nghiên cứu thực hiện hướng đến tìm ra phương pháp tách chiết DNA mới bằng hạt nano sắt từ tự tổng hợp tại phòng thí nghiệm

Với sự phát triển nhanhchóng của mảng sinh học phân tử, nhu cầu tìm ra phương pháp tách chiết DNA sốlượng lớn, nhanh hơn, đơn giản hơn ngày càng cấp thiết .Các phương pháp tá

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Những ứng dụng của hạt nano từ tính trong lĩnh vực sinh học phân tử, y sinhđang được nghiên cứu ở nhiều nơi trên thế giới Việc tách chiết DNA, protein từ cácmẫu sinh học là một việc được tiến hành thường xuyên trong sinh học phân tử; côngviệc này còn có vai trò rất quan trọng trong chuẩn đoán y tế Một số bộ kit sử dụngvật liệu nano để tách chiết nhanh, nhạy DNA, protein đã được phát triển ở nướcngoài Nghiên cứu này hướng đến phát triển bộ kít như thế trên cơ sở sử dụng hạtnano từ tính tự tổng hợp Luận văn này gồm hai phần: tổng hợp hạt nano sắt từ theophương pháp đồng kết tủa và xây dựng quy trình tách DNA vi khuẩn bằng hạt sắt từđơn giản, nhanh và ít tốn kém tại phòng thí nghiệm

ABSTRACT

Applications of magnetic nanoparticles in molecular biology , biomedical are beinginvestigated around the world Isolation of DNA or proteins from various biologicalsources is a task carried out regularly in molecular biology It also plays a veryimportant role in medical diagnosis Several kits using nanomaterials to extractDNA or proteins quickly and sensitively have been developed in foreign countries This study aims to develop kits for that purpose on the basis of using magneticnanoparticles synthesized in house This thesis consists of two parts: the synthesis

of magnetic nanoparticles using coprecipitation method and build a simple, rapidand inexpensive DNA extraction protocol using magnetic nanoparticles inlaboratory

LỜI MỞ ĐẦU

Trong sinh học phân tử, việc tách chiết DNA, protein từ tế bào ra là 1 việc cầnđược tiến hành thường xuyên Ngoài vai trò quan trọng trong nghiên cứu, công việcnày còn có vai trò rất quan trọng trong chuẩn đoán y tế Với sự phát triển nhanhchóng của mảng sinh học phân tử, nhu cầu tìm ra phương pháp tách chiết DNA sốlượng lớn, nhanh hơn, đơn giản hơn ngày càng cấp thiết Các phương pháp táchchiết đang được sử dụng ở Việt Nam hiện nay là những phương pháp cổ điển, tốnkhá nhiều thời gian và thường sử dụng những hóa chất tương đối độc Một số bộ kit

sử dụng vật liệu nano để tách chiết DNA, protein từ tế bào đã được phát triển trênthế giới Việc phát triển bộ kit như thế ở trong nước sẽ góp phần tạo ra 1 sản phẩmcông nghệ sinh học và tính áp dụng cao

Vật liệu nano thể hiện rất nhiều tính chất đặc biệt và lý thú Một nhánh quantrọng của công nghệ nano, đó là lý sinh học nano, đã và đang được nghiên cứu rấtmạnh mẽ nhờ vào khả năng ứng dụng rất linh hoạt và hiệu quả của vật liệu nano[8],[18],[21],[24], [32] Trong tự nhiên, sắt là vật liệu có từ độ bão hòa lớn nhất tạinhiệt độ phòng, sắt không độc đối với cơ thể người và tính ổn định khi làm việctrong môi trường không khí nên các vật liệu như oxyd sắt được nghiên cứu rất nhiềuđể làm hạt nano từ tính

Những năm gần đây, hạt nano từ tính, cụ thể là hạt nano sắt từ được ứng dụngrộng rãi trong một số lĩnh vực của y sinh học, sinh học phân tử nhờ tính chất ưu việtcủa vật liệu nano từ ;kỹ thuật sử dụng chất mang từ tính đang trở thành công cụngày càng phổ biến để tách các phân tử sinh học như DNA, protein [8] , [24],[30],[32].Với mức kích thước nano, các hạt nano từ tính giúp cho chúng ta có thể thaotác ở qui mô phân tử và tế bào So với vật liệu từ dạng khối, hạt nano sắt từ Fe3O4

có lực kháng từ rất nhỏ (gần bằng không) và từ độ bảo hòa cao hơn nên chúng rấtnhạy với sự thay đổi của từ trường bên ngoài[7]

Có hai hướng tạo hạt nano sắt từ: thứ nhất là nghiền vật liệu khối đến kíchthước nano; thứ hai là tổng hợp hạt nano từ các nguyên tử Cách thứ hai đang được

Trang 2

sử dụng rộng rãi hơn so với cách thứ nhất vì hiệu suất cao, dễ thực hiện và dễ điềukhiển kích thước hạt tạo thành [7]

Bên cạnh khả năng thu tách DNA từ mẫu bằng hạt nano sắt từ, chất lượng và

độ tinh sạch DNA cũng là một yếu tố quan trọng cần phải đảm bảo Các hạt nanosắt từ có thể liên kết không chọn lọc với cả DNA và protein Do đó, quá trình thutách DNA cần sử dụng thêm chất giúp hấp phụ chọn lọc DNA với hạt nano sắt từ.Thông thường các phân tử protein chìa các nhóm ưa nước ra bề mặt, tạo nên khảnăng tan trong nước của protein Nồng độ muối cao là một yếu tố gây tủa protein,hạn chế sự hòa tan của protein trong môi trường[1] Polyethylene glycol (PEG) cótrọng lượng phân tử cao được nhận thấy có khả năng giảm sự hút bám của proteinlên hạt nano sắt từ [17]

Từ các vấn đề nói trên, nghiên cứu thực hiện hướng đến tìm ra phương pháptách chiết DNA mới bằng hạt nano sắt từ tự tổng hợp tại phòng thí nghiệm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Tổng quan về hạt nano sắt từ

1.1.1.Giới thiệu hạt nano sắt từ

Hạt nano là vật chất vật lý có tính chất khác biệt đáng kể so với vật liệu tươngứng ở kích thước khối, có đường kính nhỏ nhất bằng một nano mét và không lớnhơn 100 nm [23] Ôxit sắt từ là một chất rắn màu đen, có danh pháp IUPAC làiron(II) diiron(III) oxide Thành phần hóa học của ôxit sắt từ chứa cả sắt(II) vàsắt(III), với công thức hóa học là FeO.Fe2O3 hay là Fe3O4 Cấu trúc tinh thể của ôxitsắt từ thuộc dạng spinel đảo Mỗi ô cơ sở hay tế bào mạng của ôxit sắt từ gồm 8phân tử Fe3O4 , ứng với 8 khối lập phương nhỏ, trong đó có 32 anion và 24 cation.Các ion O2- sắp xếp thành các cấu trúc lập phương tâm diện Tám cation Fe2+ phânbố trong các cấu trúc tứ diện, mỗi ion Fe2+ bị bao quanh bởi 4 ion O2- Các ion Fe3+

chia làm hai loại: 8 cation tạo với 4 ion O2- trong không gian tứ diện, 8 ion Fe3+ cònlại bị bao quanh bởi 6 ion O2- bởi mạng bát diện [5] So với vật liệu khối, hạt nanooxit sắt từ thể hiện tính siêu thuận từ [7]; khi ở kích thước nano thì ferri từ biếnmất và chuyển động nhiệt sẽ thắng thế làm cho vật liệu trở thành vật liệu siêu thuậncó từ độ bão hòa cao và lực kháng từ gần bằng không

1.1.2 Các phương pháp tổng hợp hạt nano sắt từ

Các hạt nano sắt từ có thể được chế tạo theo hai hướng khác nhau Theohướng topdown thì vật liệu dạng khối sẽ bị phá vỡ, phân tán cấu trúc khối đến kíchthước nano, ví dụ như phương pháp nghiền Đối với nguyên tắc thứ hai, các hạtnano được hình thành từ các ion, nguyên tử, phân tử bằng các phương pháp nhưnhiệt phân, hóa siêu âm, phương pháp polyol, phương pháp đồng kết tủa, phươngpháp vi nhũ tương… So với hướng thứ nhất, hướng thứ hai đang được sử dụng rộngrãi hơn [7]

Trang 4

1.1.2.1 Phương pháp vi nhũ tương

Một hệ vi nhũ tương gồm 3 thành phần pha dầu, pha nước và chất hoạt động

bề mặt Hệ nhũ tương chứa các giọt nhỏ (mixen) của một pha khác (phân cực hoặckhông phân cực) phân tán trong pha liên tục Các vi nhũ tương này có thể là pha dầutrong pha nước hoặc pha nước trong pha dầu, phụ thuộc vào nồng độ của các thànhphần khác nhau Chất hoạt động bề mặt được dùng làm giảm sức căng bề giữa cácpha phân tán và pha liên tục, từ đó giúp ổn định hệ nhũ tương Bằng cách thay đổinồng độ của pha phân tán và nồng độ của chất hoạt động bề mặt, kích thước của cácgiọt mixen có thể được điều chỉnh 1-100nm [18].Do sự giới hạn về không gian, sựhình thành và phát triển các hạt nanô bị hạn chế và tạo nên các hạt nanô đồng nhất

Hình 1.1: Cơ chế hoạt động của phương pháp vi nhũ tương.

Cơ chế phản ứng trong hệ vi nhũ tương xảy ra như sau: hòa trộn các hệ vi nhũtương này lại với nhau thì các hạt vi nhũ tương của các chất phản ứng gặp nhau Khicác hạt vi nhũ tương hòa trộn vào nhau, phản ứng hóa học giữa các chất trong

các giọt sẽ xảy ra Phản ứng xảy ra trong lòng hạt lớn và sản phẩm mong muốn được tạo thành Các hạt magnetite Fe3O4 sau khi tạo thành sẽ bị chất hoạt hóa bềmặt bao phủ và ngăn cản không cho phát triển thêm về kích thước

1.1.2.2 Phương pháp đồng kết tủa

Phương pháp đồng kết tủa gồm 2 giai đoạn liên quan: giai đoạn hình thànhmầm tinh thể và giai đoạn tăng trưởng kích thước mầm Khi nồngđộ tiền chất đạtđến mức bão hòa thì các mầm tinh thể bắt đầu được hình thành Sau đó , các hạtnhân sẽ phát triển chậm thông qua quá trình khuyếch tán của vật chất từ dung dịchlên bề mặt của các tinh thể

Để thu được hạt có độ đồng nhất cao, hai giai đoạn hình thành mầm và pháttriển mầm cần được phân tách [18],[21].Trong quá trình phát triển mầm, cần hạnchế sự hình thành của những mầm mới Một loạt các yếu tố có thể được điều chỉnhtrong quá trình tổng hợp các hạt nano oxit sắt để kiểm soát kích thước, từ tính hoặctính chất bề mặt Kích thước và hình dạng của các hạt nano có thể được điều chỉnhbằng cách điều chỉnh độ pH , sức mạnh ion , nhiệt độ, tính chất của muối…[13,[17],[18] [21] Khi nồng độ các tiền chất giảm thì kích thước tinh thể và từ độ bảo hòacủa hạt cũng giảm theo [7],[18]

Ưu điểm chính của quá trình kết tủa là một số lượng lớn các hạt nano có thểđược tổng hợp Tuy nhiên, kiểm soát phân bố kích thước hạt là có hạn, bởi vì chỉ cócác yếu tố động được kiểm soát sự phát triển của các tinh thể

Phương pháp đồng kết tủa là một trong những phương pháp thường được dùngđể tạo các hạt ô-xít sắt

Với điều kiện tỉ lệ mol Fe3+/Fe2+ = 2, pH môi trường từ 9 – 14, cơ chế tổnghợp hạt nano Fe3O4 là:

Trang 6

Fe3+ + H2O  Fe(OH)x3-x (thông qua quá trình mất proton)

Fe2+ + H2O  Fe(OH)y2-y (thông qua quá trình mất proton)

Fe(OH)x3-x +2 Fe(OH)y2-y  Fe3O4 (thông qua quá trình ôxi hóa vàdehydride hóa)

Tổng hợp các phản ứng trên chúng ta có phương trình sau:

Fe2+ + 2Fe3+ + 8OH-  Fe3O4 + 4H2ONếu có ôxy thì Fe3O4 bị ô xi hóa thành sắt( III) hydroxyt theo phản ứng:

4Fe3O4 + O2 + 18H2O  12Fe(OH)3

1.1.3.Một số ứng dụng hạt nano sắt từ trong y sinh

Trên cơ sở các đặc tính ưu việt của các hạt nano sắt từ, chúng đã được ứngdụng rộng rãi trong một số lĩnh vực của y sinh học [10], [19],[17] ,[21],[23]

Các ứng dụng của hạt nano từ được chia làm hai loại: ứng dụng ngoài cơ thể vàtrong cơ thể Phân tách và chọn lọc tế bào, DNA là ứng dụng ngoài cơ thể nhằmtách những tế bào,DNA cần nghiên cứu ra khỏi các tế bào khác Các ứng dụng trong

cơ thể như dẫn thuốc, nung nóng cục bộ và tăng độ tương phản trong ảnh cộnghưởng từ …

a Phân tách và chọn lọc tế bào, DNA

Thu tách một loại thực thể sinh học để làm tăng nồng độ khi phân tích hoặcdùng vào các mục đích khác là việc làm thường xuyên trong sinh học phân tử, ysinh Phương pháp phân tách, chọn lọc bằng cách sử dụng các hạt nanô từ tính đã vàđang được nghiên cứu để đưa vào ứng dụng trong thực tế Hai bước cơ bản của quátrình phân tách gồm có đánh dấu và tách các đối tượng nghiên cứu được đánh dấu

ra bằng từ trường Việc đánh dấu được thực hiện nhờ các hạt nanô từ tính, thườnglà hạt oxit sắt từ Các hạt nanô từ tính được bao phủ bởi một loại hóa chất có tínhtương hợp sinh học, từ đó có thể tạo ra các liên kết với các phân tử sinh học cần thu

tách Quá trình phân tách được thực hiện nhờ một gradient từ trường ngoài Các hạt

từ tính có mang các tế bào được đánh dấu sẽ bị từ trường giữ lại

Một số nghiên cứu đã thực hiện và ứng dụng thành công việc phân tách tế bàobằng hạt nano từ tính dưới tác động của từ trường Thu tách tế bào ung thư máu

nhờ từ trường là một trong những phương pháp rất nhạy để có thể tế bào ung thư từmáu, đặc biệt là khi nồng độ tế bào ung thư rất thấp [14] Các kí sinh trung sốt réttrong máu có thể được phát hiện bằng cách đo từ tính của kí sinh trùng đã đánh dấutừ[20] Trong phản ứng PCR khuyếch đại ADN, quá trình làm giàu ADN ban đầucũng được thực hiện nhờ hạt nanô từ tính[13] Với nguyên tắt tương tự như phântách tế bào, hạt nanô từ tính được dùng để phân tách DNA

b Dẫn truyền thuốc

Các hạt từ tính được dùng làm chất mang thuốc đến vị trí cần thiết trên cơ thể đã

được nghiên cứu từ những năm 1970 Dẫn truyền thuốc bằng hạt nano từ tính đem

lại các lợi ích như thu hẹp phạm vi phân bố của các thuốc trong cơ thể nên làm giảmtác dụng phụ của thuốc, khắc phục được nhược điểm của hóa trị liệu - tính khôngđặc hiệu và giảm lượng thuốc điều trị Khi các hạt mang thuốc đi vào mạch máu,dưới tác dụng của một gradient từ trường ngoài, các hạt tập trung vào vùng có từtrường mạnh đó trên cơ thể Tại vị trí cần trị liệu thì quá trình nhả thuốc có thể diễn

ra thông qua cơ chế hoạt động của các enzym hoặc các tính chất sinh lý học do các

tế bào ung thư gây ra như độ pH, quá trình khuyếch tán hoặc sự thay đổi của nhiệt

độ [9]

Một số nghiên cứu thử nghiệm dẫn truyền thuốc được thực hiện thành công trênđộng vật, ví dụ như việc hướng thuốc doxorubicin đến tế bào u bướu ở đuôi chuột[28] Nghiên cứu thử nghiệm lên người cũng được thự hiện với chất lỏng từ tínhcho 14 bệnh nhân Nghiên cứu cho thấy người ta có thể dẫn các hạt nanô từ tính đếncác u bướu trong cơ thể người mà không gây độc cho cơ thể.[15]

Trang 8

Hạt nanô từ tính còn được gắnvới nuclide phóng xạ (radionuclide) nhằm tiêudiệt tế bào ung thư Hạt nanô từ tính giúp cho các nuclide này đến gần các mục tiêuvà lưu trú ở đó trong một thời gian dài Thử nghiệm trên khối u của chuột thấy rằngliều chiếu xạ khi dùng hạt nanô từ tính cao hơn so với sử dụng nuclide Rhenium-

188 không được dẫn bởi từ trường ngoài.[12]

Ứng dụng khác của hạt nano từ tính là trong trị liệu gen Một gen trị liệu đượcgắn với hạt nanô từ tính và được giữ cố định tại vị trí cần chuyển gen, do đó làm giatăng khả năng truyền gen và thể hiện gen[16]

c Tăng độ tương phản cho ảnh cộng hưởng từ

Sau quá trình hoạt động và lưu chuyển trong hệ tuần hoàn, hạt nano oxit sắt từcó thể được đào thải qua gan và được phát hiện bởi màng lưới nội mô của cơ thể

Do vậy, mật độ hạt nanô ở các cơ quan là khác nhau gây ra sự nhiễu loạn từ trườngđịa phương cũng khác nhau, kết quả là độ tương phản trong ảnh cộng hưởng từ hạtnhân của các mô khác nhau Những hạt có kích thước nhỏ sẽ có thời gian tồn tạitrong cơ thể lâu hơn vì màng lưới nội mô nhận biết chúng khó hơn Mặc khác mànglưới nội mô của các tế bào ung thư hoạt động không hiệu quả như các tế bào khỏemạnh thông thường Dựa trên điều này, đã xác định được tế bào ung thư gan [22], tếbào ung thư não[11]

Hình 1.2: Ảnh MRI của não chuột để phát hiện tế bào gốc cấy vào trong não [26]Hình a có sử dụng các tế bào gốc đánh dấu bởi các hạt nanô từ tính, hình bkhông được đánh dấu Độ tương phản của các tế bào được đánh dấu khác biệt hẳn so vởi độ tương phản của các tế bào không được đánh dấu

1.2 Tổng quan về DNA

DNA là chữ viết tắt của axit 2’-deoxyribonucleic, được nhà sinh học ngườiThụy Điển Miescher tìm ra vào năm 1869 trong nhân tế bào bạch cầu (tế bào mủ).Đầu tiên ông gọi nó là nuclein có nghĩa là hạch nhân Sau đó, ông đã phát hiện ra nócó bản chất axit và gọi nó là axit nucleic Sau hơn 80 năm cùng với sự tranh cãi củanhiều nhà khoa học, đến năm 1952, người ta mới công nhận DNA là vật chất ditruyền, mang thông tin mã hóa cho hoạt động sinh trưởng và phát triển của các vậtchất hữu cơ bao gồm cả một số virus DNA thường được coi là vật liệu di truyền ởcấp độ phân tử tham gia quyết định các tính trạng [4]

Đơn vị cơ bản cấu tạo nên DNA là nucleotide, gồm 3 thành phần chính: bazơnitơ dạng purine hoặc pyrimidine (A,T,C,G), đường pentose và axitphosphoric(H3PO4) Ba thành phần này có tỷ lệ 1:1:1 và chúng liên kết với nhau tạothành một nucleotide[4] Phân tửDNA bình thường là một phân tử chuỗi xoắn kép,Mỗi nucleotide ở DNA liên kết một cách chọn lọc với nucleotide ở chuỗi đối diện:

A liên kết với T, G liên kết với C theo nguyên tắc bổ sung

Trang 10

Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long

Trong lĩnh vực sinh học phân tử, DNA thường là đối tượng nghiên cứu, đốitượng xử lý cơ bản đầu tiên cho các công việc nghiên cứu tiếp theo Các kỹ thuậtliên quan tới DNA đem lại nhiều ứng dụng đáng kể và lợi ích to lớn, như là kỹ thuậtDNA tái tổ hợp - được dùng để sản xuất các chế phẩm sinh học tính khiết sử dụngtrong chẩn đoán hoặc điều trị hoặc một số mục đích sinh học khác nhau Ứng dụngcủa DNA trong chuyển gen như giúp chuyển một gen quy định một tính trạng nàođó từ sinh vật này sang sinh vật khác, có thể từ loài này sang loài khác Đây là cơ sởtiền đề cho nhiều lợi ích như việc tạo ra các giống cây mới ưu việt hơn

về năng suất , khả năng chịu hạn hay chống sâu bệnh, phương pháp chữa bệnh bằngliệu pháp gen …Kỹ thuật khuyếch đại DNA đã cung cấp cho chúng ta một phươngtiện chẩn đoán trước sinh chính xác đối với các bệnh di truyền Trong pháp y, hình

sự, DNA còn được dùng làm đối tượng cho công nghệ chỉ điểm DNA với các mụcđịch: xác định quan hệ phụ hoặc mẫu hệ ;nhận dạng tội phạm cũng như loại trừ nghican thông qua dấu vết của cơ thể để lại hiện trường; nhận dạng cá nhân, nạn nhân

vô thừa nhận

1.3.Một vài phương pháp tách chiết DNA

Về cơ bản, mẫu cần thu tách DNA sẽ trải qua giai đoạn phá hủy màng tế bào.DNA nằm trong dịch thô sau khi ly giải màng tế bào được thu tách nhờ sử dụngdung dịch muối có nồng độ cao Protein và các tạp chất sẽ bị keo tụ dưới tác dụngcủa nồng độ muối cao, ví dụ như muối natri acetat, kali acetat… Sau đó, các kết tủanày bị loại bỏ bằng phương pháp ly tâm, DNA trong pha lỏng sẽ được thu hồi bằngcách tủa trong ethanol.

Ưu điểm của phương pháp là tính đơn giản, dễ thực hiên Tuy nhiên, phươngpháp có nhược điểm lớn là không đảm bảo được độ tinh sạch của DNA, do khôngloại bỏ được hoàn toàn protein và các tạp chất khác ra khỏi DNA Sau khi thu được,DNA cần xử lý thêm với các biện pháp tinh sạch như xử lý với RNAse, thẩm táchhay tái tủa trong ethanol

1.3.2 Phương pháp tách chiết DNA bằng phenol-chloroform

Tách chiết bằng phenol-chloroform dựa vào khả năng phân tách lỏng-lỏng của các phân tử có tính tan khác nhau trong hỗn hợp hai chất lỏng không tan vào nhau.Việc tách chiết axit nucleic bao gồm việc bổ sung một lượng bằng nhau của phenol-chloroform vào dịch mẫu, sau đó phối trộn và tạo điều kiện tách pha bằng ly tâm.Có hai pha chính tạo thành là : pha hữu cơ phía dưới và pha nước phía trên Hai phatrên được ngăn cách với nhau bởi một lớp mỏng, thường có màu trắng, hay còn gọilà pha trung gian

 Vai trò của phenol axit:

Biến tính, kết tủa protein và các thành phần khác: Phenol liên kết với lõi kỵnước của protein , kết quả làm protein trương phồng lên và lộ xuất nhóm bên kịnước (của gốc amino acid) ra ngoài Các nhóm kị nước này của protein khi đó kếthợp với nhau, gây kết tủa các phân tử protein Phenol cũng tương tác với cácpolyme (bao gồm các carbohydrat) Các chất này tạo phân bố tập trung tại lớp phâncách giữa các pha Đối với các chất béo thì hòa tan trong pha hữu cơ bên dưới

 Vai trò của chloroform:

Trang 12

Chloroform trộn với phenol cho hiệu quả tốt hơn trong việc làm biến tínhprotein so với khi sử dụng đơn lẻ từng chất này Chloroform cũng có tác dụnglàmbiến tính protein nhưng nó còn có tác dụng loại bỏ hoàn toàn phenol ra khỏiphần dung dịch có chứa DNA, giúp tăng năng suất thu hồi DNA.

1.3.3.Phương pháp tách chiết theo gradient tỷ trọng muối cesium chloride

Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào sự phân bố theo tỷ trọng của DNA

trong dung dịch muối cesium chloride dưới tác dụng của lực ly tâm.

Dịch thu được sau khi ly giải tế bào (có chứa DNA) được tủa trong alcohol.Sau đó, huyền phù tủa này trong cesium chloride và ethidium bromide, rồi ly tâmtrong vài giờ Dựa vào khả năng tạo liên kết với DNA và khả năng phát sáng của

ethidium bromide dưới tác dụng của tia tử ngoại, thu tách đúng dải DNA nằm trongtube ly tâm Tiếp theo, chiết tách lấy DNA trong isopropanol để loại bỏ ethidiumbromide, rồi tủa thu DNA trong ethanol

Phương pháp này cho hiệu quả tinh sạch DNA cao, tuy nhiên lại tốn thời gian,tốn kém hóa chất và hóa chất sử dụng độc hại

1.3.4.Thu tách DNA vi khuẩn bằng hạt nano sắt từ

Hiện nay trên thế giới, nhiều nghiên cứu về khả năng tách chiết DNA bằng hạtnano sắt từ được thực hiện[8], [24] Bên cạnh việc sử dụng hạt trần nano sắt từ, cáchạt nano sắt từ được cải tiến bề mặt cũng được nghiên cứu trong khả năng thu táchDNA, chẳng hạn như hạt nano từ được bọc silica và gắn nhóm –NH2 lên bề mặt[19],[30]

So sánh với phương pháp thu tách DNA trước đây, việc chiết tách bằng hạtnano sắt từ có những điểm lợi thế hơn Với phương pháp cổ điển, truyền thống ,táchchiết bằng phenol-chloroform, nhược điểm của phương pháp này là sử dụng hóa

chất độc hại và quy trình tách chiết phức tạp[30] Đối với tách chiết DNA bằng hạtnano từ kết hợp với hệ đệm phù hợp, bên cạch việc hạn chế tiếp xúc với hóa chấtđộc hại, quy trình thu DNA đơn giản hơn, nhanh hơn[30].

Nhìn chung, quy trình thu tách DNA bằng vật liệu từ gồm 5 bước: phá hủymàng tế bào, hấp phụ DNA lên hạt nano từ, thu tách DNA- hạt nano từ ra khỏi môitrường, rửa loại tạp chất và giải hấp thu dịch DNA.[32]

Hình1.5: Sơ đồ thu tách DNA bằng vật liệu từ.

Thành phần dịch tế bào sau ly giải gồm nhiều chất khác nhau Để hạt sắt từhấp phụ một cách có chọn lọc DNA lên bề mặt, mà không phải là hấp phụ protein,các phương pháp xử lý được đề ra

Trong chiết tách DNA bằng hạt trần nano sắt từ, quá trình gắn chọn lọc DNAvà hạt trần sắt từ cần sự hỗ trợ của đệm hỗ trợ gắn kết DNA và hạt nano sắt từ thíchhợp PEG ( polyethylene glycol) được sử dụng làm thành phần trong đệm hỗ trợ gắnkết DNA và hạt nano sắt từ PEG làm giảm khả năng hấp phụ của protein dựa trên

cơ sở là lực đẩy không gian và tính ưa nước [17] Một thành phần khác trong đệm

hỗ trợ gắn kết DNA và hạt nano sắt từ là NaCl [8], [32] Natri clorua được dùng nhưmột chất gây biến tính, keo tụ protein giúp hạn chế protein bám lên hạt sắt từ

PEG

Hình 1.6: Phản ứng tổng hợp hạt nano sắt từ

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1.Vật liệu nghiên cứu

2.1.1.Đối tượng nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, hạt nano từ là một trong các đối tượng nghiên cứu , vớicác khảo sát nhằm tổng hợp được hạt nano có từ tính mạnh dùng cho nghiên cứutách chiết DNA vi khuẩn bằng hạt nano sắt từ

Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được chọn làm đối tượng cho nghiên cứu

khảo sát tách chiết DNA vi khuẩn bằng hạt nano từ Nguồn giống được cung cấpbởi phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Khoa Hóa, Đại học Bách Khoa, Đại họcĐà Nẵng

Danh pháp khoa học của Bacillus subtilis:

PEG PEG

PEG

PEG

Trang 16

Hình 2.1: Trực khuẩnBacillus subtilis.

(Ohaus, Mỹ), máy máy đo pH (Mettler Toledo, Thụy Sĩ), khuấy từ gia nhiệt(IKA,Ý), máy siêu âm khô.

Dụng cụ dùng cho thí nghiệm thu tách DNA vi khuẩn bằng hạt nano sắt từgồm micropipet đơn kênh các loại, nam châm Các thiết bị được sử dụng như máy

ly tâm (Mikro 220), máy quang phổ UV-Vis (Bio-Rad, Mỹ), tủ lạnh (Sanyo), nồihấp thanh trùng (ALP, Nhật), máy điều nhiệt (Huber, Đức) , bộ dụng cụ cung cấpkhí argon, bộ thiết bị điện di

2.1.3.Hóa chất-Môi trường

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu này có nguồn gốc từ Trung Quốc, ViệtNam, Nhật, Mỹ, Đức

Cao thịt, cao nấm, polyethylene glycol (PEG) 6000 có nguồn gốc từ Đức.Sodium dodecyl sulfate có nguồn gốc từ Nhật Agarose, tris base có nguồn gốc từ

Mỹ Agar, dung dịch NH4OH có nguồn gốc Việt Nam; dung dịch TBE 10X Rad), ethidium bromide.Các hóa chất khác có nguồn gốc Trung Quốc

(Bio-Môi trường sử dụng để nuôi Bacillus subtilics là môi trường LB Thành phần

môi trường LB gồm cao thịt 10 g/l; cao nấm men 5 g/l; NaCl 10 g/l; pH 7,0

2.2.Phương pháp nghiên cứu

Để thực hiện nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố ảnhhưởng đến kích thước và từ tính của hạt nano sắt từ được tổng hợp theo phươngpháp đồng kết tủa Sau đó, hạt nano sắt từ này được dùng trong các thí nghiệm khảosát các yếu tố ảnh hưởng đến việc thu tách DNA vi khuẩn

2.2.1 Tổng hợp hạt nano sắt từ

Phương pháp được sử dụng để tổng hợp hạt nano sắt từ là phương pháp đồngkết tủa Về nguyên tắc tổng hợp, hỗn hợp dung dịch sắt (II) sulfate và sắt (III) cloridđược gây kết tủa trong môi trường kiềm.

Trong giai đoạn đầu, quá trình tổng hợp hạt nano từ tiến hành trong điều kiệnthường không sục khí trơ Một số các yếu tố được khảo sát, từ đó đề ra quy trìnhphù hợp Sau đó, quy trình này được lặp lại trong điều kiện khí trơ và khảo sát thêmyếu tố ảnh hưởng khác nhằm tìm ra quy trình phù hợp

2.2.1.1 Khảo sát một vài yếu tố ảnh hưởng lên kích thước, từ tính hạt nano sắt

từ với sự có mặt của oxi

Các thí nghiệm khảo sát được thực hiện trong điều kiện không sục khí trơ

a Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ phòng và 60 o C.

Để đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ, các thí nghiệm với hai mức nhiệt

độ khảo sát là 60 oC và nhiệt độ phòng, với số lần lặp là 3 lần Quy trình thí nghiệm

được thực hiện như sau: phối trộn 5 ml dung dịch FeSO4 0,1 M và 5ml dung dịchFeCl3 0,2 M Nhiệt độ phản ứng được duy trì ổn định ở 60oC hoặc ở nhiệt độ phòng,hỗn hợp được khuấy trộn với tốc độ khuấy từ 400 vòng/phút Tiếp theo, 10 mldung dịch NH4OH 0,4M được nhỏ giọt vào hỗn hợp trên với tốc độ 1 giọt/giây Kếtthúc phản ứng, các hạt sắt từ được thu lại bằng nam châm, rồi được rửa bằng nướccất, đến khi pH nước rửa về 7

Giá trị pH của nước rửa hạt sắt từ được xác định bằng cách sử dụng giấy đopH

Trang 18

b Ảnh hưởng của thứ tự thêm dung dịch NH 4 OH vào dung dịch muối sắt và ngược lại:

Hai quy trình thí nghiệm được thực hiện với các thông số như sau: chất phảnứng gồm10 ml dung dịch sắt (II) sulfate 0,1 M và sắt (III) clorid; 10ml dung dịch

NH4OH 0,4 M; nhiệt độ phản ứng 60oC; tốc độ nhỏ giọt 1 giọt/giây; tốc độ khuấy từ

400 vòng/phút Trong thí nghiệm thứ nhất, dung dịch NH4OH được thêm vào hỗnhợp muối sắt, quy trình thực hiện tương tự quy trình khảo sát ảnh hưởng của nhiệt

độ Với thí nghiệm thứ hai, hỗn hợp muối sắt được thêm vào dung dịch NH4OH.Đối với thí nghiệm thứ hai, môi trường phản ứng được gia nhiệt đến 60oC trước khicho dung dịch NH4OH vào bình phản ứng Kết thúc phản ứng, các hạt sắt từ đượcthu lại bằng nam châm và bằng nước cất, đến khi pH nước rửa về 7

c Khảo sát ảnh hưởng của việc siêu âm phá mẫu:

Trộn 5 ml dung dịch FeSO4 0,1 M và 5ml dung dịch FeCl3 0,2 M, hỗn hợpđược khuấy trộn với tốc độ khuấy từ 400 vòng/phút, nhiệt độ phản ứng duy trì ở

60oC Tiếp theo, 10 ml dung dịch NH4OH 0,4M được nhỏ giọt vào hỗn hợp trên vớitốc độ 1 giọt/giây Kết thúc phản ứng, thu lại các hạt sắt từ bằng nam châm, rồiđược rửa hạt bằng nước cất, đến khi pH nước rửa về 7

Hạt thu được ở trên được chia làm hai mẫu Một mẫu được đem đi siêu âm ởmức 20kHz, mỗi lần siêu âm 2 phút, lập 5 lần Mẫu thứ hai không được đem đi siêuâm

2.2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của oxi lên từ tính hạt nano sắt từ

Khí argon được sử dụng làm chất tạo môi trường trơ, loại oxi ra khỏi môitrường phản ứng tổng hợp hạt nano sắt từ

Hai quy trình tổng hợp được thực hiện, lặp 3 lần Với quy trình thứ nhất, phảnứng được thực hiện trong môi trường có sục khí trơ Trong quy trình thứ hai, hạtnano sắt từ được tổng hợp với sự có mặt của oxi, quy trình thực hiện tương tự nhưtrên, nhưng có sục khí argon.

Trình tự tiến hành được trình bày trong sơ đồ dưới đây:

Hình 2.2: Sơ đồ quy trình tổng hợp hạt nano sắt từ

trong điều kiện không có oxi

Trang 20

Thêm 10 ml dung dịch NH4OH 0,4M vào, 1 giọt/giây

Thu lại hạt từ và rửa bằng nước cất đến khi pH nước rủa về 7

Gia nhiệt môi trường thí nghiệm lên 60 oC

Sục khí trơ Ar vào liên tục

Cho hỗn hợp 10ml FeSO4 0,1 M và FeCl3 0,2 M vào, khuấy từ 400 vòng/phút, 60 oC

Siêu âm 20kHz

Hình 2.3: Hệ thống tổng hợp hạt sắt từ trong điều kiện không có oxi.

Hình 2.4: Sơ đồ hệ thống phản ứng tổng hợp hạt nano sắt từ

Khí argon vào

Dung dịch NH4OH

Khí argon ra

Dung dịch muối sắt(II) và sắt (II)

Gia nhiệt, khuấy từMôi trường gia

nhiệt 60oC

2.2.1.3.Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol Fe 2+ : Fe 3+ :OH - lên chất lượng hạt sắt từ

Ở các thí nghiệm trước, tỷ lệ mol Fe2+: Fe3+:OH- được lựa chọn phản ứng là1:2:8, tương ứng với tỷ lệ mol cơ bản trong phản ứng đồng kết tủa tổng hợp hạt sắt

từ Thí nghiệm tiếp theo được thực hiện nhằm đánh giá và tìm tỷ lệ mol thích hợp,quy trình thực hiện tương tự quy trình tổng hợp hạt nano sắt từ trong môi trường khítrơ.Các tỷ lệ mol Fe2+: Fe3+:OH- được khảo sát là:

+ Fe2+: Fe3+:OH- = 1:2:8 Tương ứng với 5 ml Fe2SO4 0,1 M ; 5ml FeCl3 0,2

2.2.2.Thu tách DNA bằng hạt nano sắt từ

2.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH

Dịch tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis sau khi nuôi qua đêm được thu nhận và

tiến hành ly giải phá màng tế bào bằng SDS pH môi trường được duy trình bằngđệm TE 1X Dịch ly giải được trộn đều với đệm hỗ trợ gắn kết DNA và hạt nano sắt

từ (PEG 6000 10%, NaCl 1,5 M), rồi ủ với 1mg hạt nano sắt từ trong 10 phút Tiếptheo, loại thu giữ hạt nano sắt từ và rửa trong ethanol tuyệt đối, rồi rủa với ethanol70% Sau cùng, giải hấp DNA khỏi hạt nano sắt từ bằng đệm TE 1X, pH=8

Các giá trị pH môi trường khảo sát là 7, 8, 9 và 10 Số thí nghiệm lặp là 5 lần.Quy trình thu tách DNA bằng hạt nano sắt từ được trình bày cụ thể ở phụ lục 1 Saukhi được thu tách, DNA được đáng giá bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang ở bước sóng A260 và A280

Trang 22

2.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ủ

Các thí nghiệm khảo sát thời gian ủ hạt nano sắt từ với dịch ly giải tế bào đượcthực hiện ở pH = 8 Các giá trị khảo sát là 5 phút, 10 phút, 15 phút và 20 phút, thínghiệm lặp 5 lần Lượng DNA tách được đáng giá bằng phương pháp đo độ hấp thụquang ở bước sóng A260 và A280

Quy trình thí nghiệm khảo sát thời gian ủ được thực hiện với các thông số cụthể đã được thể hiện trong phụ lục 2, yếu tố được thay đổi là thời gian ủ hạt nano sắt

từ với dịch ly giải

2.2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaCl

Nhằm mục đích tìm nồng độ NaCl thích hợp, cho hiệu quả cao trong loại bỏprotein trong quá trình gắn DNA với hạt sắt từ, các nồng độ NaCl khác nhau được

sử dụng trong thành phần đệm hỗ trợ gắn kết DNA và hạt nano sắt từ

Yếu tố pH và thời gian ủ được giữ cố định lần lượt ở pH = 8 và 5 phút Cácmức nồng độ NaCl được khảo sát là 1,5M ; 2M ; 2,5 M và 3M, số lần lặp bằng 5

Sử dụng phương pháp đo độ hấp thụ quang A260 và A280 để xác định lượngvà độ tinh sạch của DNA Phương pháp điện di cũng được dùng để đánh giá chấtlượng DNA tách được.Quy trình thực hiện cụ thể được trình bày trong phụ lục 3

2.2.2.4 Khảo sát lượng hạt sắt từ cần sử dụng cho thu DNA

Mục đích thí nghiệm này là nhằm tìm ra khoảng lượng hạt sắt từ phù hợp, giúp

thu được tối đa DNA từ số lượng tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis đã biết Dịch nuôi cấy qua đêm của Bacillus subtilis được đo mật độ quang OD600 để xác định mật độ

tế bào Các mức lượng hạt sắt từ khảo sát là 1mg; 1,5 mg; 2mg; 2,5 mg và 3 mg

Giữ cố định các yếu tố pH =8, thời gian ủ 5 phút và thành phần đệm hỗ trợ gắnkết DNA và hạt nano sắt từ là PEG 6000 10%, NaCl 3M Số thí nghiệm lặp bằng 3.Đáng giá lượng DNA thu tách được bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang ở bướcsóng A260 và A280 và phương pháp điện di.Quy trình thí nghiệm được trình bàytrong phụ lục 4.

2.2.2.5.Khảo sát các nồng độ ethanol trong giai đoạn rửa tủa

Ethanol được dùng làm chất rửa loại các tạp chất ra khỏi liên kết với hạt sắt từ,dựa vào đặc tính hòa tan được cả chất vô cơ và hữu cơ Ba tổ hợp các mức nồng độ ethanol khác nhau được khảo sát là ethanol 99% với ethanol 70%; ethanol 99% vàethanol 99% với ethanol 50%

Đáng giá lượng DNA thu tách được bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang ởbước sóng A260 và A280 và phương pháp điện di.Quy trình thực hiện với các thôngsố cụ thể được trình bày trong phụ lục 5

2.2.2.6 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng thu hồi DNA

Các mức nhiệt độ khảo sát: 25oC, 37oC và 65oC Số thí nghiệm lặp là 3 Sửdụng phương pháp đo độ hấp thụ quang A260 và A280 để xác định lượng và độ tinhsạch của DNA Phương pháp điện di cũng được dùng để đánh giá chất lượng DNAtách được

Quy trình thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ được thực hiệnvới các thông số cụ thể đã được thể hiện trong phụ lục 6

2.2.3.Phân tích dữ liệu

Trang 24

Sau khi thu thập, dữ liệu được xử lý trên chương trình Microsorf Excel 2007(Microsoft Edition, Microsoft Corporation, USA) để tính toán giá trị trung bình(mean/average) và sai số chuẩn (s.d: standard deviation) Các đồ thị được dựngbằng ứng dụng trong chương trình Microsorf Excel 2007.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Ảnh hưởng của vài yếu tố lên từ tính, kích thước hạt nano sắt từ

3.1.1.Tác động của nhiệt độ, thứ tự phối trộn các chất phản ứng và sóng siêu

âm lên từ tính và kích thước hạt nano sắt từ với sự có mặt của oxi

Với thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, hai quy trình thí nghiệmđược thực hiện như nhau, yếu tố thay đổi là nhiệt độ môi trường phản ứng Thínghiệm được tiến hành ở 60oC và thí nghiệm khác thực hiện ở nhiệt độ phòng.Đầu tiên, hạt nano sắt từ được tổng hợp theo phương pháp đồng kết tủa dungdịch muối FeSO4 0,1 M và dung dịch muối FeCl3 0,2 M trong dung dịch NH4OH0,4M Các mẫu sản phẩm thí nghiệm được huyền phù trong nước, từ đó được dùngđể so sánh với nhau

Do hạn chế về thiết bị, kích thước của hạt nano sắt từ tự tổng hợp chưa thể xácđịnh chính xác Thời gian hạt sắt từ lắng xuống đáy bình thủy tinh và tạo ra sự phânlớp được dùng để so sánh tương đối kích thước của các mấu hạt sắt từ tổng hợpđược Thời gian để nam châm hút sạch hạt sắt từ ra khỏi môi trường dùng để sosánh tương đối từ tính của các mẫu sản phẩm

Trong khảo sát về nhiệt độ, kết quả so sánh cho thấy rằng mẫu hạt nano sắt từđược tổng hợp trong điều kiện nhiệt độ môi trường phản ứng 60oC bị hút bởi namchâm nhanh hơn, khi so với mẫu hạt tổng hợp ở nhiệt độ phòng

Sau đó, nhiệt độ môi trường thực hiện phản ứng tổng hợp hạt nano sắt từđược giữ cố định ở 60oC cho các thí nghiệm tiếp theo

Trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của sóng siêu âm, các hạt nano sắt từ