nghiên cứu thực hiện hướng đến tìm ra phương pháp tách chiết DNA mới bằng hạt nano sắt từ tự tổng hợp tại phòng thí nghiệm

Đồ án tốt nghiệp Long GVHD: TS Đặng Đức TÓM TẮT LUẬN VĂN Những ứng dụng hạt nano từ tính lĩnh vực sinh học phân tử, y sinh nghiên cứu nhiều nơi giới Việc tách chiết DNA, protein từ các mẫu sinh học là việc tiến hành thường xuyên sinh học phân tử; công việc này còn có vai trò rất quan trọng chuẩn đoán y tế Một số kit sử dụng vật liệu nano để tách chiết nhanh, nhạy DNA, protein đã phát triển nước ngoài Nghiên cứu này hướng đến phát triển kít sở sử dụng hạt nano từ tính tự tổng hợp Luận văn này gồm hai phần: tổng hợp hạt nano sắt từ theo phương pháp đồng kết tủa và xây dựng quy trình tách DNA vi khuẩn hạt sắt từ đơn giản, nhanh và tớn phòng thí nghiệm ABSTRACT Applications of magnetic nanoparticles in molecular biology , biomedical are being investigated around the world Isolation of DNA or proteins from various biological sources is a task carried out regularly in molecular biology It also plays a very Trang Đồ án tốt nghiệp Long GVHD: TS Đặng Đức important role in medical diagnosis Several kits using nanomaterials to extract DNA or proteins quickly and sensitively have been developed in foreign countries This study aims to develop kits for that purpose on the basis of using magnetic nanoparticles synthesized in house This thesis consists of two parts: the synthesis of magnetic nanoparticles using coprecipitation method and build a simple, rapid and inexpensive DNA extraction protocol using magnetic nanoparticles in laboratory LỜI MỞ ĐẦU Trong sinh học phân tử, việc tách chiết DNA, protein từ tế bào là việc cần tiến hành thường xuyên Ngoài vai trò quan trọng nghiên cứu, công việc này còn có vai trò rất quan trọng chuẩn đoán y tế Với phát triển nhanh chóng mảng sinh học phân tử, nhu cầu tìm phương pháp tách chiết DNA sớ lượng lớn, nhanh hơn, đơn giản ngày càng cấp thiết Các phương pháp tách chiết sử dụng Việt Nam là phương pháp cổ điển, tốn khá nhiều thời gian và thường sử dụng hóa chất tương đối độc Một số kit sử dụng vật liệu nano để tách chiết DNA, protein từ tế bào đã phát triển giới Việc phát triển kit nước sẽ góp phần tạo sản phẩm công nghệ sinh học và tính áp dụng cao Vật liệu nano thể rất nhiều tính chất đặc biệt và lý thú Một nhánh quan trọng công nghệ nano, đó là lý sinh học nano, đã và nghiên cứu rất mạnh mẽ nhờ vào khả ứng dụng rất linh hoạt và hiệu vật liệu nano[8], [18],[21],[24], [32] Trong tự nhiên, sắt là vật liệu có từ độ bão hòa lớn nhất nhiệt độ phòng, sắt không độc đới với thể người và tính ổn định làm việc mơi trường khơng khí nên các vật liệu oxyd sắt nghiên cứu rất nhiều để làm hạt nano từ tính Trang Đồ án tốt nghiệp Long GVHD: TS Đặng Đức Những năm gần đây, hạt nano từ tính, cụ thể là hạt nano sắt từ ứng dụng rộng rãi số lĩnh vực y sinh học, sinh học phân tử nhờ tính chất ưu việt vật liệu nano từ ;kỹ thuật sử dụng chất mang từ tính trở thành công cụ ngày càng phổ biến để tách các phân tử sinh học DNA, protein [8] , [24],[30], [32].Với mức kích thước nano, các hạt nano từ tính giúp cho có thể thao tác qui mô phân tử và tế bào So với vật liệu từ dạng khối, hạt nano sắt từ Fe 3O4 có lực kháng từ rất nhỏ (gần không) và từ độ bảo hòa cao nên chúng rất nhạy với thay đổi từ trường bên ngoài[7] Có hai hướng tạo hạt nano sắt từ: thứ nhất là nghiền vật liệu khới đến kích thước nano; thứ hai là tổng hợp hạt nano từ các nguyên tử Cách thứ hai sử dụng rộng rãi so với cách thứ nhất hiệu suất cao, dễ thực và dễ điều khiển kích thước hạt tạo thành [7] Bên cạnh khả thu tách DNA từ mẫu hạt nano sắt từ, chất lượng và độ tinh DNA là yếu tố quan trọng cần phải đảm bảo Các hạt nano sắt từ có thể liên kết không chọn lọc với DNA và protein Do đó, quá trình thu tách DNA cần sử dụng thêm chất giúp hấp phụ chọn lọc DNA với hạt nano sắt từ Thơng thường các phân tử protein chìa các nhóm ưa nước bề mặt, tạo nên khả tan nước protein Nồng độ muối cao là yếu tố gây tủa protein, hạn chế hòa tan protein môi trường[1] Polyethylene glycol (PEG) có trọng lượng phân tử cao nhận thấy có khả giảm hút bám protein lên hạt nano sắt từ [17] Từ các vấn đề nói trên, nghiên cứu thực hướng đến tìm phương pháp tách chiết DNA hạt nano sắt từ tự tổng hợp phòng thí nghiệm Trang Đồ án tốt nghiệp Long GVHD: TS Đặng Đức CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tổng quan hạt nano sắt từ 1.1.1.Giới thiệu hạt nano sắt từ Hạt nano là vật chất vật lý có tính chất khác biệt đáng kể so với vật liệu tương ứng kích thước khới, có đường kính nhỏ nhất nano mét và khơng lớn 100 nm [23] Ơxit sắt từ là chất rắn màu đen, có danh pháp IUPAC là iron(II) diiron(III) oxide Thành phần hóa học ôxit sắt từ chứa sắt(II) và sắt(III), với công thức hóa học là FeO.Fe 2O3 hay là Fe3O4 Cấu trúc tinh thể ôxit sắt từ thuộc dạng spinel đảo Mỗi ô sở hay tế bào mạng ôxit sắt từ gồm phân tử Fe3O4 , ứng với khối lập phương nhỏ, đó có 32 anion và 24 cation Các ion O2- xếp thành các cấu trúc lập phương tâm diện Tám cation Fe 2+ phân bố các cấu trúc tứ diện, ion Fe2+ bị bao quanh ion O2- Các ion Fe3+ chia làm hai loại: cation tạo với ion O 2- không gian tứ diện, ion Fe 3+ còn lại bị bao quanh ion O 2- mạng bát diện [5] So với vật liệu khới, hạt nano oxit sắt từ thể tính siêu tḥn từ [7]; kích thước nano ferri từ biến mất và chuyển động nhiệt sẽ thắng làm cho vật liệu trở thành vật liệu siêu thuận có từ độ bão hòa cao và lực kháng từ gần không 1.1.2 Các phương pháp tổng hợp hạt nano sắt từ Trang Đồ án tốt nghiệp Long GVHD: TS Đặng Đức Các hạt nano sắt từ có thể chế tạo theo hai hướng khác Theo hướng topdown vật liệu dạng khới sẽ bị phá vỡ, phân tán cấu trúc khới đến kích thước nano, ví dụ phương pháp nghiền Đới với ngun tắc thứ hai, các hạt nano hình thành từ các ion, nguyên tử, phân tử các phương pháp nhiệt phân, hóa siêu âm, phương pháp polyol, phương pháp đồng kết tủa, phương pháp vi nhũ tương… So với hướng thứ nhất, hướng thứ hai sử dụng rộng rãi [7] 1.1.2.1 Phương pháp vi nhũ tương Một hệ vi nhũ tương gồm thành phần pha dầu, pha nước và chất hoạt động bề mặt Hệ nhũ tương chứa các giọt nhỏ (mixen) pha khác (phân cực không phân cực) phân tán pha liên tục Các vi nhũ tương này có thể là pha dầu pha nước pha nước pha dầu, phụ thuộc vào nồng độ các thành phần khác Chất hoạt động bề mặt dùng làm giảm sức căng bề các pha phân tán và pha liên tục, từ đó giúp ổn định hệ nhũ tương Bằng cách thay đổi nồng độ pha phân tán và nồng độ chất hoạt động bề mặt, kích thước các giọt mixen có thể điều chỉnh 1-100nm [18].Do giới hạn không gian, hình thành và phát triển các hạt nanơ bị hạn chế và tạo nên các hạt nanô đồng nhất Trang Đồ án tốt nghiệp Long GVHD: TS Đặng Đức Hình 1.1: Cơ chế hoạt động phương pháp vi nhũ tương Cơ chế phản ứng hệ vi nhũ tương xảy sau: hòa trộn các hệ vi nhũ tương này lại với các hạt vi nhũ tương các chất phản ứng gặp Khi các hạt vi nhũ tương hòa trộn vào nhau, phản ứng hóa học các chất các giọt sẽ xảy Phản ứng xảy lòng hạt lớn và sản phẩm mong muốn tạo thành Các hạt magnetite Fe3O4 sau tạo thành sẽ bị chất hoạt hóa bề mặt bao phủ và ngăn cản không cho phát triển thêm kích thước 1.1.2.2 Phương pháp đồng kết tủa Phương pháp đồng kết tủa gồm giai đoạn liên quan: giai đoạn hình thành mầm tinh thể và giai đoạn tăng trưởng kích thước mầm Khi nồngđộ tiền chất đạt đến mức bão hòa các mầm tinh thể bắt đầu hình thành Sau đó , các hạt nhân sẽ phát triển chậm thông qua quá trình khuyếch tán vật chất từ dung dịch lên bề mặt các tinh thể Trang Đồ án tốt nghiệp Long GVHD: TS Đặng Đức Để thu hạt có độ đồng nhất cao, hai giai đoạn hình thành mầm và phát triển mầm cần phân tách [18],[21].Trong quá trình phát triển mầm, cần hạn chế hình thành mầm Một loạt các yếu tớ có thể điều chỉnh quá trình tổng hợp các hạt nano oxit sắt để kiểm soát kích thước, từ tính tính chất bề mặt Kích thước và hình dạng các hạt nano có thể điều chỉnh cách điều chỉnh độ pH , sức mạnh ion , nhiệt độ, tính chất ḿi…[13,[17], [18] [21] Khi nồng độ các tiền chất giảm kích thước tinh thể và từ độ bảo hòa hạt giảm theo [7],[18] Ưu điểm quá trình kết tủa là sớ lượng lớn các hạt nano có thể tổng hợp Tuy nhiên, kiểm soát phân bớ kích thước hạt là có hạn, có các yếu tớ động kiểm soát phát triển các tinh thể Phương pháp đồng kết tủa là phương pháp thường dùng để tạo các hạt ơ-xít sắt Với điều kiện tỉ lệ mol Fe3+/Fe2+ = 2, pH môi trường từ – 14, chế tổng hợp hạt nano Fe3O4 là: Fe3+ + H2O  Fe(OH)x3-x (thông qua quá trình mất proton) Fe2+ + H2O  Fe(OH)y2-y (thơng qua quá trình mất proton) Fe(OH)x3-x +2 Fe(OH)y2-y  Fe3O4 (thơng qua quá trình ơxi hóa và dehydride hóa) Tổng hợp các phản ứng có phương trình sau: Fe2+ + 2Fe3+ + 8OH-  Fe3O4 + 4H2O Nếu có ơxy Fe3O4 bị xi hóa thành sắt( III) hydroxyt theo phản ứng: 4Fe3O4 + O2 + 18H2O  12Fe(OH)3 1.1.3.Một số ứng dụng hạt nano sắt từ y sinh Trên sở các đặc tính ưu việt các hạt nano sắt từ, chúng đã ứng dụng rộng rãi số lĩnh vực y sinh học [10], [19],[17] ,[21],[23] Các ứng dụng hạt nano từ chia làm hai loại: ứng dụng ngoài thể và thể Phân tách và chọn lọc tế bào, DNA là ứng dụng ngoài thể nhằm tách tế bào,DNA cần nghiên cứu khỏi các tế bào khác Các ứng dụng thể dẫn thuốc, nung nóng cục và tăng độ tương phản ảnh cộng hưởng từ … Trang Đồ án tốt nghiệp Long GVHD: TS Đặng Đức a Phân tách và chọn lọc tế bào, DNA Thu tách loại thực thể sinh học để làm tăng nồng độ phân tích dùng vào các mục đích khác là việc làm thường xuyên sinh học phân tử, y sinh Phương pháp phân tách, chọn lọc cách sử dụng các hạt nanơ từ tính đã và nghiên cứu để đưa vào ứng dụng thực tế Hai bước quá trình phân tách gồm có đánh dấu và tách các đối tượng nghiên cứu đánh dấu từ trường Việc đánh dấu thực nhờ các hạt nanơ từ tính, thường là hạt oxit sắt từ Các hạt nanơ từ tính bao phủ loại hóa chất có tính tương hợp sinh học, từ đó có thể tạo các liên kết với các phân tử sinh học cần thu tách Quá trình phân tách thực nhờ gradient từ trường ngoài Các hạt từ tính có mang các tế bào đánh dấu sẽ bị từ trường giữ lại Một số nghiên cứu đã thực và ứng dụng thành công việc phân tách tế bào hạt nano từ tính tác động từ trường Thu tách tế bào ung thư máu nhờ từ trường là phương pháp rất nhạy để có thể tế bào ung thư từ máu, đặc biệt là nồng độ tế bào ung thư rất thấp [14] Các kí sinh trung sớt rét máu có thể phát cách đo từ tính kí sinh trùng đã đánh dấu từ[20] Trong phản ứng PCR khuyếch đại ADN, quá trình làm giàu ADN ban đầu thực nhờ hạt nanơ từ tính[13] Với ngun tắt tương tự phân tách tế bào, hạt nanơ từ tính dùng để phân tách DNA b Dẫn truyền thuốc Trang Đồ án tốt nghiệp Long GVHD: TS Đặng Đức Các hạt từ tính dùng làm chất mang th́c đến vị trí cần thiết thể đã nghiên cứu từ năm 1970 Dẫn truyền thuốc hạt nano từ tính đem lại các lợi ích thu hẹp phạm vi phân bố các thuốc thể nên làm giảm tác dụng phụ thuốc, khắc phục nhược điểm hóa trị liệu - tính không đặc hiệu và giảm lượng thuốc điều trị Khi các hạt mang thuốc vào mạch máu, tác dụng gradient từ trường ngoài, các hạt tập trung vào vùng có từ trường mạnh đó thể Tại vị trí cần trị liệu quá trình nhả thuốc có thể diễn thông qua chế hoạt động các enzym các tính chất sinh lý học các tế bào ung thư gây độ pH, quá trình khuyếch tán thay đổi nhiệt độ [9] Một số nghiên cứu thử nghiệm dẫn truyền thuốc thực thành công động vật, ví dụ việc hướng th́c doxorubicin đến tế bào u bướu đuôi chuột [28] Nghiên cứu thử nghiệm lên người thự với chất lỏng từ tính cho 14 bệnh nhân Nghiên cứu cho thấy người ta có thể dẫn các hạt nanô từ tính đến các u bướu thể người mà khơng gây độc cho thể.[15] Hạt nanơ từ tính còn gắnvới nuclide phóng xạ (radionuclide) nhằm tiêu diệt tế bào ung thư Hạt nanơ từ tính giúp cho các nuclide này đến gần các mục tiêu và lưu trú đó thời gian dài Thử nghiệm khối u chuột thấy liều chiếu xạ dùng hạt nanơ từ tính cao so với sử dụng nuclide Rhenium188 không dẫn từ trường ngoài.[12] Ứng dụng khác hạt nano từ tính là trị liệu gen Một gen trị liệu gắn với hạt nanơ từ tính và giữ cớ định vị trí cần chuyển gen, đó làm gia tăng khả truyền gen và thể gen[16] c Tăng độ tương phản cho ảnh cộng hưởng từ Trang Đồ án tốt nghiệp Long GVHD: TS Đặng Đức Sau quá trình hoạt động và lưu chuyển hệ tuần hoàn, hạt nano oxit sắt từ có thể đào thải qua gan và phát màng lưới nội mô thể Do vậy, mật độ hạt nanô các quan là khác gây nhiễu loạn từ trường địa phương khác nhau, kết là độ tương phản ảnh cộng hưởng từ hạt nhân các mô khác Những hạt có kích thước nhỏ sẽ có thời gian tồn thể lâu màng lưới nội mô nhận biết chúng khó Mặc khác màng lưới nội mô các tế bào ung thư hoạt động không hiệu các tế bào khỏe mạnh thông thường Dựa điều này, đã xác định tế bào ung thư gan [22], tế bào ung thư não[11] Hình 1.2: Ảnh MRI não chuột để phát tế bào gốc cấy vào não [26]Hình a có sử dụng tế bào gốc đánh dấu hạt nanơ từ tính, hình bkhơng đánh dấu Độ tương phản tế bào đánh dấu khác biệt hẳn so vởi độ tương phản tế bào không đánh dấu 1.2 Tổng quan DNA DNA là chữ viết tắt axit 2’-deoxyribonucleic, nhà sinh học người Thụy Điển Miescher tìm vào năm 1869 nhân tế bào bạch cầu (tế bào mủ) Trang 10 Đồ án tốt nghiệp Long GVHD: TS Đặng Đức Theo hình 3.8, các băng DNA điện di có bề dày tăng dần từ mẫu a đến mẫu e Điều này cho thấy lượng DNA thu tăng dần với tăng lượng hạt sử dụng Kết này phù hợp với giá trị độ hấp thụ quang mà các mẫu bước sóng A260 Với kết thu được, có thể ước lượng tương đối lượng hạt nano sắt từ cần sử dụng để thu tách tối đa lượng DNA từ mẫu vi khuẩn có mật độ 10 tế bào/ml là 2,53 mg cho 1,5ml dịch nuôi cấy 3.2.5.Kết khảo sát nồng độ ethanol trình rửa hạt sắt từ Phức hệ DNA và hạt nano sắt từ sau thu tách cần xử lý để loại các ion, chất còn bám sót lại Ethanol với các nồng độ khác dùng làm chất loại rửa nghiên cứu này Tuy nhiên, vấn đề đặt là liệu DNA có bị rửa trôi, DNA có khả tan nước Vì vậy, các thí nghiệm khảo sát nồng độ ethanol dùng giai đoạn rửa tiến hành Kết khảo sát thể hình 3.9 Hình 3.9: Số lượng độ tinh DNA rửa tủa nồng độ ethanol khác Lượng DNA thu rửa tủa ethanol tuyệt đối cho giá trị A260 cao nhất; 0,63 Trong khi, lượng DNA thu giảm dần sử dụng ethanol nồng độ thấp làm chất rửa; cụ thể là giá trị A260 mẫu rửa với ethanol 99% và ethanol 70% đạt 0,55; mẫu rửa với ethanol 99% và ethanol 50% đạt 0,51 Trong đó, các mẫu đạt độ tinh với tỷ số A260/A280 nằm khoảng 1,8-2,0 Trang 36 Đồ án tốt nghiệp Long GVHD: TS Đặng Đức Hình 3.10: Kết điện di mẫu DNA rửa với ethanol nồng độ 1,2 : mẫu rửa với ethanol 50%, 99% 70% Kết điện các mẫu DNA rửa giải ethanol các nồng độ cho thấy khác rõ rệt lượng DNA thu lượng Băng DNA số 2, ứng với phương pháp rửa giải dùng ethanol 99% cho vạch DNA dày nhất Trong đó, lượng DNA băng sớ là nhất 3.2.6 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên khả thu hồi DNA Trong các nghiên cứu thu DNA hạt nano sắt từ khác giới, sau giai đoạn rửa tủa, DNA tách khỏi hạt sắt từ qua giai đoạn giải hấp Trong giai đoạn này, tủa DNA và hạt sắt từ hòa đệm TE 1X, và lắc 65oC Khi thêm đệm TE vào tủa để giải hấp, các phân tử nước sẽ tương tác với các phân tử DNA liên kết hydro và phá bỏ hấp phụ DNA và hạt sắt từ Nhiệt độ cao giúp đẩy nhanh quá trình giải hấp, nhiên, DNA dễ bị phân hủy nhiệt độ cao Vì vậy, khảo sát này thực để đánh giá ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ lên chất lượng DNA thu Các mức nhiệt độ khảo sát là 25oC, 37 oC và 65 oC Yếu tố pH, thời gian ủ, nồng độ NaCl và nồng độ ethanol giữ cố định pH = ,15 phút , 3M và 99 % Trang 37 Đồ án tốt nghiệp Long GVHD: TS Đặng Đức Hình 3.11: Số lượng độ tinh DNA giải hấp nhiệt độ khác Có giảm rõ rệt lượng DNA thu tăng giá trị nhiệt độ giả hấp (hình 3.11) Khi nhiệt độ giải hấp 65 oC, lượng DNA thu còn nửa lượng DNA thu giải hấp 25 oC Điều này khẳng định DNA đã bị phân giải nhanh chóng nhiệt độ cao Từ các khảo sát trên, quy trình thu tách DNA từ tế bào vi khuẩn hoàn chỉnh sau: Với mật độ dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis 109 tế bào/ml + Hút 1,5 ml mẫu dịch nuôi cấy cho vào eppendorf Sau đó, thực ly tâm 6000 vòng/phút, 10 phút để loại dịch và thu cặn tế bào + Kế tiếp, tiến hành ly giải màng tế bào: huyền phù tế bào 300µl đệm TE 1X pH = 8; tiếp theo, bổ sung 50 µl dung dịch NaCl 0,5 M và 50 µl dung dịch SDS 10% vào, vorted để trộn Sau đó, ủ dịch 65 oC 10 phút, ủ đá phút + Cho 500 µl đệm hỗ trợ gắn kết DNA và hạt nano sắt từ (PEG6000 10% và NaCl 3M) vào dịch ly giải Đảo trộn hỗn hợp cách lắc eppendorf xuôi ngược phút Tiếp đến, để yên eppendorf phút + Thêm 3mg hạt nano sắt từ vào ( ứng với 242µl huyền phù hạt sắt từ nước) Lắc hỗn hợp phút, sau đó đảo 10 lần, để yên phút + Tiếp theo, dùng nam châm hút lại hệ hạt nano sắt từ và DNA, loại dịch + Kế tiếp, rửa tủa lần 1ml ethanol 99%, rửa tiếp 500 µl ethanol 99%, lần Sau đó loại bỏ phần dịch + Giai đoạn tiếp đến, hòa tủa 200 µl đệm TE 1X, lắc phút + Sau cùng, thu lấy phần dịch chứa DNA và đem bảo quản Trang 38 Đồ án tốt nghiệp Long GVHD: TS Đặng Đức Trang 39 Đồ án tốt nghiệp Long GVHD: TS Đặng Đức CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Với kết nghiên cứu này đem lại, các kết luận rút sau: Hoàn chỉnh quy trình tổng hợp hạt sắt từ và tự tổng hợp sản phẩm mong muốn phương pháp đồng kết tủa với các thông số cụ thể: phản ứng thực điều kiện không có oxi, nhiệt độ môi trường tổng hợp 60oC, thành phần tham gia phản ứng gồm ml dung dịch FeSO 0,1 M và 5ml dung dịch FeCl3 0,2 M , 10 ml NH4OH 0,8M dùng làm chất khử , tốc độ nhỏ giọt giọt/giây Hạt nano sắt từ sau tổng hợp sẽ rửa hạt nước cất, đến pH nước rửa pH dừng rửa Sản phẩm lưu trữ dung mơi là nước đã sục khí trơ Việc thu tách DNA hạt sắt từ tự tổng hợp đã thành công; DNA tách đạt yêu cầu tinh Quy trình thu tách DNA gồm các bước: ly giải màng tế bào, gắn DNA với hạt sắt từ, rửa tủa và giải hấp thu hồi DNA Thành phần đệm dùng giai đoạn gắn gồm PEG 6000 10% và NaCl 3M Hóa chất dùng rửa tủa là ethanol tuyệt đới Quá trình giải hấp thực với đệm TE 1X pH=8 Kiến nghị: Trong quá trình thực nghiên cứu đã xảy vài điểm cần lưu ý và cần có biện pháp xử lý Thứ nhất, vấn đề kiểm tra lại kích thước hạt nano sắt từ đã tổng hợp Các mẫu hạt cần phải đem chụp TEM để xác định độ phân bớ kích thước hạt, từ tính hạt Từ kết thu có thể khẳng định cách xác chất lượng và độ ổn định hạt nano sắt từ tổng hợp Thứ hai, vấn đề bảo quản hạt nano sắt từ sau tổng hợp Sự có mặt oxi khơng khí và oxi hòa tan dung mơi bảo quản là yếu tố gây suy giảm từ Trang 40 Đồ án tốt nghiệp Long GVHD: TS Đặng Đức tính hạt nano sắt từ quá trình bảo quản Vì vậy, đề nghị sục khí argon vào dung dịch bảo quản chứa hạt nano sắt từ, đồng thời, sử dụng dụng cụ chuyên dụng bịt kín miệng dụng cụ chứa hạt nano sắt từ Mặt khác, nên lưu giữ hạt nano sắt từ các dụng cụ có dung tích nhỏ, hạn chế mở dụng cụ chứa Thứ ba, tượng các hạt nano sắt từ tự kết tụ với lực tương tác các hạt Để giải vấn đề này, có hai cách, là bảo quản hạt nano sắt từ các dung môi có các chất hoạt động bề mặt để phân tán đồng nhất các hạt dung môi, hai là phải đồng hóa hạt lần sử dụng Một hướng khác là bao phủ bề mặt hạt nano sắt từ các chất hóa học, từ đó làm các hạt tịch điện dấu, tạo lực đẩy các hạt Thứ tư, chất lượng DNA thu tách phương pháp sử dụng hạt nano sắt từ Kết điện di thu cho thấy các băng DNA không mịn, xuất các tia Điều này có lẽ DNA đã bị đứt gãy Vì vậy, cần sử dụng thêm các hóa chất bảo vệ DNA và biến tính các DNA Ngoài ra, để chắn DNA thu không bị đứt gãy sau đã sử dụng các biện pháp bảo vệ, cần thực các kỹ thuật kiểm tra toàn vẹn DNA Thứ năm, nghiên cứu này chưa thực khảo sát so sánh khả tách DNA hạt nano sắt từ với tách DNA phenol-cloroform Vì vậy nghiên cứu cần thực đồng thời hai phương pháp trên, từ đó có đánh giá khách quan Ngoài sử dụng hạt nano sắt từ thu tách DNA, giới, hạt nano sắt từ còn xử lý bề mặt sớ chất, ví dụ hạt nano sắt từ có gắn nhóm amin[30], hạt nano sắt từ có gắn nhóm cacboxyl [27] Một số nghiên cứu khác khảo sát ảnh hưởng diện tích bề mặt hấp phụ lên khả tách DNA thông qua việc dùng phức hợp cacbone nano tube [31] và hạt nano sắt từ Do đó, để có đánh giá toàn diện phương pháp thu DNA hạt nano sắt từ, cần tiến tổng hợp và xử lý bề mặt hạt oxit sắt từ với các nhóm–NH 2, - COOH Sau đó so sánh khả tách DNA các loại hạt oxit sắt từ : hạt trần, hạt gắn thêm nhóm chức bề mặt –NH2 và phức hệ hạt oxit sắt từ - cacbone nano tube Trang 41 Đồ án tốt nghiệp Long GVHD: TS Đặng Đức Một vấn đề đáng ý khác đó là thu tách RNA, protein RNA, đặc biệt là miRNA là đối tượng nhận nhiều quan tâm các nghiên cứu việc tầm soát và phát ung thư Một số nghiên cứu đã thực tách mRNA hạt nano sắt từ gắn nhóm –COOH và đạt thành công[32] Bên cạnh các ứng dụng thu tách các phân tử sinh học, hạt nano sắt từ sử dụng làm các chất nền, chất mạng các nghiên cứu cố định enzyme, dẫn truyền thuốc, tiêu diệt tế bào ung thư, ví dụ sử dụng protein conora cớ định hạt nano từ để xâm nhập vào tế bào ung thư [29] Do đó, đề nghị định hướng nghiên cứu cho ứng dụng hạt nano từ tính y sinh Trang 42 Đồ án tốt nghiệp Long GVHD: TS Đặng Đức Trang 43 Đồ án tốt nghiệp Long GVHD: TS Đặng Đức TÀI LIỆU THAM KHẢO A.Tài liệu nước: [1] Lê NgọcTú (2002) Hóa sinh công nghiệp Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [2] Nguyễn Hữu Đức, Trần Mậu Danh, Trần Thị Dung 2007 “Chế tạo và nghiên cứu tính chất từ các hạt nano Fe3O4 ứng dụng tinh sinh học” Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 23 231-237 [4] PGS.TS Trần Thị Xô, Th.S Nguyễn Thị Lan (2005) Cơ sở di truyền và công nghệ gen Nhà xuất Khoa học và Kỹ thuật [5] GS.Phạm Văn Tường (2007) Vật liệu vô Nhà xuất Đại học quốc gia Hà Nội Hà Nội [6] Th.S Ngơ Thái Bích Vân, Bài giảng thí nghiệm sở di truyền và cơng nghệ gen [7] Trần Yến Mi, Dương Hiếu Đẩu và Lê Văn Nhạn (2011) “Khảo sát ảnh hưởng nồng độ tiền chất lên khích thước từ tính hạt nano oxid sắt” Tạp chí Khoa học 20b, Đại học Cần Thơ 272-280 B.Tài liệu nước ngoài: [8] A Bandyopadhyay, S Chatterjee and K Sarkar 2011 “Rapid isolation of genomic DNA fromE coli XL1 Blue strain approaching bare magnetic nanoparticles” Current science, vol 101, no [9] Alexiou C, Arnold W, Klein R J, Parak F G, Hulin P, Bergemann C, Erhardt W, Wagenpfeil S and Lubbe A S (2000) “ Locoregional cancer treatment with magnetic drug targeting” Cancer Res 60 6641–8 [10]An-Hui Lu, E L Salabas, and Ferdi Schuth (2007) “ Magnetic Nanoparticles : Synthesis , Protection , Functionalization , and Application” Angewandte Chemie Int., Vol 46, pp 1222 – 1244 Trang 44 Đồ án tốt nghiệp Long GVHD: TS Đặng Đức [11] Enochs W S, Harsh G, Hochberg F and Weissleder R (1999) “Improved delineation of human brain tumors on MR images using a long-circulating, superparamagnetic iron oxide agent” J Magn Res Imag 228–32 [12] Hafeli U, Pauer G, Failing S and Tapolsky G (2001) “Radiolabeling of magnetic particles with rhenium-188 for cancer therapy” J Magn Magn Mater , 225, 73–8 [13] Hofmann W-K, de Vos S, Komor M, Hoelzer D, Wachsman W and Koeffler H P (2002) “ Characterization of gene expression of CD34+ cells from normal and myelodysplastic bone marrow” Blood 100 3553–60 [14] Liberti P A, Rao C G and Terstappen (2001) “Optimization of ferrofluids and protocols for the enrichment of breast tumor cells in blood” J Magn Magn Mater, 225 [15] Lubbe A S, Bergemann C, Riess H, Schriever F, Reichardt P, Possinger K, Matthias M, Doerken B, Herrmann F and Guertler R (1996) “Clinical experiences with magnetic drug targeting: a phase I study with 4-epidoxorubicin in 14 patients with advanced solid tumors” Cancer Res, 56 4686–93 [16] Mah C, Fraites T J, Zolotukhin I, Song S, Flotte T R, Dobson J, Batich C and Byrne B J (2002) “ Improved method of recombinant AAV2 delivery for systemic targeted gene therapy” Mol Therapy 6, 106–12 [17] Martina Pilloni et al 2010 “PEGylation and preliminary biocompatibity evaluation of magnetic-silica nanocomposites obtained by high energy ball milling” International Journal of Pharmaceutics , 103-112 [18]M Mohapatra and S Anand (2010) “Synthesis and applications of nanostructured iron oxides/hydroxides– a review” International Journal of Engineering, Science and Technology, Vol 2, No 8, pp 127-146 [19]Jin Xie 2003 “Synthesis, Modification, and Bioapplications of Magnetic Nanoparticles”, Nanjing University [20] Paul F, Melville D, Roath S and Warhurst D (1981) “A bench top magnetic Trang 45 Đồ án tốt nghiệp Long GVHD: TS Đặng Đức separator for malarial parasite concentration” IEEE Trans Magn MAG-17 , 2822 [21] Pedro Tartaj, Marıa del Puerto Morales1, Sabino Veintemillas-Verdaguer, Teresita Gonzalez-Carre no and Carlos J Serna (2003) “TOPICAL REVIEW :The preparation of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine” Journal of physics d: applied physics, Institute of physics publishing [22] Semelka R C and Helmberger T K G (2001) “Contrast agents for MR imaging of the liver” Radiology 218 ,27–38 [23] S P Gubin, Yu A Koksharov, G B Khomutov, G Yu Yurkov (2005) “Magnetic nanoparticles: preparation, structure and properties” Russian Chemical Reviews 74 , 489- 520 [24] Sonja Berensmeier (2006) “Magnetic particles for the separation and purification of nucleic acids” Appl Microbiol Biotechnol 73:495–504 [25] Sophie Laurent, Delphine Forge, Marc Port,Alain Roch,Caroline Robic,Luce Vander Elst and Robert N Muller (2008) “ Magnetic Iron Oxide Nanoparticles: Synthesis, Stabilization, Vectorization,Physicochemical Characterizations, and Biological Applications”, Chemical Reviews, Vol 108,pp 2064-2110 [26] Stroh A, Faber C, Neuberger T, Lorenz P, Sieland K, Jakob PM, Webb A, Pilgrimm H, Schober R, Pohl EE, Zimmer C (2005).Neuroimage 635-45 [27]Tapasree Roy Sarkar , Joseph Irudayaraj (2008) “Carboxyl-coated magnetic nanoparticles for mRNA isolation and extractionof supercoiled plasmid DNA” Analytical Biochemistry ,379, 130–132 [28] Widder K J, Morris R M, Poore G A, Howard D P and Senyei A E (1983) “Selective targeting of magnetic albumin microspheres containing low-dose doxorubicin—total remission in Yoshida sarcoma-bearing rats” Eur J Cancer Clin Oncol, 19,135–9 Trang 46 Đồ án tốt nghiệp Long GVHD: TS Đặng Đức [29]Wen Jiang, Kuilin Lai, Yao Wu, Zhongwei Gu (2014) “Protein corona on magnetite nanoparticles and internalization of nanoparticle–protein complexes into healthy and cancer cells” Pharmacal Research 37, 129-141 [30] Xiaoxiao He, Hailing Huo, Kemin Wang ,Weihong Tan, Ping Gong, Jia Ge (2007) “Plasmid DNA isolation using amino-silica coated magnetic nanoparticles (ASMNPs)” SienceDireact Talanta 73 (2007) 764–769 [31]Yossi Weizmann, David M Chenoweth và Timothy M Swager (2011) “DNA-CNT nanowire networks for DNA detection” J Am Chem Soc, 133(10), 3238–3241 [32] Z M Saiyed , C N Ramchand và S D Telang (2007) “Extraction of genomic DNA using magnetic nanoparticles (Fe3O4) as a solid-phase support” American Journal of Infectious Diseases 3,4, 225-229 Trang 47 ... 1.3.4.Thu tách DNA vi khuẩn hạt nano sắt từ Hiện giới, nhiều nghiên cứu khả tách chiết DNA hạt nano sắt từ thực hiện[ 8], [24] Bên cạnh việc sử dụng hạt trần nano sắt từ, các hạt nano sắt từ cải... hút bám protein lên hạt nano sắt từ [17] Từ các vấn đề nói trên, nghiên cứu thực hướng đến tìm phương pháp tách chiết DNA hạt nano sắt từ tự tổng hợp phòng thí nghiệm Trang Đồ án tốt nghiệp... nano sắt từ này dùng các thí nghiệm khảo sát các yếu tớ ảnh hưởng đến việc thu tách DNA vi khuẩn 2.2.1 Tổng hợp hạt nano sắt từ Phương pháp sử dụng để tổng hợp hạt nano sắt từ là phương