VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
2. VẬT LIỆU VÀ PHÝạNG PHÁP
♣ Mô sẹo màu xanh đýợc nuôi trong điều kiện chiếu sáng từ lá dừa cạn in vitro 4 tháng tuổi đýợc chuyển vào 100 ml môi trýờng cảm ứng trong erlen 250 ml.
♣ Môi trýờng cảm ứng gồm môi trýờng MS + Vitamin Morel + Hormon tăng trýởng thực vật (NAA hoặc 2,4-D và Kin hoặc BAP) + 30g/l đýờng sucrose.
♣ Sau đó đặt vào máy lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ 25ổ 2oC trong điều kiện chiếu sáng liên tục 16 giờ/ngày.
VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
♣ Xác định sinh khối bằng phýõng pháp cân.
♣ Chiết tách alkaloid toàn phần từ sinh khối tế bào Dừa cạn theo phýõng pháp của Kutney và cộng sự (1983).
♣ Xác định alkaloid toàn phần bằng phýõng pháp acid-baz - khan theo dýợc điển Việt Nam và dýợc điển Anh.
VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát ảnh hýởng của sự thay đổi nồng độ cytokinin đến sự tạo sinh khối
Kết luận:
Ở bảng trên cho thấy môi trýờng chỉ bổ sung NAA có sự tạo sinh khối thấp hõn so với môi trýờng bổ sung NAA kết hợp với Kin.
Môi trýờng K4 (MS + NAA (1mg/l) + Kin (0.5 mg/l) và K8 (MS + NAA (1mg/l) + BAP (0.5 mg/l) cho sinh khối týõi và khô đều cao hõn các môi trýờng khác.
3.2. Ảnh hýởng của các chất điều hòa sinh trýởng đến việc tạo sinh khối
Kết luận:
Môi trýờng có bổ sung 2,4-D tạo sinh khối týõi nhiều hõn so với môi trýờng bổ sung NAA nhýng trọng lýợng khô lại rất thấp. Môi trýờng K3 và K4 có trọng lýợng týõi thấp hõn môi trýờng K1 và K2 nhýng cho sinh khối khô nhiều hõn. Môi trýờng K3 cho sinh khối týõi và khô đều cao hõn môi trýờng K3 nhýng xét về mặt thống kê, hai môi trýờng này không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa α = 0.01.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Ảnh hýởng của các chất điều hòa sinh trýởng đến việc tạo sinh khối
Kết luận:
2,4-D kắch thắch sự phân chia tế bào nhanh nhýng lại phá hủy cấy trúc chặt chẽ của tế bào làm cho tế bào xốp và giảm đi việc tạo các sản phẩm thứ cấp. Cytokinin cần thiết cho
sự hình thành các hợp chất thứ cấp, khi kết hợp cytokinin với NAA giúp duy trì sự tăng trýởng cũng nhý tạo ra alkaloid cao.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Ảnh hýởng của đýờng sucrose đến việc tạo sinh khối
Kết luận:
Nồng độ đýờng tăng dần từ 20 - 60 gam/l sinh khối týõi và khô thu đýợc trong môi trýờng tăng dần theo. Môi trýờng tối ýu cho thắ nghiệm về ảnh hýởng của nồng độ đýờng lên sự tạo sinh khối là môi trýờng Đ5.
Tuy nhiên khi tăng nồng độ đýờng lên cao hõn là 70 - 80 gam/lắt thì trọng lýợng týõi và khô giảm dần. Nồng độ đýờng có ảnh hýởng đến sự tạo thành các sản phẩm thứ cấp trong nuôi cấy tế bào. Ở nồng độ đýờng sucrose cao vừa phải khoảng 50 Ờ60 gam/lắt sẽ kắch thắch tạo sinh khối và alkaloid.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4. Định lýợng alkaloid vinblastin và vincristin có trong lá cây không qua nuôi cấy in vitro và trong dịch huyền phù tế bào
Kết luận:
bằng phýõng pháp nuôi cấy dịch huyền phù có bổ sung 2,4-D thì lýợng vincristin và
vinblastin không có trong mẫu alkaloid toàn phần còn dịch huyền phù NAA + Kin cho lýợng vinblastin thấp hõn so với cây trồng ngoài tự nhiên nhýng cho lýợng vincristin khá cao trong khi cây trồng ngoài tự nhiên trong thắ nghiệm này lại không có.
VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
4. KẾT LUẬN:
♣ Tìm đýợc nồng độ hormon phù hợp: Ở nồng độ 1 mgl-1 α -naphthaleneacetic acid (NAA) và 0,5 mgl-1 kinetin (Kin) thu nhận đýợc sinh khối và alkaloid toàn phần cao nhất trong khi cũng ở môi trýờng này nhýng thay thế NAA bằng 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) ở cùng nồng độ thu đýợc sinh khối và alkaloid toàn phần thấp.
♣ Nồng độ đýờng tối ýu cho việc nuôi dịch huyền phù tế bào dừa cạn: ở nồng độ 60 gl-1 cho lýợng sản phẩm là cao nhất.
VIII. KẾT LUẬN
Ớ Tuy nhiên, do cõ sở vật chất cõ bản cho một phòng thắ nghiệm nuôi cấy huyền phù tế bào còn cao nên ở Việt Nam, hýớng nuôi cấy huyền phù tế bào chỉ dừng lại ở mức nghiên cứu.
Ớ Trong những năm gần đây, Việt Nam đã thành công trong những quy trình áp dụng các phýõng pháp của nuôi cấy huyền phù tế bào để sản xuất ra các chế phẩm sinh học, y học Ầ
Trýờng Đại học Nông Nghiệp Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học
Nuôi cấy meristem tạo cây sạch bệnh virus
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ớ Bệnh virus trên cây là một bệnh hại phổ biến, nghiêm trọng và gây thiệt hại lớn đối với ngýời trồng.
Ớ Những phýõng pháp phòng chữa bệnh cây nhiễm virus thông thýờng ắt có hiệu quả
Ớ Phýõng pháp meristem tạo cây trồng sạch bệnh có nhiều ýu điểm và đýợc sử dụng phổ biến.
II. NỘI DUNG
Ớ Tác hại của bệnh virus đối với cây trồng.
Ớ Các biện pháp kĩ thuật và cõ sở tạo cây sạch bệnh virus.
Ớ Các kỹ thuật nuôi cấy meristem.
Ớ Các phýõng pháp kiểm tra, đánh giá bệnh virus biện pháp đánh giá bệnh virus trên đồng ruộng
Ớ Quy trình sản xuất cây có múi sạch bệnh virus nhờ kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trýởng.
1. Tác hại của bệnh virus:
Virus có thể làm giảm năng suất, chất lýợng và sức sinh trýởng của cây trồng.
Vắ dụ: virus gây bệnh cuốn lá khoai tây, cà chua (Tomato yellow leaf curl virus) và virus Y có thể làm giảm 95% năng suất của cây trồng.
1. Tác hại của bệnh virus:
Virus lây lan rất nhanh chỉ trong một khoảng thời gian ngắn có thể xâm nhiễm cả một vùng rộng lớn gây thiệt hại và có thể thất thu hoàn toàn.
Virus có lây truyền qua các thế hệ thông qua các cõ quan đã nhiễm virus nhý củ, hạt giống, các bộ phận sinh dýỡng sử dụng làm giống.
Virus là một loại bệnh không chữa đýợc. Không có các loại thuốc hay hoá chất đặc hiệu cho việc phòng trừ các loại bệnh gây ra bởi virus.
Chắnh vì thế chọn giống sạch bệnh virus đang đýợc nghiên cứu rộng rãi trong đó có kỹ thuật chọn giống cây trồng sạch bệnh virus nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trýởng
meristem.
1. Tác hại của bệnh virus: 1. Tác hại của bệnh virus: Papaya ringspot virus 1. Tác hại của bệnh virus: Dễ lây lan, lây lan rất nhanh.
Papaya ringspot virus
1. Tác hại của bệnh virus:
Virus là một loại bệnh không chữa đýợc. Không có các loại thuốc hay hoá chất đặc hiệu cho việc phòng trừ các loại bệnh gây ra bởi virus.
Không có cấu tạo tế bào.
Sống kắ sinh bắt buộc.
Chắnh vì thế chọn giống sạch bệnh virus là vấn đề bức thiết và đýợc quan tâm nhiều.
1. Tác hại của bệnh virus: 1. Tác hại của bệnh virus: 1. Tác hại của bệnh virus:
Cách 1: Dùng các phýõng pháp chuẩn đoán bệnh virus.
Cách 2: Dùng kĩ thuật làm sạch virus bằng nuôi cấy meristem. 2. Các biện pháp kĩ thuật làm sạch virus trong nuôi cấy mô:
Dùng các phýõng pháp chuẩn đoán bệnh virus để thanh lọc các mẫu nhiễm bệnh trýớc khi đýa vào nuôi cấy, sử dụng biện pháp nhân nhanh invitro để nhân nhanh mẫu sạch
Làm sạch virus ở mẫu đã bị nhiễm, sau khi đã tạo mẫu sạch thì tiếp tục sử dụng biện pháp nhân nhanh invitro để nhân mẫu sạch.
Mô phân sinh (meristem)
2.1. Nguyên lý của kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trýởng meristem:
Virus sống ký sinh và tồn tại trong mọi tế bào sống, tuy nhiên những nghiên cứu của White (1934), Limasset và Cornuet (1950) và Martin (1952) đã cho thấy những tế bào càng gần đỉnh sinh trýởng thì càng chứa ắt virus hõn.
Giả thiết về sự không tồn tại virus ở meristem:
The Mathews, Wang et al Hu đã đýa ra giả thuyết về sự không tồn tại của virus ở meristem nhý sau:
Virus vận chuyển trong cây nhờ hệ thống dẫn, tuy nhiên hệ thống này không có trong mô phân sinh đỉnh
Trong sự phân chia, các tế bào phân sinh đỉnh không cho phép sao chép các thông tin di truyền của virus
Hệ thống vô hiệu hoá ở vùng meristem mạnh hõn các vùng khác trong cây
Nồng độ auxin, cytokinin cao ở đỉnh sinh trýởng có thể ngăn cản quá trình sao chép thông tin của virus.
2.2. Các kĩ thuật làm sạch virus in vitro
Ớ Nuôi cấy meristem.
Ớ Nuôi cấy meristem kết hợp xử lý nhiệt.
Ớ Nuối cấy meristem kết hợp xử lý hóa chất.
Ớ Vi ghép.
2.2.1. Nuôi cấy meristem
Tách chắnh xác meristem có kắch thýớc nhỏ hõn 0,3 mm, nuôi cấy chúng trên môi trýờng dinh dýỡng phù hợp để tái sinh thành cây nguyên vẹn. Sau đó kiểm tra độ sạch virus ở cây tái sinh bằng các phýõng pháp khác nhau để thu nhận đýợc cây sạch bệnh virus.
Sõ đồ tạo cây bằng nuôi cấy meristem Tách meristem
2.2.2. Nuôi cấy meristem kết hợp với xử lý nhiệt
Ớ Cõ sở: Ở nhiệt độ cao 36 Ờ 370C thì một số loài virus không có khả năng nhân lên.
Ớ Ýu điểm: Biện pháp này cho phép có thể tách meristem ở kắch thýớc lớn hõn (0,5 Ờ 1mm) giúp cho việc tách và tái sinh cây thuận lợi hõn so với phýõng pháp tách ở kắch thýớc 0,3 Ờ 0,5mm.
Sõ đồ làm sạch bệnh virus cho cây khoai tây bằng nuôi cấy meristem kết hợp với xử lý nhiệt
2.2.3. Nuôi cấy meristem kết hợp với xử lý hóa chất
Có thể nuôi cấy meristem với kắch thýớc lớn (0,5 Ờ 1 mm) kết hợp với việc bổ sung vào môi trýờng nuôi cấy các chất kháng virus để tạo môi trýờng sạch bệnh.
Chất kháng virus nhý: 2-thiouracil, ribavirin, vidarabin làm tăng khả năng kháng của tế bào, mô thực vật và ức chế sự nhân bản của virus.
Phýõng pháp này có hiệu quả cao trong việc tạo cây sạch bệnh ở thuốc lá, khoai tây, loa kèn.
2-thiouracil
Ớ là dẫn xuất của pirimidin
Ớ có tác dụng làm rối loạn sự tổng hợp bình thýờng của các axắt nucleic của virus Ribavirin
Ớ có cấu tạo týõng tự adenosine, guanosine
Ớ gấy đột biến trong quá trình tái bản RNA của virus
Ớ Ribavirin 5'-mono(di, tri) phosphate ức chế RNA polymerase của virus Vidarabine
Ớ có hoạt tắnh chống virus herpes, poxviruses, rhabdoviruses, hepadnarviruses
Ớ can thiệp vào sự tổng hợp của DNA của virus
Ớ týõng tự nucleoside, đýợc phosphoryl hoá tạo ara-ATP cạnh tranh với dATP trong quá trình tổng hợp DNA của virus
2.2.4. Vi ghép
- Là kỹ thuật ghép các mô phân sinh đỉnh lên cây gốc sạch và kháng bệnh trong điều kiện in vitro để sản xuất cây sạch virus.
- Kỹ thuật này thýờng sử dụng với các cây thân gỗ, đặc biệt là họ cam, chanh vì meristem của chúng không thể sinh trýởng và tái sinh chồi khi nuôi cấy trực tiếp trên môi trýờng nhân tạo.
2.3. Nhân nhanh và duy trì tình trạng sạch bệnh.
1. Cây trồng nên đýợc trồng trong nhà cách ly (nhà màn, nhà kắnh) không chứa các nguồn bệnh và các vector truyền bệnh hay ở tự nhiên không có các mang virus.
2. Cần loại trừ thýờng xuyên các nguồn lây nhiễm, cần phòng trừ các vật mang bệnh (côn trùng, tuyến trùngẦ).
2.3. Nhân nhanh và duy trì tình trạng sạch bệnh.
3. Phòng tránh sự lây nhiễm cõ giới trong quá trình chăm sóc cây trồng 4. Thýờng xuyên chọn lọc, có thể bằng mắt và qua các phân tắch chẩn đoán 5. Để hoàn toàn chắc chắn, nên duy trì vật liệu sạch bệnh invitro.
3. Các phýõng pháp chẩn đoán bệnh virus Ớ Chẩn đoán bằng mắt.
Ớ Phýõng pháp chẩn đoán bằng kắnh hiển vi điện tử. Ớ Chẩn đoán bằng cây chỉ thị.
Ớ Phýõng pháp huyết thanh.
Ớ Phýõng pháp kắnh hiển vi điện tử. Ớ Phýõng pháp ELISA.
Ớ Phýõng pháp phân tắch DNA. 3.1. Phýõng pháp chuẩn đoán bằng mắt
Đây là các phýõng pháp chẩn đoán dựa trên các triệu chứng bệnh của cây.
Ýu điểm:
Đõn giản, ắt tốn kém.
Nhýợc điểm:
Ớ Phải có kinh nghiệm không dễ lẫn với các triệu chứng khác không phải là bệnh
Ớ Phýõng pháp này gặp khó khăn khi cây bị nhiễm tổ hợp virus.
Ớ Phụ thuộc vào ngoại cảnh, tuổi cây, đặc điểm của giống. 3.2. Chuẩn đoán bằng cây chỉ thị
Ớ Cây chỉ thị là cây khi bị nhiễm virus sẽ xuất hiện các triệu chứng đặc trýng. Phýõng pháp này đã đýợc tiến hành từ những năm 1940.
Ớ Phýõng pháp thử bằng cây chỉ thị luôn đýợc coi là phýõng pháp xác định đầu tiên và cũng là phýõng pháp nhạy cảm nhất, tuy nhiên kết quả xét nghiệm cũng còn phụ thuộc các yếu tố khác nữa.
3.2. Chuẩn đoán bằng cây chỉ thị
Ýu điểm:
Nhạy và chắnh xác có thể phát hiện ở nồng độ virus thấp.
Nhýợc điểm:
Ớ Thời gian chẩn đoán dài, cần quá trình ủ bệnh.
Ớ Phụ thuộc vào điều kiện thắ nghiệm.
Ớ Phýõng pháp lây nhiễm phức tạp.
Ớ Tốn công chăm sóc cây chỉ thị, môi giới truyền bệnh, chi phắ đầu tý cao.
Ớ Một số bệnh virus không tiến hành đýợc 3.3. Chuẩn đoán bằng kắnh hiển vi
Kắnh hiển vi điện tử đã mang lại những kết quả đáng tin cậy đối với xét nghiệm hàng loạt.
Ýu điểm:
Ớ Chắnh xác, tin cậy.
Ớ Đõn giản, nhanh chóng.
Nhýợc điểm:
Ớ Chi phắ cao số lýợng mẫu hạn chế.
Ớ Loại virus đýợc chứng minh cũng chỉ là loại hình đũa và hình sợi. Nếu virus tồn tại dạng cầu thì rất khó phát hiện vì nó khá giống các cõ quan tử của tế bào thực vật bình thýờng.
3.4. Phýõng pháp huyết thanh
Ớ Tắnh đặc hiệu cao xác minh nhanh sự tồn tại của virus và phân loại chúng. Kết quả thu đýợc chậm nhất là sau 48 giờ.
Ớ Chi phắ cho xét nghiệm thấp. Ớ Độ chắnh xác cao.
Nhýợc điểm:
Ớ Chýa sản xuất đýợc kháng thể đối với tất cả các loài virus và kể cả khi có huyết thanh rồi cũng chýa có thể nói rằng kết quả xét nghiệm hoàn toàn bảo đảm.
Ớ Không thể xác minh đýợc đặc tắnh gây bệnh của từng loài virus đối với thực vật chủ
Có nhiều phýõng pháp huyết thanh khác nhau đã đýợc ứng dụng phýõng pháp kết tủa giọt, xét nghiệm khuyếch tán agar gel hai chiều, xét nghiệm latex,xét nghiệm miễn dịch hýớng tâm...
3.5. Phýõng pháp ELISA ( Enzymed linked immuno sorbent assay) Ớ Enguall-Permann đề xuất năm 1971-1972 cho lĩnh vực nhân y.
Ớ Clarkm, Adams, Barbara (1976) đề xuất cho chuẩn đoán bệnh virus thực vật. Nguyên lý chung:
Dựa vào phản ứng kháng nguyên Ờ kháng thể nhýng ở đây kháng thể đýợc liên kết với một enzyme (enzymed linked). Phức kháng nguyên Ờ kháng thể - enzyme dễ dàng nhận biết màu do chắnh enzyme đó xúc tác.
3.5. Phýõng pháp ELISA
Ớ Enzym thông dụng là phosphataza kiềm.
Ớ Cõ chất của phản ứng là 4- nitrophenylphophat. Khi bị tách phosphat sẽ thành α- nitro phenol có màu vàng.
Ớ Ýu điểm:
- Mỗi enzyme xúc tác cho hàng ngàn phân tử cõ chất nên tắn hiệu đýợc khuếch đại rất rõ.
- Có thể định tắnh, định lýợng. 3.6. Phýõng pháp phân tắch ADN
Ớ Xác định trực tiếp sự có mặt lõi ARN (hoặc ADN) của virus.
Ớ Phýõng pháp này cho kết quả chắnh xác nhýng đắt tiền, yêu câu phải có trình độ kĩ thuật cao.
Ớ Sõ đồ nguyên lý:
Chiết tách ARN virus cDNA Phản ứng lai với ARN virus Nhận biết khi cDNA gắn phản xạ hoặc enzyme.
4. Ứng dụng thực tế của kĩ thuật nuôi cấy meristem
Ớ Nhân nhanh giống khoai tây sạch bệnh: các cán bộ thuộc bộ môn Sinh lý Thực vật của Viện Sinh học Nông nghiệp, trýờng ĐH Nông nghiệp Hà Nội nghiên cứu hoàn thiện sản xuất khoai tây giống sạch bệnh.
Ớ Diện tắch trồng khoai tây ở nýớc ta đã có thời gian đạt trên 11 vạn 4. Ứng dụng thực tế của kĩ thuật nuôi cấy meristem
Ớ Tạo giống huệ sạch bệnh: Đầu tháng 12/2006, một giống huệ sạch bệnh từ phòng thắ nghiệm của trýờng Đại học Cần Thõ đã cho hoa đảm bảo chất lýợng.
4. Ứng dụng thực tế của kĩ thuật nuôi cấy meristem 4. Ứng dụng thực tế của kĩ thuật nuôi cấy meristem
5. Quy trình tạo cây có múi sạch bệnh từ nuôi cấy meristem