế bào trần thực vật

Tế bào trần được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực thí nghiệm từ nghiên cứu những tính chất vật lý của màng sinh chất đến những nghiên cứu nhập bào và hấp thu các phần tử, các bào quan và vi sinh vật

Protoplast

1.Khái niệm về Protoplast

Protoplast là các tế bào trong đó có thành tế bào được loại bỏ và màng tế bào chất

là lớp ngoài cùng nhất trong tế bào

Protoplast có thể thu được bằng enzyme lytic cụ thể để loại bỏ vách dung hợp

 Tế bào trần có thể được tạo ra bằng nhiều cách: từ dịch huyền phù tế bào, tế bào

mô sẹo hoặc từ mô tươi nguyên trạng như lá qua tác động của các enzym; Pectinase phân hủy pectin, cellulas phân hủy hemicellulose Các tế bào trần nếu để trên môi trường dinh dưỡng thì sau 5-10 ngày sẽ tạo vách tế bào và phân chia

Các tế bào trần, thậm chí khác loài,có thể kết hợp với nhau tạo tế bào lai và quan trình này gọi là sự dung hợp tế bào trần

2 Tại sao cần phải nuôi cấy tế bào trần ?

 Nuôi cấy tế bào trần sẽ mở ra 1 mô hình hấp dẫn để theo dõi quá trình sinh phôi

từ 1 tế bào cô lập Đặc biệt biết được sự sắp xếp các sợi Xenluloz để xác định hướng kéo dài tế bào, vị trí và hướng của mặt phẳng phân chia

 So với các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào khác, nuôi cấy dung hợp tế bào trần giúp tạo ra các cơ thể lai mang các đặc điểm di truyền của các bố mẹ có nguồn gen khác xa nhau mà lai hữu tính không thể thực hiện được

3.So sánh đặc điểm nuôi cấy tế bào trần với nuôi cấy các tế bào vẫn còn thành tế bào:

 So với quy trình nuôi cấy mô tế bào bình thường thì nuôi cấy tế bào trần thường yêu cầu 1 số thay đổi do bản chất của tế bào trần Các thay đổi thường liên quan đến sự điều chỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào các hợp chất hữu cơ, vitamin, đường để đảm bảo khả năng thẩm thấu và chất điều tiết sinh trưởng để kích thích sự phân chia tế bào

 Nuôi cấy tế bào trần có nhiều ưu thế hơn so với nuôi cấy các tế bào vẫn còn thành

tế bào

 Ưu thế của kĩ thuật nuôi cấy và tách tế bào trần là tế bào không có màng cứng, ở trạng thái đơn bào, mật độ tế bào thu được trên một một đơn vị thể tích môi trường có thể rất cao (đạt 106 tế bào/ 1ml môi trường)

 Tế bào trần ở một số cây trồng có khả năng tái sinh rất mạnh, ví dụ tế bào mô thịt

lá ở thuốc lá, cải dầu… Bằng thao tác di truyền ở tế bào trần có thể dễ dàng tạo ra các tế bào biến đổi gen Tế bào với kiểu gen biến đổi sẽ được bảo tồn khi tái sinh tế bào thành cây hoàn chỉnh Điều này rất khó thực hiện ở các tế bào vẫn còn thành tế bào

 Nuôi cấy tế bào trần cho phép khả năng biến nạp các gen thuận lợi vào tế bào thực vật mà trước kia thường bị vỏ tế bào ngăn cản

 Nuôi cấy tế bào trần cho phép khả năng dung hợp tế bào – gắn hai tế bào trần lại thành một tế bào với hai bộ thông tin di truyền của hai tế bào tạo nên một thể lai vô tính

mà không cần hiểu biết chính xác về sự liên hệ giữa các gen, ít tốn kém, nhanh,trực tiếp

và áp dụng các kĩ thuật chuyển gen( bơm AND, hóa thẩm, điện thẩm…)giúp loại trừ tính

bất thụ hữu tính, tạo cây lai hữu thụ; Giúp chuyển những đặc tính có lợi vào cây trồng, ít đòi hỏi phương tiện phức tạp.

 Tế bào lai thu được từ việc dung hợp hai tế bào trần được tái sinh và thành một cây lai Quá trình này xảy ra ở tế bào nên gọi là lai tế bào và thông qua tế bào soma nên gọi là lai soma hay lai vô tính tế bào Từ phương pháp này đẻ ra phương pháp lai xa giữa các loài- điều không thể thực hiện bằng phương pháp lai hữu tính thông thường

 Tuy nhiên quá trình nuôi cấy protoplast còn tồn tại một số trở ngại đó là:

 Quá trình cô l ập nuôi c ấy ph ải hoàn thi ện

 Chưa có phương pháp hi ệu qu ả đ ể tuy ển ch ọn các s ản ph ẩm phù h ợp

4 Kĩ thuật tách tế bào trần:

 4.1 Phương pháp cơ học:

 Phương pháp này dựa trên cơ sở phá các mối liên kết của mô bằng các dao sắc nhọn ( sharp-edged knife) và giải phóng các protoplast riêng rẽ Phương pháp này cho hiệu suất thấp

 Hỗn hợp enzyme thường dùng là enzyme celluloza và macerozim được chiết xuất

từ nấm Trichdearina virde và Aspergillus niger và đã được sản xuất công nghiệp Nồng

độ dung dịch enzyme sử dụng tùy thuộc đối tượng Các hỗn hợp enzyme thường được sử dụng ở pH 5,5 – 5,8 trong 3-8h

 Ngoài ra để protoplast không bị vỡ sau khi thành cellulose bị phân hủy người ta phải bổ sung những chất tăng áp lực thẩm thấu vào dung dịch enzyme để duy trì cân bằng thẩm thấu giữa nội bào và môi trường bên ngoài Các dung dịch thường dùng là dung dịch đường manitol, sorbitol Nồng độ sử dụng khoảng 0,3 – 0,7M tùy theo đối tượng thực vật

 So với phương pháp cơ học thì phương pháp này có hiệu quả cao hơn rất nhiều Phương pháp enzyme cho phép tách được hàng gram protoplast Có thể thu được từ 1 gam lá cỏ luzec hoặc khoai tây là 6-12 triệu tế bào trần

 Vì protoplast thực chất là tế bào trần không có thành cho nên có thể tách được từ nhiều nguồn khác nhau như các bộ phận của cây ( rễ, lá, hạt phấn), callus, tế bào đơn…Xác định chất lượng tế bào trần

 Sau khi phá vỏ tế bào vẫn có những mảnh thành tế bào còn xót lại làm ảnh hưởng đến những nghiên cứu sau này

 Cách tốt nhất để phát hiện thành tế bào là dùng calcofluor, một hóa chất sẽ bám vào phân tử xenlulozo và gây ra phát ánh sáng huỳnh quang với màu xanh rực rỡ khi soi dưới tia cực tím Nếu các tế bào trần đã bị loại bỏ hoàn toàn thành tế bào hiển vi trường

có màu tối thẫm các tế bào trần sẽ không nhìn thấy được ngoại trừ sự tự phát ánh sáng huỳnh quang đỏ của các lạp thể

Còn một phương pháp khác là dùng kính hiển vi huỳnh quang kết hợp với nhuộm xanh Evan để xác định sức sống của tế bào trần Những tế bào còn nguyên vẹn sẽ ngăn không

cho thuốc nhuộm xâm nhập vào nguyên sinh chất ngược lại các tế bào có màng sinh chất

bị mất chức năng sẽ bắt màu xanh và chúng không thể sinh trưởng được

5 Nuôi cấy tế bào trần

 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy

- Thành phần của môi trường nuôi cấy lỏng hay đặc tùy thuộc vào vật liệu thực vật.Môi trường này có thêm Auxin và Xitokinin để giúp sự tái tạo vách và các lần phân chia đầu tiên

- Đảm bảo đủ các yếu tố dinh dưỡng: axit amin, polyamin, Hydrolysat Cazein, nước dừa, mạch nha…

- Đảm bảo điều kiện nhiệt độ, PH, ánh sáng,áp suát thẩm thấu…

- Trong lần tự nhân đôi đầu tiên, môi trường phải có áp suất thẩm thấu cao,

Auxin, Xitikinin thích hợp, ánh sáng yếu Sau đó cần giảm áp suất thẩm thấu bắng cách pha loãng môi trường để giúp cho sự tăng trưởng tế bào

Khi mô sẹo được hình thành cần chuyển chúng vào trong môi trường rắn chứa Auxin ở nồng độ thấp hơn và Xitokinin cao hơn Sau cùng kích thích ra rễ cần loại Xitokinin, tăng nồng độ Auxin

Nuôi cấy tế bào trần chia làm 2 giai đoạn

Giai đoạn 1

 Từ tế bào trần tao thành tế bào, phân chia tạo thành microcallus

 Sau một thời gian nuôi cấy một đến hai tuần các tế bào trần tái tạo vỏ và phân chia tạo nên các microcallus

 Điều kiện nuôi cấy

 Nuôi trong môi trường lỏng lắc

 Lớp nuôi trợ dưỡng: tế bào trần, lớp xốp có khả năng thấm từ dưới lên, callus từ

mô tế bào mà từ đó tách tế bào trần,agar

Nuôi trong điều kiện ánh sáng yếu, nuôi tối

Ánh sáng thẩm thấu đẳng trương

Thời gian nuôi từ 1 đến 2 tuần

Giai đoạn 2

 Microcallus thành callus ổn định hình thành phát sinh cơ quan

 Chuyển các microcallus lên môi trường cứng, chúng sẽ tạo thành các mô sẹo Từ

đó chuyển sang môi trường tái sinh chồi và cây hoàn chỉnh

 Điều kiện nuôi cấy

 Nuôi cấy trên môi trường đặc

 Chú ý tới ánh sáng và quang chu kì

 Có chất điều tiết sinh trưởng cho qua trình tái sinh cây

 Loại bỏ chất gây ánh sáng thẩm thấu

Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của tế bào trần

 Nuôi cấy tế bào trần thường yêu cầu 1 số thay đổi so với quy trình nuôi cấy mô bình thường do bản chất của tế bào trần

 Các thay đổi thường liên quan đến sự điều chỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào các hợp chất hữu cơ, vitamin, đường để đảm bảo khả năng thẩm thấu và chất điều tiết sinh trưởng để kích thích sự phân chia tế bào

6 Dung hợp tế bào trần

 Có thể nói việc dung hợp tế bào trần và tái sinh thành cây lai từ tế bào trần là 1 trong những thành tựu tuyệt vời của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào Bằng phương pháp này

đẻ ra phương pháp lai xa giữa các loài điều mà không thể thực hiện bằng các phương pháp lai hữu tính thông thường.

Tế bào trần là những tế bào không có thành tế bào Chính vì thế chúng có thể hòa lẫn vào nhau (dung hợp) và thành 1 tế bào lai mang trong mình vật chất di truyền của cả 2 tế bào

 Tế bào lai này được tái sinh và thành 1 cây lai Quá trình này xảy ra ở tế bào nên gọi là lai tế bào và thông qua tế bào soma nên gọi là lai soma hay lai vô tính tế bào

Sơ đồ chọn lọc các thể lai soma bằng cách ứng dụng sự mẫn cảm khác nhau của các protoplast thịt lá đối với actinomycin D

Có 2 phương pháp dung hợp tế bào trần:

+ Dung hợp bằng hóa chất

+ Dung hợp bằng điện Dung hợp bằng hóa chất

 Xử lý bằng NaNO3

 Năm 1970, Power và cộng sự đã dùng NaNO3 (0,25 M) kích thích dung hợp hai protoplast Carlson và cộng sự (1972) cũng dùng phương pháp này để sản xuất cây lai soma đầu tiên (Nicotiana glauca × N langsdorffii) Tuy nhiên, phương pháp này cho hiệu suất thấp vì NaNO3 không thích hợp với tế bào bị không bào hóa mạnh như protoplast từ nhu mô lá

 Xử lý bằng PEG

Thường sử dụng poly ethylenglycol(PEG 5-25%) là chất có tác dụng dính kết tế bào trần dể dung hợp chúng Nồng độ và trọng lượng phân tử của PEG quyết định sự thành công của thí nghiệm dung hợp PEG có trọng lượng phân tử thấp (~ 100) không thể tạo ra một sự dính

chặt chắc chắn, trong khi PEG trọng lượng phân tử 6000 cho hiệu quả dung hợp cao hơn

Xử lý PEG cùng với pH/Ca2+ có hiệu quả tăng tần số dung hợp và khả năng sống của các

protoplast

Quá trình dung hợp sẽ được cải thiện hơn nếu xảy ra trong môi trường kiềm (pH

từ 8- 10) và khi có bổ sung CaCl2 (50-250 mM)

Sau khi xử lý bằng tác nhân dung hợp, các protoplast được nuôi cấy theo phương thức chuẩn

 Phương pháp này đơn giản hơn, nhanh hơn và hiệu quả hơn dung hợp bằng hóa chất Điều quan trọng hơn cả là dung hợp bằng điện (electrofusion) không gây độc đối với tế bào như thường thấy ở các protoplast hoặc các thể dị nhân được xử lý bằng PEG Người ta đã dùng các xung điện (electric pulses) để đưa trực tiếp DNA ngoại lai vào trong tế bào thực vật, kỹ thuật này đã làm tăng sự quan tâm về việc ứng dụng dung hợp bằng điện vào lĩnh vực di truyền tế bào soma

Cách tiến hành

 Đưa dung dịch hỗn hợp tế bào trần(2 bản cực được thiết kế trong các hộp dung hợp), các tế bào trần sẽ lần lượt sắp xếp thành chuỗi nằm giữa 2 bản cực Khi có 1 xung điện cao (750-1000V) trong 1 thời gian rất ngắn(1-200 mili giây) vùng tiếp xúc giữa 2 màng tế bào sẽ bị vỡ, 2 tế bào trần hòa nhập vào nhau-quá trình dung hợp sẽ xảy ra

7 Triển vọng ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần và lai tế bào soma

Mặc dù những khó khăn về mặt kĩ thuật đã làm hạn chế tiềm năng sử dụng tế bào trần tuy nhiên tế bào trần vẫn được ứng dụng trong một số lĩnh vực nghiên cứu:

Sau khi loại bỏ thành tế bào và được nuôi cấy trên môi trường thích hợp những tế bào trần được tái tạo nhanh chóng thành tế bào mới và quá trình phát triển này đã đưa ra một hệ thông lý tưởng cho nghiên cứu sinh tổng hợp thành tế bào (Willison và Cocking, Grout 1973)

 Các tế bào trần có khả năng tiếp nhận các vật liệu từ bên ngoài đưa vào trong tế bào do đó tế bào trần là đối tượng thích hợp cho các nghiên cứu đưa nhân lạp thể, ti thể,DNA, Plasmit vào tế bào (Dodds và Bengochea 1985)

 Quần thể tế bào trần có thể được xem như một hệ thống tế bào đơn và bởi vậy các thao tác tương tự như đối với các vi sinh vật qua đó có thể lựa chọn dòng đột biến và tách dòng quần thể tế bào thực vật (Evans và Cocking 1977)

Một số ứng dụng khác :

 Sản xuất các dòng bố mẹ phục vụ sản xuất hạt lai

 Sản xuất các hợp chất thứ cấp qua nhân sinh khối tế bào trong môi trường lỏng (nuôi lắc, nuôi trong bioreactor)

 Công nghệ nuôi cấy tế bào trần ứng dụng cho những cây có giá trị kinh tế

cao,nhưng khó nhân giống bằng phương pháp thông thường

 Công nhệ này làm nhân nhanh giống và kết hợp làm sạch virus Nghiên cứu tạo giống khoai tây kháng bệnh virus của GS.TS Nguyễn Quang Thạch trường ĐHNN Hà Nội

 Bảo quản nguồn gen

 Nhờ kỹ thuật dung hợp người ta có thể lai tạo giữa hai loài thực vật khác nhau, thậm chí cả các loài thuộc những chi khác nhau Điển hình nhất là việc dung hợp tế bào cây khoai tây với tế bào cây cà chua Kết quả là tạo ra được cây lai Pô-ma-tô mà trên mặt đất cho quả cà chua còn dưới mặt đất cho củ khoai tây (!)

Đây là sự dung hợp 2 tế bào trần khác loài tạo tế bào lai chứa bộ NST của 2 tế bào gốc Tạo được cây lai từ tế bào khoai tây & cà chua

 Nuôi 2 dòng tế bào sinh dưỡng khác loài trong cùng 1 môi trường, có sự kết dính ngẫu nhiên của 2 hay 1 số tế bào khác loài của tế bào lai chứa bộ NST của 2 tế bào gốc

 Để tăng tỉ lệ kết dính; keo hữu cơ; xung điện cao áp

Dùng hócmôn kích thích tế bào lai phát triển thành cây lai

 Với phương pháp này có thể tạo ra những cơ thể có nguồn gen khác xa nhau mà lai hữu tính không thực hiện được

 Kỹ thuật dung hợp tế bào trần cho phép mở rộng nguồn gen của các loài thực vật tạo ra các dòng tế bào sản xuất mới mang các đặc tính di truyền ưu việt của cả bố và mẹ

 Nhiều cây lai được tạo ra bằng phương pháp dung hợp tế bào đã có được năng lực chống cỏ dại hoặc chống nấm bệnh

Tạo điều kiện thuận lợi cho sự nghiên cứu về sinh lí tế bào: tính thấm của màng, vận chuyển các chất hòa tan, ion, cơ chế hoạt động của hoocmon thực vật…

Một ứng dụng đầy triển vọng khác của nuôi cấy tế bào trần là vi nhân giống thực vật Sau khi phân chia protoplast, thành tế bào được tái sinh để tăng sự phát triển callus và tiếp theo là cây hoàn chỉnh nhờ đó thực vật có thể được nhân lên nhiều lần

 Nuôi cấy tế bào trần đòi hỏi sự sinh trưởng của protoplast trên môi trường đặc hoặc lỏng Từ đó các protoplast được phân lập có thể được sự dụng để:

• Biến đổi thông tin di truyền của tế bào thực vật

• Tạo ra cây lai vô tính thông qua dung hợp tế bào trần

• Nghiên cứu sự xâm nhiễm của virus ở thực vật và những vấn đề khác

8 Tồn tại của kỹ thuật protoplast

 Kỹ thuật protoplast đã thu được thành công ở các loài thuộc họ cà (Solanaceae) và một số họ khác, nhưng thành công ở họ hòa thảo (Poaceae) là họ của các cây trồng ngũ cốc chính còn rất hạn chế

 Potrykus (1980) đã thảo luận rất kỹ về vấn đề này Theo Potrykus có những chỉ tiêu sau liên quan đến kết quả nuôi cấy và tái sinh từ protoplast tiềm lực in vitro

1 Phân lập

- Cơ sở di truyền của tế bào (khả năng tiềm tàng của tế bào trong nuôi cấy in vitro)

- Tương tác tế bào trong cây

- Sự phân hóa trong quá trình phát triển cơ thể

- Nguồn gốc cơ quan và cây hoàn chỉnh

- Trạng thái sinh lý của tế bào

- Tác động của quá trình phân lập

- Tác động của trạng thái phân lập

2 Điều kiện nuôi cấy

- Nhu cầu dinh dưỡng

- Nhu cầu về phytohormone

- Điều kiện vật lý của nuôi cấy

- Các yếu tố ức chế có thể xuất hiện

- Tác động của mật độ quần thể tế bào

3 Sự phân bào

- Sinh tổng hợp thành tế bào

- Điều khiển sinh tổng hợp thành tế bào

- Chức năng của thành tế bào đối với phân bào

- Điều khiển sự phản phân bào

- Điều khiển sự phân chia nhân

- Điều khiển phân bào

4 Sự phân hoá

- Điều khiển phân hóa tế bào

- Tương tác tế bào trong nuôi cấy

- Điều khiển và cơ chế tạo kiểu mô

- Điều khiển quá trình tạo cơ quan, phôi

9 Quy trình cụ thể minh họa việc nuôi cấy và dung hợp tế bào trần

Quy trình nuôi cấy Protolast từ lá của cây thuốc lá

9.1 Nguyên liệu thực vật

Lá cây:

Lá là nguồn nguyên liệu thông dụng và truyền thống cho kĩ thuật protoplast thực vật do

nó cho phép phân lập được một số lớn các tế bào tương đối đồng nhất

 Phương pháp cơ bản để tách protoplast từ lá cây:

 Các bước phân lập protoplast từ lá cây

9.2 Chuẩn bị môi trường

 Dung dịch enzyme tách protoplast:

 Các mẫu lá thuốc lá in vitro được loại bỏ hết gân lá và đặt lên đĩa petri thủy tinh

vô trùng Dùng dao cấy băm nhỏ các mảnh lá

 Cho các mảnh lá đã băm nhỏ vào cốc đong vô trùng loại 50 ml bổ sung 10 ml dung dịch enzyme tách protoplast Bọc cốc đong bằng giấy parafilm, ghi nhãn và đặt trong tối qua đêm trên máy lắc ở tốc độ thấp (khoảng 40 vòng/phút)

 Bổ sung thêm 2 ml dung dịch rửa để rửa proptoplast hết khỏi lưới lọc l Chuyển hỗn hợp protoplast-enzyme (tổng cộng 15 ml) vào tube ly tâm loại 15 ml và ly tâm 50×g trong 10 phút

 Loại bỏ phần dịch nổi phía trên, tái huyền phù tiểu thể bằng 10ml dung dịch tách (PI + 20% sucrose), thêm 1ml dung dịch rửa lên trên bề mặt dung dịch tách và protoplast sao cho không làm hòa lẫn hai dung dịch, tốt nhất là tạo thành hai pha (nhỏ từ

từ dung dịch rửa bên thành tube tránh bắn tung toé lên dịch rửa bên dưới), ly tâm 50×g trong 10 phút Các protoplast sống sót sẽ nằm ở trên bề mặt dung dịch

 Dùng micropipette hút lớp protplast màu xanh lục nổi trên tube ly tâm và chuyển

nó sang một tube ly tâm sạch, thêm 10 ml dung dịch rửa và ly tâm lại Protoplast sẽ lắng xuống đáy tube và có dạng viên

 Rửa protoplast thêm một lần nữa trong 10 ml dung dịch rửa Loại bỏ phần nổi trên mặt và tái huyền phù protoplast trong khoảng chừng 1 ml môi trường nuôi cấy protoplast (PC)

 Đặt một giọt protoplast trên buồng đếm hồng cầu và ước lượng mật độ protoplast (số lượng tế bào/số ô đếm ×10.000) Nuôi cấy protoplast bằng cách pha loãng 50.000 tế bào/ml môi trường nuôi cấy protoplast và chuyển sang một đĩa petri vô trùng

Bọc lại, ghi nhãn và nuôi cấy qua đêm trong tối ở 28oC

 Ngày thứ ba

Chuyển sang nuôi cấy ở ánh sáng yếu (10-20 µmol.sec/m2 hoặc bọc một lớp vải thưa dưới đèn hùynh quang ánh sáng trắng, với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ, nuôi trong 2 ngày

KẾT LUẬN

 Kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần đã bắt đầu được ứng dụng rộng rãi để tạo ra các cây trồng mới hoặc có sản lượng hay chất lượng cao hơn, hoặc là có thêm khả năng kháng bệnh Việc giới thiệu về quy trình sử dụng enzyme để cô lập tế bào trần thực vật (Cooking 1960) đã đưa ra một bộ mặt mới đầy hứa hẹn cho tế bào thực vật và nuôi cấy mô, mở ra một lĩnh vực mới trong sinh học tế bào thực vật Điều làm cho tế bào trần

có tác động mạnh như một hệ thống thí nghiệm đó là hệ enzyme phân hủy vách tế bào làm lộ ra bề mặt màng tế bào như là một rào cản giữa môi trường bên ngoài và thành phần bên trong tế bào Sự tiếp cận đến màng sinh chất có ý nghĩa là thí nghiệm có thể được thiết lập để nghiên cứu và thao tác trên các thuộc tính của màng tế bào điều mà không thể thực hiện được khi bị bao phủ bởi vách tế bào Tế bào trần được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực thí nghiệm từ nghiên cứu những tính chất vật lý của màng sinh chất (Ruesink 1973) đến những nghiên cứu nhập bào và hấp thu các phần tử (Willison et

al 1971), các bào quan (Potrykus 1975) và vi sinh vật (Davey và Power 1975)

Kỹ thuật thụ phấn và nuôi cấy phôi invitro

 Thụ phấn (pollination) là sự tiếp nhận các hạt phấn từ bao phấn tới núm nhụy để thực hiện thụ tinh ở hoa Ở thực vật có hai phýõng thức thụ phấn là thụ phấn chéo và tự thụ phấn

 Th ụ tinh (fertilization): Ở th ực v ật th ụ tinh là s ự k ết h ợp c ủa hai giao t ử đ

ực và cái (tinh trùng và noãn) thành h ợp t ử (phôi, bào t ử ho ặc h ạt) là đ ặc trýng cõ b

ản c ủa sinh s ản h ữu tính, sinh s ản lý ỡng tính Ở th ực v ật h ạt kín có phýõng th ức th

ụ tinh kép

 Phôi là một nhóm tế bào có khả năng phát triển tạo thành cõ thể hoàn chỉnh là pha phát triển trung gian giữa hợp tử hay tế bào soma và bào tử thể

 Có hai loại phôi: phôi hữu tính & phôi vô tính ( phôi soma)

 Phôi hữu tính : là phôi trong hạt đýợc tạo ra do thụ tinh giữa tế bào trứng và giao

tử đực (do lai hoặc tự thụ) còn gọi phôi hợp tử

 Phôi soma: là phôi đýợc phát sinh từ tế bào sinh dýỡng 2n chỉ của bố hoặc mẹ và

tế bào ấy có cấu trúc nhý một phôi gọi là phôi vô tính ( phôi soma)

 Thụ phấn invitro là thực hiện quá trình thụ phấn trong ống nghiệm không phụ thuộc vào cõ thể mẹ

 Nuôi cấy phôi (cứu phôi) là sự tách rời và nuôi cấy invitro phôi hợp tử đã thành thục hoặc chýa thành thục thành cây hoàn chỉnh

II Kỹ thuật thụ phấn invitro

 Điều kiện cõ bản là phải nuôi cấy thành công bầu quả hay noãn phân lập (noãn trần) của cây mẹ.

 Chủ động điều khiển quá trình nảy mầm của hạt phấn cây bố trong môi trýờng nuôi cấy vô trùng

 Tiến hành thụ phấn để sự thụ tinh diễn ra và nuôi cấy hợp tử phát triển thành phôi lai trên môi trýờng dinh dýỡng vô trùng

II.4.1 Thụ phấn bằng phýõng pháp cắt ngắn vòi nhụy

 Là phýõng pháp dễ và hiệu quả Núm nhụy và 1 phần hoặc toàn bộ vòi nhụy của hoa đýợc cắt ngắn, sau đó hạt phấn của cây bố đýợc thụ trực tiếp lên vòi nhụy đã cắt ngắn

và kết quả là có rất nhiều ống phấn đã kéo dài đýợc tới bầu nhụy

 Nhýợc điểm: số lýợng hạt trong 1 quả ít Có thể do ống phấn gặp khó khăn trong khi đâm xuyên qua vách bầu

II.4.2 Thụ phấn bằng phýõng pháp ghép vòi nhụy

 Hạt phấn cần thụ đýợc “gửi” trên 1 núm nhụy thích hợp và nảy mầm, 1 ngày sau vòi nhụy và 1/3 bầu của hoa chứa hạt phấn đýợc cắt và ghép lên 3/4 bầu nhụy của hoa cây mẹ cần thụ phấn

 Theo Vantuyl và cộng sự(1991) thì một ngày sau khi “gửi” hạt phấn vòi nhụy đýợc cắt ngắn cách trên bầu 1-2mm và đýợc gắn lên bầu nhụy của hoa cây mẹ Bầu và vòi nhụy ngoài đồng ruộng đýợc kết hợp với nhau = ống nối còn trong invitro chỉ cần sử dụng agar để cố định là đủ

II.4.3 Thụ phấn cho giá noãn

 Bầu đýợc cắt theo chiều dọc thành nhiều miếng vào ngày núm nhụy tiết ra dịch nhầy hoặc 1-2 ngày sau đó Mỗi 1 miếng sẽ chứa 1 giá noãn và 1 hàng noãn, có thể để lại hoặc không để lại vách bầu Một lýợng lớn hạt phấn cần thụ đýợc đặt theo giá noãn Để kích thích hạt phấn nảy mầm và đâm xuyên vào noãn có thể đặt vào môi trýờng nuôi cấy

1 hay 2 vòi nhụy

 Có thể nuôi cấy ngoài sáng hay trong tối Noãn nảy mầm sau 5-7 tuần thụ phấn và tiếp tục đýợc thụ phấn

 Thụ phấn bên trong bầu (intraovarian pollionation): cả vòi nhụy hoặc 1 phần của

nó có thể đýợc tách ra và hạt phấn hoặc đýợc đặt trên bề mặt vết cắt bầu quả hoặc chuyển qua lỗ trên thành vòi nhụy đến bầu quả

III Kỹ thuật cứu phôi

 Nuôi cấy phôi hữu tính

 Các yếu tố ảnh hýởng

 Ứng dụng

III.1 Mục đích

 Khắc phục sự bất hợp sau thụ tinh

 Khắc phục sự bất hợp giữa nội nhũ và phôi khi lai xa

 Tạo cây đõn bội (lúa mì x ngô, lúa mỳ x yến mạch dẫn đến sự loại bỏ một bộ nhiễm sắc thể)

 Ngăn ngừa sự thui chột phôi ở những loại quả hạch chín (đào, mận, mõ…)

 Phá ngủ nghỉ, rút ngắn chu kỳ tạo giống…

III.2 Nuôi cấy phôi hữu tính

 Sự phát sinh phôi hữu tính:

-Xảy ra quá trình thụ tinh giữa hạt phấn và noãn hình thành hợp tử

-Hợp tử trải qua quá trình nguyên phân liên tiếp tạo thành phôi

 Nuôi cấy phôi hữu tính gồm

-Ở thực vật hoa dạng chùm, mô non thýờng xếp ở đỉnh của chùm hoa

 Trong quá trình thu nhận phôi cần hạn chế sự tổn thýõng của dây treo phôi Dây treo phôi có kích thýớc nhỏ và cấu trúc mỏng manh nên khó tách nó nguyên vẹn cùng với phôi để đýa vào nuôi cấy Không có dây treo phôi làm giảm đáng kể tỉ lệ hình thành cây con từ nuôi cấy phôi non

III.2.2 Thành phần môi trýờng nuôi cấy

Sau khi tách từ hạt phôi đýợc nuôi cấy trong môi trýờng chứa:

Chất điều hoà sinh trýởng

 Auxin và cytokinin không đýợc sử dụng nhiều trong nuôi cấy phôi do chúng cảm ứng tạo callus

 Ở nông độ rất thấp (0.01 mg/ l) GA3 kích thích sự nảy mầm sớm của phôi

Nguồn carbon

 Đýờng: là thành phần không thể thiếu trong mọi môi trýờng nuôi cấy, vì nó

là nguồn cung cấp Cacbon chủ yếu Trong nhiều trýờng hợp đýờng sucrose cho kết quả tốt hõn các đýờng khác Nồng độ sucrose có thể dùng từ 0.5% đến 18%.

 Glucose và sucrose ngoài vai trò dinh dýỡng, còn có khả năng duy trì áp suất thẩm thấu của môi trýờng Phôi trýởng thành sinh trýởng khá tốt ở nồng độ thấp nhýng phôi non đòi hỏi nồng độ sucarose cao hõn.

Aminoaxit và thành phần hữu cõ phức hợp

 Glutamin là a.a hiệu quả nhất đối với nuôi cấy phôi nhiều loài thực vật

 Cazein thuỷ phân(CH) (Ziebur & Brink, 1951) là hỗn hợp các a.a đýợc sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy phôi Làm tăng kích thýớc và tỷ lệ phân hoá phôi

 Ngoài ra một số chất tự nhiên nhý nýớc dừa (Overbeek, 1942), nýớc chiết malt (Blackeslee & Satina, 1944), là những chất mà khi đýợc bổ sung vào môi trýờng nuôi cấy

sẽ đem lại hiệu quả cao hõn… vì trong các chất này có chứa nhiều vitamin, DNA, RNA,

và một số chất điều tiết sinh trýởng khác

 Các phôi tách rời sinh trýởng tốt trên môi trýờng có pH 5.0-7.5

 Đây là phạm vi pH của dịch noãn (6.0)

III.3.2 Nhiệt độ

 25±2°C thích hợp cho sinh trýởng và nảy mầm của phôi

 Nhiệt độ tối ýu cho nuôi cấy phôi có thể khác nhau giữa các genotype trong cùng

1 loài

 VD: Loài Zamia, Phaseolus, bông: 27-30°C

Loài lai Brassica, lúa, lúa mạch: 17-22°C

III.3.3 Ánh sáng

 Khi nuôi cấy phôi chýa trýởng thành của lúa mạch, lanh, các cá thể loài lai Allium

tiến hành trong tối trýớc khi chuyển sang điều kiện sáng để nảy mầm

III.4 Ứng dụng của nuôi cấy phôi hữu tính

 Thu nhận thể đõn bội

 Kiểm tra nhanh sức nảy mầm của hạt

 Nhân giống các cây hiếm

 Thụ phấn trong ống nghiệm

III.4.1 Thu nhận thể đõn bội Nuôi cấy phôi hữu tính để thu nhận các thể đõn bội thông qua quá trình loại bỏ trực tiếp NST sau khi lai xa Tổ hợp giữa hai loài càng khác xa nhau thì sự đào thải hoàn toàn NST đõn bội của một loài càng dễ xảy ra

III.4.2 Kiểm tra nhanh sức nảy mầm của hạt

Nuôi cấy phôi hữu tính đýợc dùng để kiểm tra nhanh khả năng nảy mầm của hạt, đặc biệt là các hạt giống có sức sống kém và hạt sau thời gian bảo quản dài Phýõng pháp này cho độ chính xác cao

III.4.3 Nhân giống các cây hiếm

Hạt của một số cây rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên, vì vậy làm giảm khả năng sinh sản hữu tính của chúng Bằng cách nuôi cấy phôi tách rời

đã thu đýợc rất nhiều cây con Áp dụng với loài mà hạt có sức sống kém, hạt không

có nội nhũ hoặc ít nội nhũ.

VD: đối với các loài phong lan hạt của chúng rất nhỏ và không có nội nhũ vì vậy khả năng này mần của hạt là rất thấp vì vậy bằng phýõng pháp nuôi cấy phôi ta sẽ làm tăng tỉ lệ nảy mầm của phong lan.

III.4.4 Thụ phấn trong ống nghiệm

 Một số rào cản đối với quá trình thụ tinh:

 Hạt phấn không có khả năng nảy mầm trên núm nhụy loài khác

 Ống phấn không tiếp cận đýợc noãn vào thời điểm thích hợp

 Vỡ ống phấn trong vòi nhụy

 Những rào cản đó có thể đýợc výợt qua bằng kĩ thuật thụ phấn trong ống nghiệm

IV.1 Ví dụ về thụ phấn invitro và cứu phôi

Thụ phấn invitro cứu phôi trong lai tạo giống hoa Lily ở Việt Nam

 Hiện nay, ở Việt Nam lily đýợc xếp vào loại hoa cao cấp, tiềm năng thị trýờng rất lớn

 Tuy nhiên các giống hoa lily có mặt trên thị trýờng Việt Nam hiện nay chủ yếu là nhập nội từ Trung Quốc, Nhật Bản và Hà Lan với giá thành cực cao, thêm vào đó một số giống nhập nội từ Trung Quốc rất nhanh bị thoái hóa do chất lýợng giống kém…

 Vấn đề đặt ra là chúng ta phải nhanh chóng chủ động về giống đối với loại hoa quý này

IV.1.1 Thí nghiệm thụ phấn invitro

 Chọn nụ hoa trýớc khi nở 1-2 ngày, khử trùng: rửa sạch bụi đất bằng nýớc thýờng trýớc khi đýa vào buồng cấy, khử trùng bằng cồn Ethanol trong 30giây, tráng lại = nýớc cất vô trùng, tiếp tục khử= HgCl2 0.1% trong 10 phút, lắc đều mẫu, tráng lại bằng nýớc cất vô trùng 3 lần

 Tách cánh hoa: -Hoa bố: tách lấy bao phấn giữ trong điều kiện vô trùng

-Hoa mẹ: giữ toàn bộ cõ quan sinh sản cái: bầu nhụy, vòi nhụy và núm nhụy Chúng đýợc đạt đứng thẳng trong ống nghiệm hoặc bình, trên nền môi trýờng thụ phấn

 Thụ phấn invitro: có thể sử dụng

- Kỹ thuật thụ phấn cắt vòi nhụy: cắt hết vòi nhụy hạt phấn đýợc thụ ngay tại điểm cắt

- Kỹ thuật ghép vòi nhụy: Hạt phấn bố đýợc thụ trên đầu núm nhụy của hoa bố, 1 ngày sau vòi nhụy của bố đã thụ phấn đýợc cắt phía trên bầu 2mm và gắn vào bầu nhụy nhờ 1 miếng agar

- Kỹ thuât thụ phấn giá noãn: Hạt phấn bố đýợc thu trực tiếp vào hàng giá noãn đýợc tách từ bầu hoa mẹ

IV.1.2 Thí nghiệm cứu phôi

 Sau khi thụ phấn invitro cho các tổ hợp, tiến hành cứu phôi vào các thời điểm khác nhau bằng kỹ thuật nuôi cấy lát cắt bầu nhụy Quả đýợc cắt thành những lát mỏng thành 2-3mm và nuôi cấy trên môi trýờng trên môi trýờng lát cắt bầu nhụy: MS bổ sung thêm 1mg/l α-NAA và 90g/l sucrose

 H ạt đý ợc hình thành v ới t ỉ l ệ phôi trong h ạt cao Sau đó phát tri ển thành cây hoàn ch ỉnh

IV.2 Thí nghiệm cứu phôi hữu tính khoai tây

1 Thu hái các quả khoai tây trýởng thành, khi quả còn màu xanh, khoảng 21 đến 28 ngày sau khi thụ phấn

2 Khử trùng bề mặt quả bằng etanol 90% trong 30s

3 Ngâm quả trong hỗn hợp dung dịch hypoclorit canxi 5% và nýớc cất vô trùng trong 15 phút

4 Trong tủ cấy vô trùng, tiến hành tách hạt từ quả và chuyển sang đĩa petri

5 Bóc vỏ hạt và tách rời phôi

6 Cấy phôi vào đĩa petri đã chứa sẵn môi trýờng dinh dýỡng và nuôi ở nhiệt độ từ 22ºC với ánh sáng yếu

18-7 Các phôi được tách tốt từ hạt sẽ phát triển dần thành cây khoai tây con sau đó có thể chuyển ra trồng trong vườn ươm

Nhìn chung, nguồn gen khai thác từ các loài lily là vô cùng đa dạng, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chọn tạo giống Việc phát triển các phýõng pháp thụ phấn và cứu phôi thích hợp sẽ là công cụ hữu ích tạo ra nhiều giống mới với nhiều đặc tính quý

“Biến dị dòng tế bào soma trong quá trình nuôi cấy invitro”

I Một số khái niệm về biến dị dòng soma

 Biến dị tế bào soma

 So sánh biến dị dòng soma với đột biến

II Phân loại biến dị dòng soma

 Biến dị kiểu gen

 Biến dị kiểu hình

III Nguyên nhân gây biến dị dòng soma

IV Cơ chế tạo biến dị soma

V Ưu điểm và nhược điểm của biến dị dòng soma trong quá trình nuôi cấy invitro

VI Chọn lọc biến dị dòng soma

VII Khả năng ứng dụng và triển vọng

VIII PHÂN LẬP VÀ CHỌN LỌC ĐỘT BIẾN DÂU TẰM BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY INVITRO

 Biến dị dòng soma (somaclonal variation) là khái niệm dùng để chỉ tất cả các biến

dị thể hiện ở các tế bào, mô nuôi cấy và cây có nguồn gốc từ nuôi cấy mô (Larkin và Scowcropt, 1981)

 Biến dị dòng soma còn được gọi là biến dị dòng vô tính

 Biến dị này đã được quan sát ở nhiều loài cây trồng như thuốc lá, khoai tây, cà chua, mía, họ cải… bao gồm đây đủ các tính trạng nông học như chiều cao cây, số nhánh, thời gian sinh trưởng cũng như các tính trạng hóa sinh khác

 Biến dị kiểu gen (genetic or heritable variation)

 Biến dị kiểu hình (epigenetic hay phenotypic variation)

 Là các biến dị có khả năng di truyền, xảy ra với tỷ lệ rất thấp và không có tích thuận nghịch

 Bao gồm 3 loại: Đột biến hệ gen, đột biến NST và đột biến gen (Larkin et all,

1989)

 Là các biến đổi về số lýợng NST Loại phổ biến là sự sai khác về số lýợng NST nhý đa bội, dị bội, hay thể khảm Các loài có độ bội thể cao và nhiều về số lýợng NST

cao dễ bị biến đổi hőn các loài có mức độ bội thể thấp và ít NST (Creissen and Karp,

1985) Biến đổi này xảy ra thýờng xuyên trong nuôi cấy tế bào, đặc biệt trong nuôi cấy tế

bào trần

 Những biến đổi này có thể xảy ra ngay từ giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, do

sự phân tách NST không bình thýờng ở những chu kỳ tế bào đầu tiên

 Hiêňn týőňng khuyêěch đaňi gen cuŢng laĚm thay đôŇi hêň gen Viě duň nhý őŇ coŇ linh lăng đaŢ thu đýőňc doĚng têě baĚo coě mýěc khaěng thuôěc thuốc trừ cỏ photphinotrixin tăng 20 lần so với bình thýờng Thuốc này có tác động ức chế enzyme glutaminsythetase Phân tích cho thấy, gen kiểm tra ezyme này đýợc khuếch đại 4 -11 bản, làm tăng hoạt tính phiên mã lên 8 lần

 Là các biến đổi về cấu trúc NST, các thay đổi này có thể bao gồm các hiện tượng như: Mất đoạn, đảo đoạn, thêm đoạn hay nhân đoạn (Tạo ra các NST lớn hơn), chuyển đoạn và các biến đổi trong quá trình giảm phân

 Những biến đổi này có thể ảnh hưởng tới kiểu hình ở R0 và các thế hệ tiếp theo

 Là các biến đổi ở mức độ phân tử: sự thay đổi của một cặp base, thay đổi về số lýợng bản sao của một trình tự đặc thù, sự thay đổi trong thể hiện của các nhóm đa gen hay sự thể hiện của các gen nhảy(Transposable elements).Sự xuất hiện các đột biến này

về cő bản mang tính ngẫu nhiên

 Những tính trạng đột biến gen thu đýợc ở những cây tái sinh R0 và cũng đýợc di truyền cho các đời sau

 Các biến dị kiểu hình thýờng liên quan đến sự thay đổi trong quá trình thể hiện của một gen nhất định Điển hình là các quá trình khuếch đại và methyl hóa gen Các biến

dị kiểu hình thýờng xuyên xuất hiện ở các cây tái sinh sau nuôi cấy nhý là kết quả của các phản hồi về mặt sinh lý

 Các thay đổi về kiều hình có thể là tạm thời, không có tính di truyền và có thể phục hồi trạng thái ban đầu Tuy nhiên chúng có thể duy trì trong suốt chu kỳ sống của các cây tái sinh

 Nguyên nhân: Có liên quan đến một vài thay đổi trong quá trình biểu hiện gen

 Ví dụ, hiện týợng tăng mạnh mẽ khả năng sinh trýởng của các cây tái sinh khi trồng trên đất Biều hiện này có thể liên quan đến việc trở lại của trạng thái trẻ hoá hoặc quá trình loại bỏ virus khỏi nguồn mẫu cấy ban đầu

 Các ví dụ khác nhý: hiện týợng ra hoa sớm, bạch tạng, các thay đổi về hình dạng, mầu sắc cánh hoa, hình dạng lá và chiều cao cây

 Bất kì một yếu tố có khả năng có thể dẫn đến các thay đổi di truyền đều đýợc xem nhý là một nguyên nhân gây ra các biến dị này

 Các yếu tố này chia làm ba nhóm: sinh lý, di truyền, hoá sinh

 Hai nguyên nhân chính gây biến dị dòng soma là:

 Tính không đồng nhất di truyền của các tế bào soma của mẫu cấy ban đầu (sự đa dạng di truyền tự nhiên của các tế bào nuôi cấy )

 Tác động của các yếu tố bên ngoài trong quá trình nuôi cấy in vitro (sinh lý, hóa sinh)

 Các mẫu cấy có nguồn gốc từ một dòng đőn tính, từ hạt hay cây con đýợc xem nhý là đồng nhất về mặt di truyền và khi lấy mẫu có thể có kiểu hình giống nhau Tuy nhiên các mẫu cấy này thực tế lại bao gồm nhiều loại tế bào khác nhau nhý là phloem, xylem, nhu mô… Những tế bào này có mức độ bội thể khác nhau Nói cách khác, có sự

đa dạng tế bào giữa các loại tế bào trong cùng một mẫu cấy Sự đa dạng này đýợc gọi là

đa bội vô tính (Polysomatic)

 Ngoài ra nhiều thực vật tồn tại ở dạng thể khảm Chúng chứa những lớp tế bào hoặc mô có cấu trúc di truyên khác nhau đýợc phát triển từ meristem có chứa lớp hay bộ phận mô bị đột biến Hiện týợng này đặc biệt phổ biến ở cây thân gỗ

 Loại mẫu cấy

Các loại mẫu cấy khác nhau thường thể hiện mức độ biến dị khác nhau Các mẫu cấy có nguồn gốc từ các thể tiền chồi như chồi nách, chồi đỉnh hoặc meristem thường có mức độ biến dị thấp hơn khi sử dụng các mẫu cấy có nguồn gốc không phải đỉnh sinh trưởng như lá, rễ hay protoplast Khả năng xảy các biến dị soma còn phụ thuộc vào kiểu gen cũng như tuổi cây mẹ Các dòng già hơn thường ẩn các biến dị sẵn có ở mức cao hơn các dòng trẻ hơn Các loài có độ bội càng cao và số lượng NST càng nhiều thì có tính biến dị càng cao

 Phýőng thức nhân giống in vitro:

Các phýőng thức nhân giống khác nhau sẽ cho tỷ lệ xuất hiện các biến dị

vô tính khác nhau Nhìn chung nếu chồi bất định đýợc tái sinh từ một tế bào thì cő hội để xuất hiện các biến dị soma thýờng là lớn hőn rất nhiều từ các chồi đýợc tái sinh từ nhiều

tế bào Các quá trình nuôi cấy callus, huyền phù hoặc protoplast do đó thýờng có nhiều biến dị soma

3.2 Tác động của các yếu tố bên ngoài trong quá trình nuôi cấy

 Loại và nồng độ chất điều tiết sinh trýởng sử dụng

2,4 D hoặc 2,4,5 T thýờng gây ra các sai khác trong cây tái sinh Ví dụ nhý các cây dầu dừa tái sinh từ callus Cho các mô nuôi cấy dài ngày trong môi trýờng chứa các auxin mạnh nhý nuôi cấy dài ngày trên môi trýờng có chứa 2,4 D có tỷ lệ rất lớn các biến dị khi trồng trên đồng ruộng

 Thời gian nuôi và số lần cấy chuyển

Việc nuôi cấy dài ngày trong điều kiện in vitro cũng nhý tăng số lần cấy chuyển cũng sẽ làm tăng khả năng xuất hiện các biến dị soma

Nguyên nhân: do sự thay đổi của các kiểu methyl hóa bình thýờng của DNA genome

 Cùng lúc khảo sát đýợc một khối lýợng lớn hàng triệu tế bào trong một không gian môi trýờng hẹp, đồng nhất và cùng chịu một áp lực chọn lọc chủ định thích hợp, dễ dàng tiến hành theo qui trình công nghiệp.

 Tạo giống mới có các đặc tính mong muốn một cách nhanh chóng thông qua nuôi cấy mô kết hợp với chọn lọc dòng tế bào

 Giúp nhà khoa học có thể nghiên cứu một loài nhiệt đới ở vùng ôn đới hoặc ngýợc lại vì điều kiện môi trýờng đặc thù có thể tạo ra rất dễ dàng trong phòng thí

 Phân lập các biến dị có ích để sản xuất các hợp chất sơ cấp và thứ cấp

 Phân lập các biến dị có ích với khả năng kháng bệnh, chống chịu stress tốt hơn

 Tạo các biến dị di truyền không qua lai hữu tính ở những dòng ưu tú

 Các biến dị soma sinh ra do cảm ứng là con đường tốt nhất để cải tạo các cây lâu năm

Qui trình chung:

 Nuôi cấy TB xôma 2n NST trên môi trường nhân tạo có định hướng

 Các TB phân chia thành nhiều dòng biến dị có bộ NST thay đổi và biểu hiện cao hơn mức bình thường (biến dị dòng xôma)

 Chọn lọc và phát triển các dòng TB có biến dị theo mong muốn thành cơ thể mới

Ở đây, đặc điểm của dòng đýợc chọn là kết quả biểu hiện khuyết tật của tế bào Thí dụ điển hình là chọn dòng thiếu Enzyme nitrate reductase (NR) Trên môi trýờng chứa ClO3- những tế bào có NR sử dụng ClO3- nhý NO3- và khử thành ClO2-, ClO2- tác dụng nhý một độc tố cho nên chỉ có những tế bào không có NR mới sống sót trên môi trýờng chọn lọc

7.1.3 Chọn tổng thể

Các tế bào dị dýỡng thực vật thýờng đýợc chọn bằng phýőng thức xử lý đột biến và nuôi trên môi trýờng có chứa yếu tố dinh dýỡng cần thiết, các yếu tố này có khi lại chính là yếu tố gây đột biến VD: đột biến lặn chịu đýợc S-2-aminoethyi cysteine xuất hiện sau khi xử lý phôi nuôi cấy

7.2.1 Chọn lọc trong điều kiện không có tác nhân chọn lọc