VD: đối với tế bào cây sung dâu (Acer pseudoplatanus) mật độ thắch hợp 9 Ờ 15.103 tb/ml.
IV. ĐẶC TRÝNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ
♠ Theo King (1980), những tế bào trải qua quá trình nuôi cấy, sinh trýởng và trao đổi chất trong dịch huyền phù gọi là dòng tế bào. Đặc điểm của dòng tế bào:
Khả năng tách tế bào cao.
Hình thái tế bào đồng nhất.
Nhân rõ ràng và tế bào chất đậm đặc.
Nhiều hạt tinh bột.
IV. ĐẶC TRÝNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ
Týõng đối ắt các yếu tố mạch.
Có khả năng nhân đôi trong 24 Ờ 72h. Mất tắnh toàn năng.
Quen với chất sinh trýởng. Tăng mức đa bội thể.
V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ SINH TRÝỞNG SINH TRÝỞNG
5.1. Số lýợng tế bào
♣ Trýớc khi đếm, xử lý những cụm tế bào qua acid chromic, đun nóng 700C trong 5 Ờ 10 phút, sau đó làm nguội và lắc mạnh trong vài phút.
♣ Pha loãng dịch, nhuộm và đếm trên buồng đếm hồng cầu.
♣ Kết quả: số lýợng tế bào/ml dung dịch nuôi cấy. V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ
SINH TRÝỞNG
5.2. Thể tắch tế bào
♣ Lấy ngẫu nhiên một thể tắch dịch nuôi cấy, đem ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong thời gian 5 phút.
♣ Thu tế bào và đem xác định thể tắch.
♣ Kết quả:
Số ml tế bào/thể tắch môi trýờng nuôi cấy.
Tỷ lệ %.
V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ SINH TRÝỞNG SINH TRÝỞNG
5.3. Khối lýợng týõi và khối lýợng khô tế bào
♣ Khối lýợng týõi:
Thu thập tế bào trong một thể tắch dịch xác định. Rửa bằng nýớc cất vô trùng
Làm khô trong chân không. Cân để xác định khối lýợng.
♣ Khối lýợng khô:
Lấy một thể tắch mẫu xác định.
Loại bỏ phần nổi, rửa phần tế bào trên giấy lọc Whatman. Sấy khô trong 12h ở 800C đến khối lýợng không đổi. V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ
SINH TRÝỞNG
5.4. Xác định thành phần Protein
♣ Thu thập tế bào, chuyển lên lọc qua giấy Whatman.
♣ Rửa tế bào trong ethanol 70% đang sôi.
♣ Làm khô với Aceton rồi chuyển vào dung dịch NaOH 1M.
♣ Đun nóng đến 850C trong 1.5h.
♣ Lọc và xác định Protein thủy phân trong dịch theo phýõng pháp Lowry và cs (1951).
V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ SINH TRÝỞNG SINH TRÝỞNG
5.5. Xác định chỉ số nguyên phân
♣ Huyền phù tế bào đýợc cố định trong hỗn hợp Aceto-orcein : Acid Acetic (3:1) sau đó chuyển sang lam kắnh.
♣ Nhỏ 1 giọt Aceto-orcein lên mẫu, hõ trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội trong 5 phút.
♣ Đậy mẫu bằng Lamel, làm khô mẫu, quan sát dýới kắnh hiển vi quang học ở vật kắnh 100.
♣ Xác định các kỳ trong khoảng 1000 tế bào.
♣ Tỷ lệ % các tế bào đang phân bào gọi là chỉ số nguyên phân. VI. ỨNG DỤNG
6.1. Sản xuất sinh khối tế bào và
các hợp chất thứ cấp
♣ Sản phẩm của nuôi cấy huyền phù tế bào thýờng đặc trýng là những chất có giá trị cao và cần ở lýợng nhỏ.
♣ Có thể chia thành các nhóm dựa theo công dụng:
Hợp chất thứ cấp trong y học.
Hợp chất thứ cấp trong hóa mỹ phẩm.
Hợp chất thứ cấp trong công nghiệp. VI. ỨNG DỤNG
♣ Tại sao phải nuôi cấy huyền phù tế bào thu sinh khối?
Tàn phá môi trýờng và sự xói mòn di truyền.
Sự cung cấp nguồn nguyên liệu không đều đặn, không vững chắc, chất lýợng không ổn định.
Nhiễm bẩn do thuốc trừ sâu, bệnh hại, chất phóng xạ hay kim loại nặng Ầ
♣ Nuôi cấy huyền phù tế bào khắc phục đýợc các nhýợc điểm trên. VI. ỨNG DỤNG
Ngoài ra, nuôi cấy huyền phù tế bào còn có một số ýu điểm sau:
Sản xuất một cách có định hýớng, theo quy mô công nghiệp, khối lýợng sản phẩm lớn, không phụ thuộc vào mùa vụ.
Tỷ lệ % khối lýợng khô các hợp chất thứ cấp cao hõn so với nguyên liệu thực vật thu hái trong tự nhiên.
Không tốn nhiều diện tắch gieo trồng.
Thu sinh khối tế bào lớn trong thời gian ngắn. VI. ỨNG DỤNG
♣ Một số hợp chất thứ cấp đã đýợc sản xuất từ nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật:
Diosgenin: Tác dụng chống viêm; chữa sốt, đái buốt, đái vàng, thấp khớp, đau lýng, đau dây thần kinh.
- Việc nuôi cấy Dioscorea deltoidea Wall ex Griseb (cây Củ nâu) trong bioreactor đã thu đýợc năng suất diosgenin cao hõn so với hiệu suất có đýợc từ nguyên liệu tự nhiên.
- Trong nuôi cấy tế bào, diosgenin chiếm 7.8 % khối lýợng khô, trong khi chỉ chiếm 2 % với nguyên liệu thực vật thu hái trong tự nhiên.
VI. ỨNG DỤNG
Codein: Giảm đau và giảm ho.
- Papaver somniferum là nguồn của 2 hợp chất rất quan trọng trong y học là morphine và codein.
- Sản xuất morphin đã đýợc thực hiện bằng việc nuôi cấy huyền phù tế bào tế bào
Papaver somniferum. VI. ỨNG DỤNG Steviol:
- Chất tạo vị ngọt đýợc biết đến rộng rãi, thu nhận từ cây Stevia rebaudiana. - Nuôi cấy callus là giai đoạn tiền đề để nuôi cấy huyền phù tế bào trong tắch lũy steviol.
- Trong nuôi cấy callus, hiệu suất đạt tới 36.4 %. VI. ỨNG DỤNG
Taxol:
- Là một nhóm chất trong hóa trị liệu ung thý, điều trị ung thý buồng trứng, ung thý vú, ung thý phổi, khối u ác tắnh, và các dạng u býớu khác.
- Nuôi cấy tế bào các loài Taxus đýợc xem nhý là một phýõng pháp ýu thế để cung cấp ổn định nguồn taxol và dẫn xuất taxane của nó (T. cuspidata, T. baccata, T. mairei). VI. ỨNG DỤNG
Scopolamine và hyoscyamine:
- Là 2 loại tropane alkaloid đýợc sử dụng để trị co thắt và gây mê. - Có nhiều trong các cây thuộc họ Solanaceae.
- Nuôi cấy huyền phù tế bào Scopolia japonica có bổ sung tropic acid (nhý 1 tiền chất) thì có thể tăng hàm lýợng alkaloid lên 15 lần.
VI. ỨNG DỤNG
Saponin và sapogenin:
- Là một dýợc phẩm quý giá, có nhiều trong rễ cây nhân sâm (Panax ginseng), có tác dụng chữa bệnh rối loạn tiêu hóa, chống suy nhýợc cõ thể, tăng cýờng sinh lực. - Nuôi cấy huyền phù tế bào cây P. ginseng đang tiến hanh trên quy mô công nghiệp.
- Đây là một trong các đối týợng đýợc các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu nhiều nhất.