THỬ NGHIỆM PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA TRONG ĐẤT NHẰM KHẢO SÁT TÍNH ĐA DẠNG CỦA HỆ VI SINH VẬT TRONG MỐI QUAN HỆ TƯƠNG TÁC GIỮA TRÙN ĐẤT Pheretima sp.VÀ THỰC VẬT SIÊU HẤP THỤ KIM LOẠI NẶNG CÂY THƠM ỔI (Lantana Camara L.)

Hiện nay, vấn đề ô nhiễm kim loại nặng (KLN) trong đất ngày càng phức tạp (Pb, Cd, Mg, Zn, ….) đang xảy ra phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới

THỬ NGHIỆM PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA TRONG ĐẤT NHẰM KHẢO SÁT TÍNH ĐA DẠNG CỦA HỆ VI SINH VẬT TRONG

MỐI QUAN HỆ TƯƠNG TÁC GIỮA TRÙN ĐẤT Pheretima sp.VÀ

THỰC VẬT SIÊU HẤP THỤ KIM LOẠI NẶNG CÂY THƠM ỔI

(Lantana Camara L.)

MỤC LỤC Chương 1 MỞ ĐẦU

2.3 Ảnh hưởng lên sức khỏe cộng đồng dân cư

2.3.1 Tác hại đến hệ thống tạo huyết của cơ thể

2.7 Thực vật siêu hấp thu kim loại nặng

2.7.1 Khái niệm thực vật siêu hấp thụ ( Hyperaccumulator)

2.7.2 Nguyên nhân thực vật có khả năng hấp thụ kim loại nặng

2.10 Lợi ích đối với đất

Chương 3 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3 Chuẩn bị vật liệu thí nghiệm

3.4.2.2 Theo dõi sinh trưởng của cây

3.4.2.3 Thời gian thí nghiệm

3.4.2.4 Các chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm

3.4.3 Lấy mẫu và phân tích

3.4.3.1 Lấy mẫu

3.4.3.2 Các phương pháp trong phòng thí nghiệm

Chương 4 DỰ ĐOÁN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Dự đoán

4.2 Đề nghị

Tài liệu tham khảo

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PCR: Polymerase chain reaction

DGGE: Denaturing Gradient Gel Elecrophoresis

Bp : Base pair

DNA: Deoxyribonucleic acid

OD: Optical density

RNA: Ribonucleic acid

Ta: Annealing temperperature

Tm:Melting temperature

TE: Tris EDTA

TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA

EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid

UV: Ultra Violet

KLN: kim loại nặng

VSV: vi sinh vật

ppm: mg/l

Chương 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay, vấn đề ô nhiễm kim loại nặng (KLN) trong đất ngày càng phức tạp (Pb,

Cd, Mg, Zn, ….) đang xảy ra phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới Rác thải từ các nhàmáy công nghiệp (sản xuất pin, nhiệt điện, ximăng, nhuộm vải, hóa chất, khai thác mỏquặng, than, …), không ngừng gia tăng đã tạo ra một sức ép nghiêm trọng đến môitrường đất làm ảnh hưởng đến sức khỏe môi trường và con người

Để xử lý ô nhiễm đất các phương pháp truyền thống và hiện đại được đưa ra sựdụng như: rửa đất, cố định các chất ô nhiễm bằng hoá học - vật lý, xử lý nhiệt, trao đổiion, oxi hoá hoặc khử các chất ô nhiễm, là quá trình dài đòi hỏi nhiều vốn đầu tư,

kĩ thuật và công nghệ phức tạp Tuy nhiên các phương pháp này đòi hỏi chi phí cao và

có giới hạn về kĩ thuật Phương pháp sinh học phytoremediation ra đời gần đây, có thểkhắc phục được những nhược điểm trên Phương pháp này dựa trên cơ chế hấp thụ,chuyển hoá, chống chịu và loại bỏ kim loại nặng của một số loài thực vật

Nhằm tối ưu hoá khả năng xử lý ô nhiễm KLN đặc biệt là chì (Pb) trong đất bằngphương pháp phytoremediation Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu tiến hành sử dụngmột số loài thực vật có khả năng hấp thụ KLN gấp nhiều lần thực vật hấp thụ KLNthông thường được gọi là thực vật siêu hấp thu KLN Không chỉ vậy để tăng khả nănghoạt động của vùng rễ cây còn có sự kết hợp với một yếu tố rất quan trọng nữa là trùn

đất Pheretima sp Để cải thiện hoạt động của vùng rễ kích thích khả năng hấp thụ chìcủa cây, rút ngắn thời gian cải tạo môi trường đất bị ô nhiễm KLN.

Từ ý nghĩa thiết thực trên, trong phạm vi khoá luận tốt nghiệp, em đã thực hiện đềtài: “Thử nghiệm phương pháp tách chiết DNA trong đất nhằm khảo sát tính đa dạngcủa hệ vi sinh vật trong mối quan hệ tương tác giữa trùn đất Pheretima sp và thực vậtsiêu hấp thụ kim loại nặng cây thơm ổi (Lantana Camara L.)”

từ khu vực ở Biên Hoà

Đề tài thực hiện trong thời gian từ tháng 4/2008 đến tháng 8/2008

 Tiến trình thực hiện

Phần 1: Từ 1/4/2008 – 30/5/2008 bố trí thí nghiệm tại Phú An

Phần 2: Từ 1/6/2008- 15/7/2008 xử lý mẫu và phân tích các chỉ tiêu về đất ở trungtâm phân tích môi trường trường Đại học Nông Lâm

Phần 3: Từ 15/7/2008- 30/8/2008 phân tích hệ vi sinh vật trong đất tại trung tâmphân tích hoá sinh của trường

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Pb3(PO4)2 khác nhau trong đất như bị hấp phụ bởi các khoáng sét, chất hữu cơ hoặcoxit kim loại hoặc bị cố định dưới dạng các hợp chất Pb(OH)2, PbCO3, PbS, PbO,

Pb3(PO4)2 Chì bị hấp phụ trao đổi chỉ chiếm một lượng nhỏ (<5%) hàm lượng chìtrong đất Các chất hữu cơ có vai trò lớn trong việc tích lũy chì trong đất do hình thànhcác phức hệ với chì và chúng cũng làm tăng tính hoạt động của chì khi các chất hữu cơnày có tính hoạt động cao (Diệp thị Mỹ Hạnh, 2002)

Chì có khả năng kết hợp với các chất hữu cơ hình thành các chất bay hơi như(CH3)4Pb Trong đất, chì có khả năng thay thế ion K+ trong các phức hệ hấp phụ cónguồn gốc hữu cơ hoặc khoáng sét Khả năng hấp phụ chì tăng dần theo pH mà tại đóhình thành kết tủa Pb(OH)2 (Lê Huy Bá, 2000)

2.2 Các tác hại của chì

- Độc tính của chì có thể: làm ảnh hưởng đến hệ thống tạo máu, sự hình thành và

thoái hóa hemoglobin gây ra các rối loạn về huyết học

+ Trong nhiễm độc chì, trong máu xuất hiện các hồng cầu hạt kiềm (HCHK)

- Tác hại trên thận: làm suy giảm chức năng tuyến thượng thận, lọc cầu thận bị

giảm, gây ra hiện tượng đái máu vi thể và cao huyết áp

- Ảnh hưởng lên hệ thần kinh : gây rối loạn dẫn truyền, viêm não, đau đầu, run cơ,hoang tưởng và mất trí nhớ Nặng hơn có thể bị co giật, liệt và hôn mê

- Hệ tiêu hóa: gây ra các cơn đau bụng cấp tính, viêm dạ dày ruột mạn tính

- Hệ sinh sản: làm cho phụ nữ đẻ non, chết khi mới sinh, còn nam giới tổn thương

tinh hoàn, vô sinh và liệt dương Ngoài ra, chì còn có rất nhiều tác hại khác có thể kểđến như khả năng gây ra ung thư ở người (Yếu tố hoá học trong sản xuất – Nhiễm độchì)

2.4 Tình hình ô nhiễm chì

2.4.1 Trên thế giới

Hiện nay, nhiều vùng trên thế giới đã được xác định là bị ô nhiễm kim loại nặng ởmức độ cao ở lớp đất mặt nông nghiệp lượng chì vào khoảng 2 - 20 mg/kg, trung bìnhkhoảng 16 mg/kg (biến đổi tùy theo vị trí địa lý) (Bùi Cát Tuyến, 2007)

Bảng1: Mức kim loại nặng có tần suất cao (80%) và hàm lượng Fluorine Thụy Sĩ

16 - (24) – 38

6 - (18) – 35

5050

234 - (457) – 715

0,82005075250,8400

Ghi chú: số trong ngoặc là trị số trung bình

Theo kết quả điều tra đất ở 53 thành phố và thị xã ở nước Anh cho thấy, hầu hết đất

có hàm lượng chì tổng số vượt trên 200 mg/kg, ở nhiều vùng công nghiệp đã vượt quá

500 mg/kg, trong khi đất bình thường không bị nhiễm bẩn là <100 mg/kg (Lê VănKhoa, 2000)

Ở Mỹ, có khoảng 500.000 điểm ô nhiễm thì có hơn 217.000 điểm cần phải xử lý.Trong đó trên 10.000 điểm bị ô nhiễm KLN và nhiều điểm bị ô nhiễm với nồng độ rấtcao

Ở Bayonne, New Jersey có nhà máy chế tạo cáp thì nồng độ chì trong đất bề mặt(0- 15 cm) trung bình là 2.055 mg/kg, thay đổi từ 1.000 đến 6.500 mg/kg Ở lớp đấtsâu hơn (15-30 cm) nồng độ chì thấp hơn, thay đổi từ 780 đến 2.100 mg/kg, với nồng

độ trung bình là 1.280 mg/kg, và nồng độ chì ở độ sâu 30–45 cm nồng độ chì thay đổi

từ 280 đến 8.800 mg/kg

Ở Superfund Site, nơi diễn ra hoạt động tái chế pin, xưởng đúc và sau đó là hoạtđộng nấu kim loại, ô nhiễm chì nghiêm trọng Tổng lượng chì trung bình là 55.480 mg/

kg có thể đạt mức tối đa 140.500 mg/kg (EPA, 2000)

Tại Canada, hằng năm người ta phun thuốc diệt côn trùng trong các vườn cây ănquả với mức trung bình là 8,7 kg Pb/ha, làm cho đất bị ô nhiễm chì với hàm lượng lênđến 14.000 ppm (Mai Trọng Nhuận, 2001)

EPA ước lựơng có 23%, hay 18 triệu nhà riêng ở nước Mỹ xây trước năm 1980 cómức chì trong đất trên 400 ppm, 3%, hay 2,5 triệu căn hộ có mức chì trên 2000 ppm vàcũng có khoảng 3% hay 2,5 triệu căn hộ có mức chì vượt quá 5000 ppm (EPA, 1996)

2.4.2 Ở Việt Nam

Nước ta hiện nay có trên 800.000 cơ sở sản xuất công nghiệp với gần 70 khu chếxuất – khu công nghiệp tính trung bình hàng ngày lượng chất thải rắn sinh hoạt từ 0,6 –0,8 kg/người/ngày, chất thải rắn trong bệnh viện (cơ sở y tế) được thải ra ước tính từ50-70 tấn/ngày ở Hà Nội, Hải Phòng, Đà Nẵng, thành phố Hồ Chí Minh

Dưới đây là một số khu vực ở Việt Nam có biểu hiện ô nhiễm chì đã được công bố

Bảng 2: Hàm lượng chì nhiễm trong đất tại thành phố Hồ Chí Minh (ppm)

76

(Diệp Thị Mỹ Hạnh và ctv, 2003)Hiện trạng nhiễm kim loại nặng ở mẫu đất, nước và rau trên một số khu vực huyệnĐông Anh, Hà Nội

Bảng 3: Ngưỡng ô nhiễm KLN của đất, nước và rau

Số liệu lấy theo tiêu chuẩn châu Âu (*) (Jan, 1987 và Tword và cs, 1994); theotiêu chuẩn FAO(**); Số liệu còn lại theo tiêu chuẩn VN

Con người cũng làm khuếch tán Pb trong không khí khi thêm chì dạng tetramethyl vào xăng Khi thác quặng mỏ, nấu kim loại, phát triển các nhà máy pin

Bảng 4: Lượng chì thải ra từ các phương tiện giao thông

Năm 1985 Năm 1993

Pb từ các phương tiện giao thông 85% 33%

Tổng lượng Pb thải ra 20.100 tấn 4.900 tấn

2.5 Các biện pháp giải ô nhiễm

Trước tình hình ô nhiễm chì (Pb) ngày càng diễn ra nghiêm trọng, một số quốc gia

đã bắt đầu đầu tư vào nghiên cứu các biện pháp giải ô nhiễm.Các biện pháp có thể làvật lí, hoá học, sinh học hay hoá lý…Tuy nhiên, phương pháp đều có những đặc điểmriêng và phụ thuộc vào mục đích sử dụng của mỗi quốc gia Có thể kể đến như:

Biện pháp vật lí: là sử dụng các lực vật lý tác động vào môi trường đất làm thay đổicấu trúc của các chấ t ô nhiễm nhưng không có bản chất hóa học

Biện pháp hóa học: làm thay đổi tính chất của chất ô nhiễm, biến đổi chúng thànhdạng ít ô nhiễm hơn

Biện pháp hóa lý: dùng nhiệt in situ; nung đất (incineration); rửa đất (soil washinghay soil flushing); trao đổi ion; cố định chất ô nhiễm (solidification/stabilization); biệnpháp ôxy hóa hóa học; thủy tinh hóa (vitrification)… hay biện pháp cơ học là lấp đất(landfilling)…

Biện pháp sinh học: dùng các đối tượng sinh học như vi sinh vật, nấm hay thực vật

để hấp thu, phân hủy các chất ô nhiễm

+ Sử dụng vi sinh vật: để phân hủy các chất ô nhiễm bằng cách cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng và không khí cho chúng Các loại vi sinh vật có thể kể đến như:

S.viridochromogenes hấp thụ 30% trong lượng khô uranium, Citrobacter sp Có khả năng hấp thu chì khoảng 34-40 % trọng lượng khô, tảo: Rhizopus arrhizus có khả năng

hấp thu chì 10% Nhưng phương pháp có một số hạn chế khi ở những nơi có nồng độchất ô nhiễm cao sẽ gây độc cho vi sinh vật, hay chưa ứng dụng nhiều trong việc giải ô nhiễm đất, thường là kết hợp với biện pháp phytoremediation để làm gia tăng khả nănghấp thu kim loại trong đất của thực vật (Liesbet Cauwenberghe và Diane S.Roote, P.G., 1998).

Hầu hết các phương pháp đều rất tốn kém về kinh phí, giới hạn về kỹ thuật và hạn chế về diện tích,

Trong khi phương pháp sử dụng thực vật thì: dựa trên các loài thực vật có khả năng đặc biệt là hấp thu và tích luỹ kim loại ở nồng độ rất cao Đó là những thực vật có thể tồn tại được ở những vùng ô nhiễm kim loại nặng Sự vận dụng khả năng đặc biệt này của thực vật vào xử lý môi trường đã phát triển một phương pháp mới để giải ô nhiễm đất, gọi là “Phytoremediation”, tức là dùng thực vật để giải ô nhiễm Đây là một

phương pháp mới đầy triển vọng (ITRC, 1999)

Bảng 5: Liệt kê các loài thực vật có khả năng giải ô nhiễm

Brassica family (Indian

Mustard & Broccoli)

Se, S, Pb, CdChromium, Ni, Zn, Cu, Ce, Strontium

trinitro-1,3,5 triazine (RDX)

Pondweed, arrowroot, coontail TNT, RDX

Perennial rye grass Polychlorinatedphenyls (PCP's),

Bảng 6 Một số loài thực vật có khả năng tích luỹ kim loại nặng cao

Thlaspi rotundifolium 8.200 Pb Reeves & Brooks, 1983

Thlaspi geosingense 12.000 Ni Reeves & Brooks, 1983

Alyssum bertholonii 13.400 Ni Brooks & Radford, 1978

Alyssum pintodasilvae 9.000 Ni Brooks & Radford, 1978

(Võ Văn Minh – Võ Châu Tuấn, công nghệ xử lý kim loại nặng trong đất)

2.6.1.2 Nguyên nhân thực vật có thể hấp thụ kim loại nặng

Thực vật có những cơ chế đặc biệt để hấp thu, chuyển hóa và dự trữ các chất dinhdưỡng Chúng có thể:

- Loại bỏ các kim loại độc bằng cách tạo ra phức chất không độc chuyển đến các bộphận của tế bào tích luỹ ở dạng các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ bền vững

- Tách các kim loại ra khỏi đất, tích luỹ trong các bộ phận của cây, sau đó được loại

bỏ qua lá khô, rữa trôi qua biểu bì hoặc bị đốt cháy

- Tích luỹ kim loại là một sản phẩm phụ của cơ chế thích nghi đối với điều kiện bấtlợi của đất (ví dụ như cơ chế hấp thụ Ni trong loại đất serpentin)

- Chúng có thể cố định kim loại trong đất hoặc bùn bởi sự hấp thụ của rễ hoặc kếttủa trong vùng rễ Quá trình này làm giảm khả năng linh động của kim loại, ngăn chặn

ô nhiễm nước ngầm và làm giảm hàm lượng kim loại khuếch tán vào trong các chuỗithức ăn

Sự tích luỹ kim loại là cơ chế chống lại các điều kiện stress vô sinh hoặc hữu sinh:hiệu lực của kim loại chống lại các loài vi khuẩn, nấm ký sinh và các loài sinh vật ăn lá

đã được nghiên cứu.(Võ Văn Minh, Võ Châu Tuấn)

Bảng7 Một số loài thực vật cho sinh khối nhanh

có thể sử dụng để xử lý kim loại nặng trong đất

Populus Ni trong đất, nước và nước ngầm Punshon và Adriano, 2003

(Võ Văn Minh – Võ Châu Tuấn)

2.6.2 Cơ chế giải ô nhiễm ở thực vật

Thực vật hấp thu KLN do bộ rễ hút hoặc qua lá nhưng rễ là phổ biến hơn cả KLN

được hút vào rễ theo khuynh độ nồng độ xuyên qua màng tế bào

Nguyên tắc cơ bản là thực vật lấy chất ô nhiễm thông qua hệ rễ

Do qui luật sinh tồn, một số loài thực vật có khả năng biến đổi di truyền để chịu

đựng dần với nồng độ kim loại cao trong đất Chất ô nhiễm có thể được dự trữ trong

các bộ phận của cây (phytoextraction); được thực vật làm bay hơi (phytovolatilization) hay được thực vật tập trung, cố định trong vùng rễ (phytostabilization); hoặc được

thực vật tiêu hóa (phytodegradation) … (ITRC, 2001)

2.6.3 Ưu điểm

Phương pháp có thể xử lý ô nhiễm tại chỗ nên được ứng dụng thường xuyên, tránhgây xáo trộn đất và môi trường xung quanh đồng thời giảm bớt sự lan tràn ô nhiễm vàokhông khí và nguồn nước

Một lợi thế khác của phytoremediation: đây là 1 kỹ thuật xanh nên nếu thực hiệnđúng đắn thì sẽ là kỹ thuật thân thiện với môi trường giúp làm đẹp cảnh quan, mang lại

sự dễ chịu đối với mọi người Nó còn có thể xử lý lâu dài một vùng rộng chứa nhiềuchất ô nhiễm (Diệp thị Mỹ Hạnh, 2002)

Hơn cả, thế mạnh của phương pháp là chi phí cho việc thực hiện rẻ hơn nhiều sovới kỹ thuật ex situ truyền thống Không yêu cầu những thiết bị đắt tiền hay nhân sự cóchuyên môn cao mà vẫn có thể thực hiện một cách dễ dàng (Bùi Minh Trí, 2007.Phytoremediation)

Ví dụ: Năm 1998, Cục môi trường Châu Âu (EEA) đánh giá hiệu quả kinh tế củacác phương pháp xử lý KLN trong đất bằng phương pháp truyền thống và phương pháp

sử dụng thực vật tại 1.400.000 vị trí bị ô nhiễm ở Tây Âu, kết quả cho thấy chi phítrung bình của phương pháp truyền thống trên 1 hecta đất từ 0,27 đến 1,6 triệu USD,trong khi phương pháp sử dụng thực vật chi phí thấp hơn 10 đến 1000 lần (Bảng 7)

Khí hậu bất lợi cũng làm hạn chế sự phát triển của thực vật và sự tăng sinh khối củacây, làm giảm hiệu quả xử lý (EPA, 2000).

2.6.5 Ứng dụng

Trên thế giới đã có rất nhiều công trình được công bố về các ứng dụng sự dụng thựcvật giải ô nhiễm như bảng 2 ta thấy tên tác giả, các loài thực vật và năm công bố củacác tác giả

Ở Việt Nam, cũng có công trình nghiên cứu của TS Diệp Thị Mỹ Hạnh, E GarnierZarli đã công bố trên tạp trí phát triển KH & CN, tập 10, 01 – 2007 về cây thơm ổi

Lantana Camara L., thực vật có khả năng hấp thụ Pb trong đất để giải ô nhiễm.

Ngoài ra còn có một số nghiên cứu khác như sử dụng bèo và rau muống để hấp thụkim loại nặng ở làng nghề tái chế chì thuộc xã Chỉ Đạo, huyện Văn Lâm, tỉnh HưngYên

Qua nhiều nghiên cứu, thấy rằng ở nước ta loài thơm ổi là có triển vọng phát triểnnhờ khả năng thích nghi với điều kiện môi trường tốt, sinh trưởng nhanh và cạnh tranhmạnh nên thường được sử dụng phổ biến

2.7 Trùn đất

Chỉ vài thập kỉ gần đây thì vai trò của trùn đất trong nông nghiệp mới được khẳngđịnh Tuy nhiên người ta chỉ mới chú ý đến các đặc điểm về vật lí và hóa học còn đặcđiểm sinh học thì không được quan tâm nhiều Từ sự thiếu sót này thì phần tiếp theodưới đây sẽ cho thấy những ưu điểm của trùn trong sinh học và nhất là nền nôngnghiệp

Phân loại khoa học

H 2: Sự phân bố của các nhóm trùn trong đất

2.7.1 Định nghĩa & đặc điểm

2.7.1.1 Định nghĩa

Trùn đất là loài động vật không xương,

sống ở nước ngọt có kích thước bé, đường

kính thân khoảng một vài mm Tuy nhiên

cũng có loài có kích thước cỡ lớn hơn (0,5 –

50 mm) có thể dài tới 3m (như loài

Megascolides australis)

Trùn đất hay còn gọi là giun đất, chiếm

phần lớn trong phân lớp Oligochaeta thuộc

ngành Annelida.

2.7.1.2 Phân loại

Trùn đất thường sống ở những khu vực

đất ẩm ướt có nhiều mùn hữu cơ

Theo thống kê thì có khoảng hơn, 1000 loại trùn khác nhau nhưng dựa trên đặcđiểm sống và hoạt động có thể chia làm 3 nhóm chính:

a Nhóm “epigeic” sống chủ yếu ở lớp đất bề mặt với các lớp mùn ẩm do đất và

thực vật tạo ra Số lượng của chúng không nhiều trong đất nông nghiệp Đây là loài

chuyển hóa đất rất ít, một số còn có thể làm phân bón như trùn Eisenia foetida

b Nhóm “endogeic” sống ở tầng đất giữa khoảng 5.08 cm đến 7.62 cm trong đất.

Chúng sống chủ yếu nhờ sự phân rã các chất của các vi sinh vật Chúng ăn và hoạtđộng mạnh tạo ra nhiều đường hang xung quanh khu vực sống, đồng thời chuyển hóađất rất mạnh tạo ra nhiều phân

c Nhóm “anecic” sống ở tầng sâu của đất từ 1.5 m hay 1.83 m Chúng có thể ăn

và chuyển hóa đất tương tự như nhóm endogeic Trong đó trùn Lumbricus terrestris là

loài thường gặp nhất ở Châu Âu (Earthworms - college of agricultural sciencesagrigultural research and copperative extension, 2003; C A Edwards và P J Bohlen;Chapman và Hall, London, 1996; David Ernst, 1995)

2.7.2 Đặc điểm cấu tạo

Cơ thể của trùn có cấu tạo: Lớp cutin bao ngoài trong suốt, có nhiều gờ chéo nênbền vững Các lớp biểu mô xen lẫn là các tế bào tuyến và tế bào cảm giác Chức năngcủa tế bào tuyến là tiết chất nhầy, đôi khi dính đất, sỏi, cát… tạo thành vỏ tách khỏi lớpcutin hay tạo thành đai sinh dục (Chương 7 và 8 Ngành Giun đốt (Annelida))

Nhờ vào đặc điểm của hệ tiêu hóa mà tầm quan trọng của trùn mới dần được khẳng

định Sau đây là một số đặc điểm của hệ tiêu hóa có thể biết: hệ tiêu hóa có 3 phần

(ruột trước, ruột giữa và ruột sau) Ruột trước biến đổi nhiều tùy theo hình thức dinhdưỡng như hầu có thành cơ dày, có thể phóng ra ngoài, phía sau hầu có nhiều tuyếntiêu hoá đơn bào

Ở giun đất Pheretima aspergillum, vùng hầu có nhiều bó cơ khỏe giúp cho quá

trình co bóp, trong hầu có hàm kitin để phù hợp với lối ăn mùn, đất

Ruột giữa là phần sau dạ dày, phình to, có thành mỏng Quanh ruột có lớp tế bàovàng (chloragogen), treo lơ lửng trong xoang cơ thể nhờ màng treo ruột Phần sau của

ống tiêu hóa là ruột thẳng hay ruột sau và ít sai khác so với ruột trước Phần lớn giunđất có 2 manh tràng mọc ra từ ruột giữa

Ngoài ra để làm tăng khả năng tác động của trùn thì số lượng trùn trong đất cũng làmột vấn đề quan tâm Nó liên quan đến quá trình sinh sản, đặc biệt là hệ sinh dục: trùn

là loài động vật lưỡng tính, chu kì sinh sản nhanh và số lượng nhiều Hình thức sinhsản có 2 kiểu sinh sản hữu tính và sinh sản vô tính

Sinh sản vô tính: Thường gặp ở giun ít tơ nước ngọt thuộc họ Acoelomatidae và

Naididae Ở nhóm này, cơ thể có vùng sinh trưởng hình thành phần đầu của cá thể sau

và phần đuôi của cá thể trước Các phần này có thể hình thành trước hay sau khi cá thểcon tách rời cá thể mẹ Nhiều khi cá thể con chưa tách rời khỏi cá thể mẹ đã hình thànhthế hệ tiếp theo, kết quả tạo thành chuỗi cá thể

Sinh sản hữu tính: Trùn đất là loài lưỡng tính tùy vào điều kiện mà giới tính có thể

thay đổi Có hiện tượng ghép đôi bằng cách quay chéo đầu, áp mặt bụng vào nhau vàtrao đổi tinh dịch Tinh trùng có thể chuyển qua lại dưới dạng tinh dịch hay khối tinh(spermatozeugma) hay bao tinh (spermatophora) Sau một thời gian, kịp cho trứngchín, kén giun được hình thành Kén có kích thước, hình dạng, số lượng trứng thay đổitùy loài

Ví dụ kén của họ Naididae thường có một trứng, kén của họ Enchytraeidae có tới

53 trứng

Kén có độ lớn thay đổi (kén của trùn đất Pheretima có kích thước là 7mmx5mm,

còn của Megascolides auslalis lớn tới 75mm x 22mm và mỗi kén có khoảng 20 trứng.

Trứng ít noãn hoàng, phôi dùng albumin trong kén làm thức ăn Phát triển không qua

ấu trùng, con non chui khỏi kén sau 8 – 10 ngày Thời gian phát triển phụ thuộc vào sựthay đổi của môi trường và đặc điểm của mỗi loài

H 3: Cấu tao của trùn đất Pheretima Sp (Raven, 2001)

2.7.3 Điều kiện sống và phát triển

Qua nghiên cứu của về trùn đất và các nhà khoa học (College of agriculturalsciences agrigultural research and copperative extension, 2003) đã đưa ra các yếu tốảnh hưởng đến quá trình sống và phát triển của loài như sau:

2.7.3.1 Độ ẩm

Trùn là loài hô hấp qua da nên da trùn phải luôn đảm bảo có độ ẩm ổn định Nếu dakhô do nước mất đi nhiều trùn có thể chui xuống tầng đất dưới để giữ ẩm, hoặc cũng

có thể chết nếu quá khô, ngoài ra còn có thể chuyển sang trạng thái “ngủ đông” Khi độ

ẩm giảm cũng làm cho việc di chuyển của trùn gặp nhiều khó khăn

Ví dụ trong điều kiện khô hạn thiếu nước, số lượng trùn ở Pennsylvania thườnggiảm

Tuy nhiên, trong điều kiện đó thì trứng trùn lại có khả năng sống sót cao hơn trùntrưởng thành Nhờ khả năng của bản thân, chúng ức chế quá trình phát triển cơ thểtrong thời gian dài cho đến khi gặp điều kiện thuận lợi thì tiếp tục phát triển

Trùn có thể sống trong điều kiện nước mặn nếu thành phần oxy trong nước đủ chochúng hô hấp Hầu như các trường hợp trùn chết là do lượng oxi quá thấp trong môitrường ngập nước Nên về mùa mưa ta thường thấy hiện tượng trùn di chuyển lên trên

bề mặt để hô hấp Ngoài ra trùn còn có một đặc điểm nữa là sống trong đất có tỉ lệ mùncao vì tại đây lớp da của chúng không bị cọ sát, đảm bảo ẩm độ phù hợp, dễ dàng dichuyển

2.7.3.2 Nhiệt độ

Trùn không có khả năng chịu được điều kiện quá lạnh hoặc quá nóng Nếu nhiệt độ

350C kéo dài trong một thời gian dài thì khả năng trùn chết là rất cao Thông thườngtrong điều kiện đó chúng sẽ di chuyển xuống các tầng đất sâu để cho cơ thể giảm khảnăng mất nước, ngược lại so với điều kiện nhiệt độ quá thấp Và mọi hoạt động cơ thể

sẽ trở lại bình thường khi gặp nhiệt độ thích hợp Điều kiện nhiệt độ trùn sống thíchhợp là 10- 150C

2.7.3.3 Độ pH

Trùn được tìm thấy sống chủ yếu ở môi trường có pH trung tính, pH= 5-8 Cơ thểcủa chúng cũng có khả năng chuyển hóa môi trường axit thành trung tính, nhưng vàomức độ cho phép của cơ thể mà chúng điều khiển tối ưu hoá môi trường để giúp cho cơthể thích ứng

Và người ta thấy rằng đất di chuyển qua ruột trùn có pH trung tính, ruột trùn như làque thông trung hoà pH Đối với các chất đi qua ruột trùn thì pH thường có sự điềuchỉnh lại tương ứng với điều kiện cơ thể - môi trường

2.7.3.4 Kết cấu của đất

Trong quá trình sử dụng đất một số các hoạt động có thể làm tăng mật độ trùnnhưng cũng có hoạt động làm giảm mật độ dưới đây là:

a Một số hoạt động có lợi cho trùn

Có một số hoạt động có lợi có thể kể đến như: khu vực trùn sống là khu vực khôngtrồng trọt hoặc ít trồng trọt, cây trồng trên đó thay đổi luân phiên, phân bón cung cấp

có thể làm tăng lượng vi sinh vật cho đất cải thiện nguồn dinh dưỡng cho trùn, sự tăngcường cải tạo sinh vật có trong môi trường, phần gốc rễ và các phần dư thừa còn lại saucác mùa vụ thu hoạch, độ màu mỡ của đất và cuối cùng là việc bổ sung vôi trung hòamôi trường theo đúng chu kì

Cày đất: giúp điều hoà chất dinh dưỡng, làm đất thoáng khí tạo điều kiện cho vi

sinh vật phát triển mạnh (Mitxustin và Nhiacôp) Ảnh hưởng rõ rệt đến số lượng vàthành phần sinh vật sinh sống Mà vi sinh vật lại là nguồn dinh dưỡng cho trùn

Bảng 8: Điều kiện chăm sóc tác động lên số lượng trùn

Trồng đậu tiếp tục Cày 235000

(E.J Kladivko,1993)

Các mùa vụ: chế độ luân canh cây trồng Mỗi loại cây trồng đều có một khu hệ vi

sinh vật đặc trưng sống trong vùng rễ của nó Bởi vậy luân canh cây trồng làm cho khu

hệ vi sinh vật đất cân đối và phong phú hơn Người ta thường luân canh các loại câytrồng khác với cây họ đậu để tăng cường hàm lượng đạm cho đất tăng thành phần dinhdượng cho trùn

Ví dụ như vùng rễ cây họ Đậu thường phân bố nhóm vi khuẩn cố định nitơ cộngsinh còn ở vùng rễ lúa là nơi cư trú của các nhóm cố định nitơ tự do hoặc nội sinh Sốlượng và thành phần vi sinh vật cũng thay đổi theo các giai đoạn phát triển của câytrồng Ở đất vùng phù sa sông Hồng, số lượng vi sinh vật đạt cực đại ở giai đoạn lúahồi nhanh, đẻ nhánh, giai đoạn này là cây lúa sinh trưởng mạnh Bởi vậy thành phần và

số lượng chất hữu cơ tiết qua bộ rễ cũng lớn - đó là nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vậtvùng rễ, đất và trùn (Lê Xuân Phương, vi sinh vật đất)

Phần còn lại sau các mùa vụ: Nếu di chuyển các phần còn lại của các vụ sẽ làm

cho trùn mất đi nguồn dinh dưỡng Chúng còn là điều kiện bao bọc môi trường sốngcủa trùn, giúp chúng hoạt động ổn định và tránh các loài chim ăn thịt phát hiện ra

Phân bón: Là nguồn thức ăn cho trùn, nó có tỉ lệ C:N cao, bởi vì nó có tác động

làm cho đất màu mỡ hơn vì vậy thường được sử dụng phổ biến Ngoài các chế độ phânbón, nước, làm đất, các chế độ canh tác khác cũng có tác dụng rõ rệt tới hoạt động của

vi sinh vật

Cải tạo vi sinh vật: Bùn và phân bón có thế kích thích tăng số lượng trùn bởi vì

trong chúng thường có nhiều vi sinh vật

Độ màu mỡ và vôi: Đây là yếu tố tốt làm tăng số lượng trùn Thành phần

Anhydrous ammonia và amonium sulfate được tìm thấy không làm ảnh hưởng nhiềuđến trùn còn vôi làm trung hòa thành phần acid trong đất giúp cho trùn hoạt động

b Một số hoạt động có hại cho trùn

Bên cạnh đó một số hoạt động khác có thể gây hại cho trùn như: cày đất trong quátrình trồng trọt thay đổi thường xuyên làm cho lượng trùn giảm rất nhiều Việc sử dụngđất mà không chú ý đến quá trình cải tạo lại đất làm cho đất quá chua hay quá mặn đều

có ảnh hưởng xấu đến trùn cũng như cây trồng (sau các vụ mùa thành phần dinh dưỡngcủa đất thường thoái hoá đi rất nhiều) Việc thu gom di chuyển các phần còn lại của vụmùa và không để lại l phần dinh dưỡng cho trùn , thành phần tiếp theo đó là việc sửdụng các sản phẩm hoá học trên đồng ruộng có độc tố cao ví dụ như các loại thuốc trừsâu

Thuốc trừ sâu: Tùy theo từng loại thuốc trừ sâu mà nó có thể ảnh hưởng đến trùn

đất Như các thuốc trừ sâu organophosphates, carbamates … độc tố có thể làm trùnchết Còn các loại thuốc hoá học còn làm ô nhiễm môi trường đất, tiêu diệt phần lớn hệ

vi sinh vật và động vật nguyên sinh trong đất

Tóm lại tất cả những biện pháp canh tác nói trên có ảnh hưởng trực tiếp đến sự pháttriển của vi sinh vật trong đất, đến trùn đất, đến quá trình hoạt động sinh học, nóichung là sự chuyển hoá các chất hữu cơ và vô cơ trong đất, làm ảnh hưởng đến quátrình hình thành mùn và kết cấu đất và ảnh hưởng trực tiếp đến cây trồng Bởi vậy,nghiên cứu đất sao cho thích hợp với năng suất cây trồng không thể bỏ qua yếu tố sinhhọc của đất

2.8 Mối quan hệ giữa vi sinh vật, thực vật và trùn đất

2.8.1 Mối quan hệ giữa các vi sinh vật và cây

Để giải thích rõ mối quan hệ phức tạo của vi sinh vật và thực vật, chúng ta cần quântâm đến Rhizosphere

2.8.1.2 Định nghĩa Rhizosphere

Rhizosphere là vùng đất bao xung quanh rễ, là nơi có cường độ hoạt tính sinh học

và hoá học cao hơn so với các khu vực xung quanh, tại đây mọi thay đổi đều làm ảnhhưởng đến hoạt động của vùng rễ, vùng xác định là khoảng 1 mm bao quanh rễ

Khi rễ cây phát triển phóng thích ra cácamino acid, đường và các acid hữu cơ làmthức ăn cho các vi sinh vật Các vi sinh vậthoạt hoá nguồn dinh dưỡng này trong vùngRhizosphere và cung cấp ngược lại cho cây

2.8.1.3 Những hoạt động của rễ trong rhizosphere

Rễ tiết ra dịch chất có các thành phần làamino acid, acid hữu cơ, carbohydrate,đường, vitamin, chất nhầy và protein Nhữngchất này có nhiệm vụ dẫn truyền thông tin kích thích hoạt động sinh học và vật chất tạo

ra tương tác giữa rễ và vi sinh vật trong đất Chúng còn làm biến đổi các đặc điểm sinhhoá và vật chất của rhizosphere, làm cho rễ phát triển và cây sinh trưởng

 Những yếu tố do chất tiết tạo ra

- Giúp bảo vệ rễ chống lại các mầm bệnh từ vi sinh vật: các tế bào của rễ cây liêntục bị các vi sinh vật tấn công, để tồn tại chúng tiết ra các protein bảo vệ

- Đẩy lùi các vi sinh vật: độ ẩm và dinh dưỡng trong vùng rhizosphere tạo ra

thường cao hơn các vùng lân cận nên nó luôn là nơi thu hút sự chú ý của nhiều vi sinhvật Những thành phần và các chất do rễ tiết ra làm ảnh hưởng đến hoạt tính và sốlượng của vi sinh vật tại đây

Giữ độ ẩm của đất xung quanh vùng rễ: có nhiều nghiên cứu cho thấy

rhizosphere có vai trò rất lớn trong quá trình giữ độ ẩm cho đất, bảo vệ rễ khỏi bị khôhạn Các chất tiết phóng thích vào ban đêm giúp cây mở rộng vùng rễ hoạt động trongđất Về ban ngày các chất này hút bám xung quanh rễ tạo ra độ ẩm giúp cây điều hoàH9: Một phần khu vực Rhizosphere

(Michelle Watt và ctv, 2005)

nhiệt độ, đây là 1 trong những tính chất của rhizosphere Khi đất khô và luợng nướchấp thu giảm cây sẽ tự giảm quá trình thoát hơi nước ở rễ.

Thành phần dinh dưỡng: các chất tiết ra giúp rễ hút bám và cung cấp nhiều ion

do đất cung cấp

Ví dụ Khi cây hấp thu nitrogen là ammonium nó sẽ phóng thích các ion làm chorhizosphere acid Ngược lại nitrogen là nitrate thì ion phóng thích ra lại làm môi trườnghoá kiềm Sự biến đổi làm ảnh hưởng đến đại bộ phận không nhỏ các vi sinh vật sinhsống trong vùng

Tạo ra những hạt kết ổn định xung quanh vùng rễ: Dịch nhầy tạo ra kết hợp với

hạt đất bao bọc xung quanh vùng rễ bao bọc cho rễ cây phát triển

Ảnh hưởng đến sự phát triển của thực vật: rễ cây liên tục dẫn truyền thông tin

đến các vùng rễ cây xâm lấn ngăn ngừa nguy cơ xâm lấn của rễ cây lân cân Ví dụtrong nông nghiệp đặc điểm này có lợi như ở những vụ mùa trồng bắp sẽ làm giảm cỏdại phát triển gần đó, và ngược lại sẽ là có hại nếu cỏ dại phát triển trước đó

2.8.1.4 Rhizosphere là môi trường số của các loài vi sinh

Rhizosphere cung cấp các thành phần dinh dưỡng cho rễ cây hoạt động Trong đó

có nhiều loài sinh vật sinh số như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, protozoa, tuyến trùng,trùn đất, ốc sên… cùng sống, cùng cạnh tranh môi trường, không gian và nguồn dinhdưỡng

Khoáng chất: Các vi sinh vật làm biến đổi thành phần dinh dưỡng cung cấp cho

cây Cung cấp các khoáng chất cây, cây có khả năng hấp thụ và ngăn ngừa thất thoátnitrogen vào không khí

Giúp đỡ cây phát triển: cung cấp vitamin, kháng thể, hormone và dẫn truyền

thông tin giúp cây trồng phát triển tốt hơn

Như vậy chúng ta có thể nói rằng mỗi loài cây trồng trong quá trình sống của nóthường tiết ra các dịch chất làm ảnh hưởng thành phần và số lượng vi sinh vật sốngtrong vùng rễ đó

Còn đối với cây trồng thì vùng rễ cây là vùng mà vi sinh vật phát triển mạnh nhất

so với vùng không có rễ Khi còn sống, bản thân rễ cây thường tiết ra các chất hữu cơlàm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật Rễ cây còn làm cho đất thoáng khí, giữ được độ

ẩm Tất cả những nhân tố đó làm cho số lượng vi sinh vật ở vùng rễ phát triển mạnhhơn vùng ngoài rễ

Mỗi loại cây đều có một khu hệ vi sinh vật vùng rễ đặc trưng cho cây đó bởi vì rễthực vật thường tiết ra một lượng lớn các chất hữu cơ và vô cơ, các chất sinh trưởng ,thành phần và số lượng của các chất đó khác nhau tùy loại cây Những chất tiết của rễ

có ảnh hưởng quan trọng đến vi sinh vật vùng rễ Trên bề mặt và lớp đất nằm sát rễchứa nhiều chất dinh dưỡng nên tập trung vi sinh vật với số lượng lớn Càng xa rễ sốlượng vi sinh vật càng giảm đi

Thành phần vi sinh vật vùng rễ không những phụ thuộc vào loại cây trồng mà cònphụ thuộc vào thời kỳ phát triển của cây Vi sinh vật phân giải xenluloza có rất ít khicây còn non nhưng khi cây già thì rất nhiều Điều đó chứng tỏ vi sinh vật không những

sử dụng các chất tiết của rễ mà còn phân huỷ rễ khi rễ cây già, chết đi

Vi sinh vật sống trong vùng rễ có quan hệ mật thiết với cây, chúng sử dụng nhữngchất tiết của cây làm chất dinh dưỡng, đồng thời cung cấp chất dinh dưỡng cho cây quaquá trình hoạt động phân giải của mình Vi sinh vật còn tiết ra các vitamin và chất sinhtrưởng có lợi đối với cây trồng Bên cạnh đó có rất nhiều vi sinh vật gây bệnh cho cây,

có những loại ức chế sự sinh trưởng của cây, có những loại tàn phá mùa màng nghiêmtrọng.

Hàng năm bệnh cây đã gây thiệt hại to lớn cho sản xuất nông nghiệp Vi sinh vậtgây bệnh không chỉ làm giảm sản lượng mà còn làm giảm phẩm chất nông sản Vi sinhvật sử dụng các chất hữu cơ của cây bằng cách tiết ra các loại men phân huỷ chúng.Trong quá trình sống chúng tiết ra các chất độc làm cây chết Ví dụ như độc tốLycomarasmin do nấm Fusarium heterosporum tiết ra có thể làm cây chết

2.8.2 Mối quan hệ giữa trùn và vi sinh vật

Trùn ăn đất như nguồn thức ăn nhờ khả năng tiêu hóa chúng, các thành phần đi vào

sẽ được đường ruột kích thích mạnh nhờ vào hoạt động của hệ enzyme có hoạt tính cao

là cellulase, amylase, invertase, protease, peroxidase, urease, phosphatase vàdehydrogenase Mà các loại enzyme khác nhau thì có những đặc điểm riêng như :

Cellulase: là enzyme cần thiết để giải phóng glucose, có chứa nhóm enzyme giúp

phân giải vách tế bào trong thực tế được sử dụng tạo protoplast

Amylase: là enzyme có khả năng cắt liên kết glucoside nối các đơn vị đường đơn

trong thành phần của phân tử tinh bột, giải phóng glucose là chất quan trọng trong cơthể thực vật

Invertase: là một loại enzym thủy phân saccharose được sử dụng phổ biến trong

công nghiệp nước giải khát Invertase có trong động vật thực vật, vi sinh vật và đặcbiệt là nấm men có khả năng tổng hợp invertase cao, tạo đường đơn tham gia vào quátrình biến dưỡng

Protease: cần thiết cho hoạt động sống và là thành phần cơ bản có khả năng thủy

phân protein Chúng có khả năng tổng hợp dạng tiền enzyme không hoạt động và chỉhoạt động khi đưa vào hệ tiêu hóa và bị cắt bớt đi một phần sợi polypeptide do cácendoprotease Được sự dụng rất nhiều trong sản xuất dịch protein thuỷ phân

Peroxidase

Urease

Dehydrogenase

Tóm lại trùn tác động thông qua tiêu hóa tác động, cắt các chất hữu cơ phức tạpthành những phần nhỏ rồi trộn đều lại thải ra dưới dạng phân trên mặt đất Chúng còncày xuyên qua đất trộn đều các lớp đất và các vi sinh vật tồn tại trong đó Trong quátrình này chúng hình thành nên các viên đất kết hợp với nước làm cho đất thoáng khí

và tăng khả năng giữ nước của đất

2.8.3 Mối quan hệ giữa trùn và thực vật

Trùn đến ảnh hưởng đến sự phát triển của cây đặc biệt là giai đoạn phát triển củacây (Brown và cộng sự, 1999; Lavelle, 1997) Như đã nói ở trên cây trồng tác độngtrực tiếp đến trùn đất thông qua hoạt động của bộ rễ cây là chủ yếu, những chất tiết ra

từ bộ rễ, sự lan tỏa của bộ rễ Là nguồn dinh dưỡng và là mái nhà che ổn định nhiệt độ,

độ ẩm của trùn đất …

Bên cạnh đó trùn cũng tác động ngược lại đối với cây trồng là tạo ra các đườnghang giúp rễ phát triển lan rộng dễ dàng, hệ tiêu hóa của trùn còn có khả năng kíchthích hoạt động của các vi sinh vật giúp chuyển hóa các chât dinh dưỡng khó tiêu thànhcác chất dễ tiêu giúp cho cây hấp thụ dễ dàng

Trùn đất cải thiện đất trồng và các thành phần hóa học, sinh học Giúp cho khôngkhí luân chuyển dễ dàng trong đất, sự di chuyển của nước cũng dễ dàng

Dẫn nước cho cây: Trùn tạo ra các đường hang dọc và ngang, gia tăng khả năng

vận chuyển khí và nước trong đất cung cấp kịp thời cho hệ thống cây trồng Trùn còn

có khả năng chuyển hóa các chất khó hấp thu thành chất dễ tiêu nhờ hệ thống VSVtrong ống tiêu hóa của trùn tạo điều kiện thuận lợi cho cây trồng phát triển

Thông thoáng đất: Khí có thể dễ dàng luân chuyển xung quanh vùng rễ cung cấp

oxi giúp cho rễ cây phát triển và cacbon dioxide từ rễ thoát ra ngoài dễ dàng Bởi vìtrùn đã làm thay đổi trạng thái của đất làm cho đất xốp hơn, áp xuất không khí trongđất cũng thay đổi Trùn tác động vào đất bằng 2 cơ chế đó là: (1) Tạo ra nhiều đườnghang (2)Tạo ra các hạt kết trong đất

Ở đây hạt kết được biết như là sự pha trộn giữa đất và các vật chất của vi sinh vật

do trùn tạo ra Nó có cấu trúc ổn định, có độ bền cao có thể phân biệt được so với cáchạt đất thông thường Hay có thể nói là sự liên kết của các hạt đất ở nhiều kích thướcvới vi sinh vật (nấm, vi khuẩn , ….) sự liên kết của các hạt đất giúp bảo vệ các thànhphần dinh dưỡng của đất làm cho đất tránh hiện tượng xói mòn bảo vệ hệ vi sinh sốngtrong đó

 Như vậy yếu tố nào đã liên kết các hạt đất với nhau ?

Có quan điểm cho rằng vi sinh vật đóng vai trò gián tiếp trong sự liên kết các hạtđất với nhau Hoạt động của vi sinh vật, nhất là nhóm háo khí đã hình thành nên mộtthành phần của mùn là axit humic Các muối của axit humic tác dụng với ion Canxi tạothành một chất dẻo gắn kết những hạt đất với nhau Sau này người ta đã tìm ra vai tròtrực tiếp của vi sinh vật trong việc tạo thành kết cấu đất: Trong quá trình phân giải chấthữu cơ, nấm mốc và xạ khuẩn phát triển một hệ khuẩn ti khá lớn trong đất Khi nấmmốc và xạ khuẩn chết đi, vi khuẩn phân giải chúng tạo thành các chất dẻo có khả năngkết dính các hạt đất với nhau Bản thân vi khuẩn chết đi và tự phân huỷ cũng tạo thànhcác chất kết dính Ngoài ra lớp dịch nhày bao quanh các vi khuẩn có vỏ nhày cũng cókhả năng kết dính các hạt đất với nhau

Genxe - một nhà nghiên cứu về kết cấu đã nhận xét rằng: khi bón vào đất nhữngchất như Xenluloza và Protein thì kết cấu của đất được cải thiện Đó là do vi sinh vậtphân giải xenluloza và protein đã phát triển mạnh mẽ, các sản phẩm phân giải của

chúng và các chất tiết trong quá trình sống của chúng đã liên kết các hạt đất với nhautạo nên cấu trúc đất.

Rudacop khi nghiên cứu về kết cấu đoàn lạp ở đất trồng cây họ đậu đã kết luậnrằng: Nhân tố kết dính các hạt đất trong đất trồng cây họ đậu chính là một sản phẩmkết hợp giữa axit galactorunic và sản phẩm tự dung giải của vi khuẩn Clostridiumpolymyxa Axit galactorenic là sản phẩm của thực vật được hình thành dưới tác dụngcủa enzym protopectinaza do vi khuẩn tiết ra Các chất kết dính tạo thành kết cấu đấtcòn được gọi là mùn hoạt tính Như vậy mùn không những là nơi tích luỹ chất hữu cơlàm nên độ phì nhiêu của đất mà còn là nhân tố tạo nên kết cấu đất Sự hình thành vàphân giải mùn đều do vi sinh vật đóng vai trò tích cực Vì vậy các điều kiện ngoại cảnhảnh hưởng đến vi sinh vật cũng ảnh hưởng đến hàm lượng mùn trong đất Đặc biệtnước ra ở trong vùng nhiệt đới nóng ẩm, sự hoạt động của vi sinh vật rất mạnh ảnhhưởng rất lớn đến sự tích luỹ và phân giải mùn Các biện pháp canh tác như cày bừa,xới xáo, bón phân đều ảnh hưởng trực tiếp đến vi sinh vật và qua đó ảnh hưởng đếnhàm lượng mùn trong đất

Vi sinh vật trong đất: Trùn đất là một điển hình với số lượng lớn có thể tiêu thụ dễ

dàng 2 tấn vật chất khô trong một năm, giúp cải thiện đất trồng, trộn đều đất và các visinh vật trong đất

Ví dụ một số vùng ở Pennysylvania có ít trùn nên tác động của chúng không nhiều

là cho đất không được tốt nên thường ít được sử dụng Còn ở Hà Lan, một số vùng venbiển khi cải tạo lần đầu không sử dụng trùn đất khi trồng cây thường phát triển kém,cho đến khi có bổ xung thêm trùn thì cây phát triển tốt hơn Và đây cũng là một trongnhững nguyên nhân mà chính phủ Hà Lan bắt đầu khuyến khích người dân sử dụngtrùn trong nông nghiệp

Cung cấp dinh dưỡng cho cây: Phân trùn có nhiều Ni, P, K và Ca hơn các phần

đất xung quanh, khả năng trao đổi cation cao Một số nguyên tố vi lượng như là Zinc,

Bo được cung cấp nhiều hơn trong quá trình giải kim loại nặng

Hình thể hiện mối quan

hệ các nhóm

Lợi ích của vi khuẩn: Ngoài ra trong phân của trùn còn cung cấp thêm dinh dưỡng

cho cây, tăng quá trình trao đổi chất dinh dưỡng Các chất bài tiết của trùn có hàmlượng vi khuẩn rất cao rất cần thiết cho nông nghiệp Điều khiển các loại sinh vật gâyhại cho cây như tuyến trùng bằng cách ăn chúng làm giảm các sinh vật gây hại trongđất

2.9 Drilosphere

Các yếu tố chủ yếu chi phối các hoạt động trong đất là: mối liên kết giữa các hạtđất, vi sinh vật phân giải, chu kì dinh dưỡng, hoạt động của vi khuẩn, thực vật và cácthành phần hoạt tính… Và dựa trên những đặc điểm riêng người ta chia ra là các nhóm: litter system, detritusphere, rhizosphere, Aggregatusphere, drilosphere, termitosphere,myrmecosphere

Trong đó 2 thành phần đầu tiên là quan trọng chịu sự tác động của khối sinh vật.Các loại sinh vật sinh sống trên mặt đất, ở rễ cây và ở các vùng xung quanh

Porosphere là sự hình thành các lỗ đất tạo thành mạng lưới đan xen nhau với nhiềukích thước (nhỏ, vừa và lớn) trong đất Độ xốp của đất giúp cho nước và oxi di chuyển

dễ dàng giúp cho hệ rễ phát triển

mạnh, ngoài ra còn có thể giúp

chúng lan rộng một cách dễ dàng

Các thành phần và yếu tố có mối

quan hệ đan xen với nhau, tác động

ảnh hưởng qua lại

2.9.1 Định nghĩa

Là khu vực xung quanh nơi trùn đất sinh sống, là vùng xung quanh khu vực sống vàhoạt động của trùn khoảng 2 mm (Bouché) Còn Lavelle thì cho rằng nó là sự kết hợpcủa trùn, đất và vi sinh vật sống hoạt động Tóm lại đó là 5 thành phần chính : khu vựctrùn sinh sống, các thành phần bên trong của ruột trùn, các sản phẩm do trùn tạo ra(đường hang, phân, dịch nhầy)

Hay có thể được biết như là phần của đất tạo ra với dịch nhầy của trùn và phân trùn.Đặc biệt hơn nó là phần của đất đã được di chuyển trong hệ tiêu hóa của trùn; độ dàytrung bình của drilosphere là 2 mm (xung quanh các đường hang)

2.9.2 Đặc điểm

Trùn đất chịu sự tác động của khối vi sinh vật đó là sinh khối vi sinh vật và thànhphần dinh dưỡng một nghiên cứu cho thấy drilosphere có 70% độ thoáng khí,nitrogen – trộn lẫn với vi khuẩn trong hệ thống này thành phần N, P, và mùn là khácao Nó được tạo ra nhờ quá trình phân giải lá cây, rễ cây, nấm (M.B Bouché) Drilosphere đã chứng minh sự ổn định của đất dưới tác dụng của trùn Bằng cáchkhảo sát tác động của hệ tiêu hóa và được cấu trúc bên ngoài hoạt hóa bởi trùn (trùn,phân trùn, các đường hang) Phạm vi hoạt động của drilosphere và các đặc điểm phụthuộc vào loài và hình thái của các loại trùn sinh sống tại khu vực Không gian,drilosphere có thể tạo ra với các thành phần của đất trong một hệ thống nhưdetritusphere và rhizosphere (sinh khối vùng rễ và sự đa dạng), 2 thành phần chính củakhối sinh vật tạo ra với đất là hạt kết và độ tơi xốp Drilosphere tác động hoạt động củakhối sinh vật và quá trình khử của khối sinh vật có thể hoàn toàn khác nhau (và đốinghịch) phụ thuộc vào không gian và thời gian khảo sát

Trong ruột trùn, hoạt động của vi khuẩn được kích thích sau vài giờ ở hệ tiêu hóa.Trong quá trình này, nước và các chất hòa tan của dịch nhầy ruột làm cho hệ sinh vậtkhông hoạt động lại hoạt động, bằng cách đó làm gia tăng quá trình phân hủy đất của

vi sinh vật Ngoài ra trong phân trùn còn có nhiều dinh dưỡng, có thể rút ngắn thời giankhoáng hóa

Trùn đất có vai trò rất quan trọng trong hệ sinh thái Chúng làm phong phú hệ visinh vật trong đất, cung cấp nguồn dinh dưỡng cho thực vật Trong quá trình sống giúpcho vi sinh vật phân phối đều trong đất Các đường hang tạo ra làm thông thoáng khígiúp cho quá trình thủy giải dễ dàng, giúp thực vật và vi sinh vật phát triển tốt Nóichung trùn đất trong tự nhiên có thể cải thiện kết cấu của đất, độ màu mỡ, và làm tăng

số lượng vi sinh

Người ta đã gom chung các loài trùn sống chung với nhau sau đó quan sát việc tạo

ra các đường hang của trùn

Kết quả cho thấy sự khác biệt sau thời gian khảo sát có sự khác biệt ở các vị trí chothấy có sự phát triển tốt ở thực vật

H Cây thơm ổi Lantana Camara L.

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3 Chuẩn bị vật liệu thí nghiệm

3.1 Đất

Đất thu nhận ở vùng đất xám xã Phú An – huyện Bến Cát tỉnh Bình Dương Đấtđược phơi khô trong thời gian 2-3 ngày rồi đập nhỏ rồi sàng ở ray 5 mm, loại bỏ nhữngchất tạp sau đó, trộn đều đất lên (chú ý lấy một lượng nhỏ khoảng 500 g giữ lại để phântích các chỉ tiêu của đất trước thí nghiệm)

3.2 Thực vật

Sau khi xác định được thực vật siêu hấp thụ KLN cây

thơm ổi Lantana camara L có khả năng giải ô nhiễm tốt so với

các loài khác, cây Lantana được trồng để nghiên cứu ngưỡng

và cơ quan hấp thu Pb của cây

Đất đã ray ở ray 5 mm

Thu nhận mẫu đất trước khi thí nghiệmĐất thu nhận sau khi đã

phơi khô đập nhỏ

H : Trùn đất Pheretima

Cây thơm ổi Lantana Camara L hay còn được gọi với nhiều tên khác nhau như hoangũ sắc, trâm ổi, tỷ muội, yellowsage, Lantana, wildsage

Một loại cây thuộc họ cỏ roi ngựa (Verbeneceae), có nguồn gốc từ Trung Mỹ

Cây cao 1 -1.5 m, thân bụi có 4 cạnh, có gai nhỏ cong Lá có phiến rất nhám, rìa córăng cưa Hoa đầu có nách lá và ngọn, có nhiều màu vàng, cam, đỏ Quả nhân cứng,đen, ngọt, ăn được, khi còn non thì độc (do chứa lantadiens), nhân có 1-2 hột Ngoài racây còn được biết đến nhờ khả năng dễ thích nghi với nhiều điều kiện khác nhau, cũngnhư khả năng chịu hạn của mình

Ví dụ : Ở một số vùng, Lantana cạnh tranh với các loài khác, làm giảm đa dạng

sinh học (Kumar và Rohatgi, 1999)

Số cây sử dụng :

1 cây/chậu x 40 chậu = 40 cây

3.3 Trùn đất

Loại trùn đất được chọn là Pheretima sp Theo nghiên

cứu thấy rằng điều kiện tốt nhất cho trùn hoạt động là mật độ

của trùn so với đất là 10 % trọng lượng đất vì vậy lượng trùn

sử dụng là 10g, tương ứng khoảng 10 con cho 1 chậu

Lượng trùn đất sử dụng:

10 trùn / chậu x 40 chậu = 40 trùn

3.4 Bố trí thí nghiệm

3.4.1 Chuẩn bị trước thí nghiệm

Để thực hiện mục tiêu thí nghiệm của đề tài việc thực hiện các thí nghiệm đã làmnhư sau:

- Đất: trộn đều khối đất thí nghiệm lại với nhau Rồi dùng cân cân 10 kgđất cho vào mỗi chậu đã chuẩn bị sẵn

- Trùn đất: trùn đem từ khu công nghiệp Biên Hoà 2 về và xác định là chỉ

thực hiện trên 1 loại trùn duy nhất Pheretima sp Sau đó chọn ra những con

trưởng thành có đai sinh dục rõ ràng tương đối đều nhau để thực hiện thínghiệm Để trùn có thể thích ứng với môi trường thí nghiệm chúng ta có thể đưatrùn về nuôi trước 1 tuần, giảm nguy cơ bị sốc khi thực hiện ngay thí nghiệm

- Cây: là cây có chung 1 nguồn gốc từ Đồng Tháp được đưa vào sử dụng,với số lượng 1 cây /1 chậu (quan sát các đặc điểm của cây trước khi thí nghiệmnhư: chiều dài, số cành, số lượng lá) Chọn những cây có được từ phương phápgiâm cành, có độ tăng trưởng đồng đều để làm thí nghiệm

Tưới nước cho cây: đất và nước tưới được phân tích hàm lượng Pb tự nhiên đểđảm bảo môi trường thí nghiệm ban đầu không có Pb Sau 1 tuần trồng, các cây được

xử lý đồng loạt với acetate Pb, và để đảm bảo lượng chì không bị rửa trôi ta cần tướiđúng lượng xác định (chỉ tưới 1/3 lượng nước so với ngày đầu tiên) Như vậy ở đâylượng nước tưới là :

- Tưới 2 lần trong 1 ngày và mỗi lần tưới là 250 ml

Trong thí nghiệm quan sát và ghi nhận các đặc điểm của cây theo từng ngày như: sốcành, chiều dài, đường kính, hiện tượng phát triển của lá ….)

Cuối thí nghiệm: Thu nhận cây, tách riêng phần lá, rễ, và đất của thời gian 1 tháng.Quan sát việc hình thành các hạt kết của trùn đất và của cây khác nhau như thế nào.Mẫu đất sẽ được phân chia, phơi khô và nghiền, sàng và đem đi phân tích Ngoài ra,cần chú ý có thể thu nhận thêm phân trùn đất trong thời gian thí nghiệm củng cố thêm

số liệu thành phần dinh dưỡng trùn tạo ra

3.4.2 Bố trí thí nghiệm

Thực hiện:

Thí nghiệm bao gồm 4 nghiệm thức (10 kg /chậu) trong một lô nhân tạo và 4nghiệm thức trong một lô đối chứng

Mỗi nghiệm thức được thực hiện với 5 lần lặp lại với thời gian là 1 tháng như vậy

sẽ có tổng cộng 40 chậu 20 chậu là đất nhiễm kim loại nặng nhân tạo (ở đây kim loại

là Pb(CH3 COO)2.3H2O) và 20 chậu là đối chứng

Việc bố trí thí nghiệm vị trí giữa các chậu là sự bốc thăm ngẫu nhiên Để cho thấy

sự thay đổi của các nghiệm thức cũng là ngẫu nhiên trong cùng điều kiện môi trường

Kí hiệu T (T) là đất ô nhiễm Pb đối chứng ( + là xử lý Pb , - là không xử lý Pb)

S (Sol) là đất thí nghiệm đã chuẩn bị

V (Ver de terre) là trùn đất

P (Plante) là cây thí nghiệm

Thực hiện ở Khu sinh thái Tre thuộc xã Phú An – huyện Bến Cát tỉnh Bình Dương

SV : đất ô nhiễm có bổ sung trùn (10% trùn/chậu ≈ 10 trùn/chậu)

SP : đất ô nhiễm có trồng 1 cây Lantana Camara L /chậu

SPV : đất ô nhiễm có cây Lantana camara L.và bổ sung trùn

3.4.3 Theo dõi thí nghiệm

3.4.3.1 Thời gian thực hiện

Từ ngày 05/03/2008 – 06/03/2008 chuẩn bị thí nghiệm: xô rửa đất, xô trồng cây,cân 50 kg cân đất, xẻng trộn đất, bao tay

 07/ 03/ 2008 : Rửa rễ cây, trồng cây

3.4.3.2 Theo dõi sinh trưởng của cây

Thí nghiệm được theo dõi và chăm sóc thường xuyên, luôn

chú ý quan sát những sự thay đổi của cây, cứ 7 ngày tiến hành đo

chiều cao một lần

Sau khoảng 1 tháng thì thu hoạch

3.4.4 Lấy mẫu và phân tích

3.4.3.1 Lấy mẫu

 Thu mẫu trùn đất: Số lượng trùn đất, trọng lượng, phân trùn đất …

Số lượng và khối lượng trùn đất bỏ vào thí nghiệm trước và sau so sánh

Từ đó suy ra được khả năng ảnh hưởng của kim loại nặng trong đất tác động đếncây như thế nào

3.4.3.2 Các phương pháp trong phòng thí nghiệm

Phần 1: Phân tích các đặc tính hoá lý của đất: pH, hàm lượng chất hữu cơ C,N, P,

vật chất hữu cơ, acid humic, cation

 Trùn sẽ làm thay đổi cấu trúc đất tác động lên thực vật

Phần 2: Khảo nghiệm vi sinh vật trong đất.

∗ Tách chiết trực tiếp DNA vi khuẩn trong đất, sau đó tinh sạch các đoạn DNA

∗ Khuếch đại trình tự DNA vi khuẩn bằng phương pháp PCR

∗ Khảo sát tính đa dạng của hệ VSV bằng phương pháp DGGE (DenaturingGradient Gel Elecrophoresis)

∗ Thu nhận các đoạn DNA của hệ VSV và giải trình tự gen