Vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm-Staphylococcus aureus

An toàn vệ sinh thực phẩm đang là chủ đề nóng của xã hội.

TIỂU LUẬN

Môn:

Đề tài:

TPHCM, tháng 5 /2011

MỤC LỤC

I LỜI MỞ ĐẦU 2

II NỘI DUNG

Chương 1: Staphylococcus aureus và những tính chất đặc trưng

1.1 Giới thiệu 3

1.2 Hình dạng và đặc tính 4

Chương 2: Bệnh và triệu chứng lâm sàng

2.1 Độc tố ruột (enteroxin) 7

2.2 Các độc tố khác của Staphylococcus aureus 8

2.3 Cơ chế gây độc của SEB 10

2.4 Bệnh và triệu chứng 10

Chương 3: Phương pháp phân lập và xác định

3.1 Môi trường chọn lọc Baird – Parker (B-P agar) 12

3.2 Phương pháp ELISA 13

Chương 4: Liên hệ với thực phẩm

4.1 Staphylococcus aureus trong thực phẩm 16

4.2 Quy trình xác định Staphylococcus aureus trong thực phẩm 17

III KẾT LUẬN 19

Tài liệu tham khảo 20

I LỜI MỞ ĐẦU

An toàn vệ sinh thực phẩm đang là chủ đề nóng của xã hội Ngộ độc thực phẩm córất nhiều nguyên nhân như do: hóa chất, bản chất thực phẩm chứa sẵn một số chất độc,…

Nhưng quan trọng hơn hết vẫn là từ vi sinh vật, trong đó có Staphylococus aureus-một

trong những nguyên nhân chính Điều đáng lưu ý và quan tâm ở đây là chủng này có khảnăng tiết ra một số độc tố bền với nhiệt và khó bị phân hủy ở nhiệt độ cao Hơn nữa,chúng lại có khả năng kháng kháng sinh, khi gặp điều kiện thuận lợi còn có thể lây lan vàgây nên nhưng căn bệnh nguy hiểm

Vì thế mà nhóm em thực hiện đề tài: “Vi sinh vật gây bệnh trong thực Staphylococcus aureus” nhằm mục đích tìm hiểu nguồn gốc phát sinh, những tác hại mà

phẩm-Staphylococus aureus gây ra cũng như các biện pháp phòng ngừa và chữa trị Đặc biệt

là tìm hiểu các phương pháp phân tích để nhận biết và phát hiện chúng, đây đồng thời cóthể xem là một biện pháp hữu hiệu để kiểm tra độ an toàn của thực phẩm

Bài tiểu luận còn nhiều thiếu sót, chúng em rất mong được cô góp ý kiến để hoànthành đề tài một cách tốt nhất

II NỘI DUNG

CHƯƠNG 1: Staphylococcus aureus và những tính chất đặc trưng

1.1 Giới thiệu:

Tụ cầu khuẩn (staphylococci) được mô tả lần đầu tiên bởi nhà phẫu thuật ngườiScotland, ông Alexander Ogston vì nguyên nhân của một số hiện tượng sinh mủ (hìnhthành mủ) truyền nhiễm ở người Năm 1882, ông đặt tên cho chúng là staphylococcus

(tiếng Hy Lạp: straphyle, chùm nho; coccus, hạt lúa hay trứng cá) vì hình dạng chúng

xuất hiện dưới kính hiển vi

Mô tả đầu tiên của ngộ độc thực phẩm do tụ cầu khuẩn được cho là của Vaughan

và Sternberg, những người đã khảo sát một dịch bệnh lớn ở Michigan tin rằng nguyênnhân là bởi pho mát bị nhiễm tụ cầu khuẩn Sự liên kết rõ ràng của các sinh vật với ngộđộc thực phẩm phải đợi cho đến khi Barber (1914)

chứng minh rằng tụ cầu khuẩn có thể gây ra ngộ độc

bởi sữa tiêu thụ từ một con bò bị viêm vú do tụ cầu

khuẩn Năm 1930, Dack đã chỉ ra rằng ngộ độc thức ăn

nhiễm tụ cầu khuẩn được gây ra bởi một enterotoxin

(độc tố ruột) có khả năng lọc

Hiện nay có 27 loài và 7 phân loài của thế hệ

Staphylococcus; sự sản xuất enterotoxin chủ yếu được

đi liền với loài Staph aureus, mặc dù nó cũng được

sản xuất bởi các loài khác bao gồm Staph.

intermedius và Straph hyicus.

Như một loại bệnh tương đối nhẹ, thời gian ngắn, ngộ độc thực phẩm nhiễm tụ cầu

có lẽ nhiều khả năng không được báo cáo như các loại bệnh khác Đa số những trườnghợp báo cáo liên quan đến những sự bộc phát và một vài trường hợp rải rác được pháthiện Ở Mỹ giữa năm 1983 và 1987, tụ cầu khuẩn chiếm 7.8% (47) của 600 vụ bộc phátngộ độc thực phẩm nhiễm khuẩn mà đã được ghi lại Con số tương đương cho Anh và xứWales trên cùng thời kỳ là 1.9% (54) trong tổng số 2815 vụ Những cơn ngộ độc thựcphẩm nhiễm tụ cầu khuẩn ở Anh lên tới đỉnh điểm trong những năm 50 của thế kỷ haimươi ở mức 150 vụ mỗi năm nhưng từ đó suy giảm xuống còn 5-10 vụ mỗi năm ở trongthời kỳ 1990-1996 và trong giai đoạn 2000-2005 là 1 vụ trên một năm

Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi

1.2 Hình dạng và đặc tính:

Staphylococcus aureus là một khuẩn cầu Gram dương (+) mà có dạng hình cầu

những tế bào dạng trứng có đường kính khoảng 1µm Sự phân chia tế bào ở một mặtphẳng để tạo thành những khối tế bào không đồng đều giống như chùm nho (hình 7.10)

Hình 7.10. Staphylococcus aureus bám trên thép không rỉ (ảnh M.Lo)

Staphylococci là những catalase - dương tính, oxidase - âm tính, vi sinh vật kị khí

tùy ý Khả năng lên men glucozo của chúng có thể được sử dụng để phân biệt chúng với

Micrococcus giống hô hấp hoàn toàn, mặc dù có những loài ở cả 2 dạng trên mà sự phân

biệt này không rõ vì sự sản xuất acid thấp bởi một vài Staphylococci và sản xuất số lượngnhỏ acid dưới điều kiện không có không khí bởi một số micrococci Việc sản xuấtEnterotoxin bị ảnh hưởng một cách bất lợi bởi những điều kiện không có không khí nhiềuhơn sự tăng trưởng

Bảng 7.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sản xuất enterotoxin bởi

Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus là một mesophile điển hình với nhiệt độ tăng trưởng

khoảng giữa 7 và 480C và nhiệt độ tối ưu tại 370C với những điều kiện tối ưu khác Phạm

vi nhiệt độ trên đó enterotoxin được sản xuất ra nhỏ hơn một vài độ và có một tối ưu ở35-400C (Bảng 7.8) Sinh vật có khả năng chịu nhiệt độ không có ngoại lệ với D62 của 20-65s và D72 của 4.1s khi được đo trong sữa sự nuôi vi khuẩn bằng que cấy Sự chịu đựngnhiệt độ được thể hiện đa dạng đáng kể và những giá trị D được tìm thấy để tăng gấp 3lần khi sự nuôi cấy đã được thử nghiệm

Sự tăng trưởng xảy ra tối ưu ở giá trị pH từ 6-7 với tối thiểu và giới hạn tối đa lầnlượt là 4 và 9.8 – 10 Khoảng pH trên enterotoxin sản xuất ra là hẹp hơn với sự sản xuấtđộc tố dưới pH = 6.0 nhưng mà cùng với sự phát triển những giá trị chính xác sẽ thay đổivới trạng thái chính xác trung bình

Một đặc trưng của Staph Aureus mà là một đặc biệt quan trọng xem xét trong một

số loại thực phẩm đó là sự chịu đựng muối và aw được biến đổi Nó tăng trưởng dễ dàngtrong các môi trường có 5–7% NaCl và một vài chủng có khả năng tăng trưởng ở môitrường lên đến 20% NaCl Nó sẽ phát triển xuống để aw của 0.83 nơi mà nó có thời gianvòng đời 300 phút Một lần nữa phạm vi mà sự sản xuất enterotoxin xảy ra được giới hạnhơn một mức tối thiểu là aw 0.86

Môi trường chủ yếu của Staphylococcus là da, những tuyến da,các màng nhầy của

động vật máu nóng Một vài loài thì được liên kết với vật chủ cụ thể: Staph Hyicus với

heo và Staph gallinarum với gà Staph Aureus là phổ biến hơn nhưng xảy ra thườngxuyên hơn ở động vật linh trưởng bậc cao Ở con người thì nó đặc biệt liên quan đếnđường mũi nơi mà nó được tìm thấy với 20-50% của cá thể khỏe manh Nó có thể đượcphân lập tử phân và một cách rời rạc từ phạm vi rộng của những nơi khác như đất,nướcbiển và nước ngọt, bề mặt của cây,bụi và không khí.

Mặc dù là một động vật kí sinh vô hại trên bề

mặt cơ thể con người nơi mà nó đóng một vai trò

hữu ích cho quá trình chuyển hóa những sản phẩm

trên da và có thể ngăn chặn những mầm bệnh trên

da Staph Aureus có thể gây nên những vết rỗ nhỏ

trên da như là vết loét do nhiễm trùng và nghiêm

trọng hơn là một mầm bệnh cơ hội khi hàng rào da bị

chọc thủng hoặc sức chịu đựng của vật chủ thấp

CHƯƠNG 2: Bệnh và triệu chứng lâm sàng

2.1 Độc tố ruột (enteroxin):

- Được sản xuất phần lớn bởi các chủng Staph.aureus Các độc tố này là những protein

tương đối bền với nhiệt, không bị phá hủy khi đun nấu, có trọng lượng phân tử

28000-30000 Da gồm 6 loại được kí hiệu A, B, C, D, E, F Năm 2008 tìm ra được hai loại độc tố

mới là SES và SET cũng nằm trong nhóm độc tố ruột do Staph.aureus sinh ra.

- Cấu trúc phân tử của Staphylococcal enterotoxin B (SEB): SEB là một trong các ngoại độc tố được sinh ra bởi vi khuẩn Staph.aureus Thông thường không bị lây nhiễm vào cơ

thể, SEB sẽ tác động chủ yếu lên các hệ vận chuyển ion và nước của ruột, do đó được gọi

là enterotoxin

+ SEB được hình thành khi Staph.aureus sống trong điều kiện khắc nghiệt như: nhiệt

độ môi trường gia tăng đột ngột, thiếu oxy, sự mất cân bằng trong áp suất thẩm thấu

+ Đóng vai trò là một trong những nội độc tố quyết định của vi khuẩn Staph.aureus

nên SEB được nghiên cứu khá chi tiết Trình tự a.a của SEB được xác định từ năm1970

- Giống như các cấu trúc protein ngoại bào khác của Staph.aureus thường được tìm thấy

trong môi trường nuôi cấy hay trong thực phẩm bị ô nhiễm, protein SEB bao gồm mộttrình tự tính hiệu gồm 27 a.a ở đầu N’ Đoạn trình tự tín hiệu này có chức năng “dẫn”SEB ra ngoài môi trường nuôi cấy, sau đó trình tự này sẽ bị cắt bởi protease ở vị trí nhấtđịnh SEB dạng hoạt động trong môi trường ngoài tế bào gồm 239 a.a rong một chuỗipolypeptide đơn có khối lượng phân tử khoảng 28,336 KDa Ở dạng hoạt động proteinSEB có cấu gồm: 7 cấu trúc xoắn anpha và 14 phiến gấp nếp beta và một cầu nốidisuifide nối cystein ở vị trí 120 và 140 SEB có khả năng chống lại sự tác động củaprotease trysin và chymotrysin và papain có trong ruột

- Năm 1986, Christopher và cộng sự đã xác định thành công trình tự SEB của chủng

Staph.aureus S6 Trình tự của một gen hoàn thiện được tính từ codon mở đầu ATG ở vị

trí nucleotide 244, sau đó là vùng khung đọc mở gồm 798 nucleotide và kết thúc tạicodon TGA tại vị trí nucleotide 1042

2.2 Các độc tố khác của Staphylococcus aureus:

- Hemolysis: gồm 4 loại (alpha, beta, gamma, delta), mang bản chất protein gây tan máubeta, tác động khác nhau lên các hồng cầu khác nhau Có khả năng sinh kháng, gây hoại

tử da tại chổ và giết chết súc vật thí nghiệm

+ Alpha-hemolysis: làm hư hỏng màng tế bào mạnh nhất, có khả năng ức chế thẩmthấu của màng, liên kết với các tế bào nhạy cảm như tiểu cầu, bạch cầu có khả năngphân hủy hồng cầu tổn thương hồng cầu Alpha-hemolysin tiết ra sẽ gắn vào màngcủa tế bào nhạy cảm, sự gắn kết đó tạo thành một màng đầy nước tạo điều kiện thấmnước không kiểm soát được các ion và các phân tử hữu cơ nhỏ Khi các phân tử quantrọng đi qua như ATP, ion thì không thể đảo ngược thẩm thấu dẫn đến phá vỡ thành tếbào gây ra cái chết cho tế bào chủ

+ Beta-hemolysis: là một trong những exotoxins được sản xuất bởi hầu hết các chủngStaph.aureus, là protein có khả năng gây thoái hóa sphingomyelin gây ngộ độc chonhiều tế bào kể cả hồng cầu người

+ Delta-hemolysis: là một peptide rất nhỏ sản xuất bởi hầu hết các chủngStaph.aureus, là một protein hoạt động bề mặt và có thể dễ dàng chèn thêm chính nóvào cấu trúc màng kỵ nước và các kênh ion

+ Gamma-hemolysis: nhạy cảm với các loại hồng cầu của thỏ, cừu, người, chuột, bò,ngựa Gây ra hoại tử nhẹ ở da thỏ, chuột, có thể gây chết thỏ

- Độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc TSST ( toxic shack syndrome toxin): thường gặp ởnhững phụ nữ có kinh dùng bông băng dày, bẩn hoặc những người nhiễm trùng vếtthương Khó phân biệt độc tố này với enterotoxin F TSST kích thích giải phóng TNF(Tumor neerosis factor, yếu tố hoại tử u) và các interleukin I,II Cơ chế gây sốc của nógiống như độc tố ruột

- Độc tố exfoliatin hay epidermolitic: Là các men phá hủy thượng bì Men này gây tổnthương da tạo các bọng nước, Gây hội chứng phồng rộp và chốc lở da ở trẻ em 85% cácpolypeptide, loại A bền với nhiệt độ 1000C/20 phút, còn loại B thì không Kháng thể đặchiệu có tác dụng trung hòa độc tố này

- Alpha toxin: bản chất là protein gây tan các bạch cầu đa nhân và tiểu cầu, từ đó gây ra ổ

áp xe, hoại tử da và tan máu Độc tố có tính kháng nguyên nhưng kháng thể của nó không

có tác dụng chống nhiễm khuẩn

- Độc tố bạch cầu (Leucocidin): là nhân tố giết chết bạch cầu của nhiều loại động vật, bảnchất là protein, không chịu nhiệt Tụ cầu gây bệnh có thể bị thực bào như tụ cầu khônggây bệnh nhưng lại có khả năng phát triển bên trong bạch cầu Gồm hai mảnh F và S cóthể tách rời nhau, trọng lượng phân tử là 32000, 38000 Dalton Nếu hai mảnh này tách rờinhau thì chúng sẽ mất khả năng gây độc Chúng gây ra nhiễm trùng da và hoại tử.

- Ngoại độc tố sinh mủ (pyrogenic): độc tố này tương tự như độc tố sinh mủ của liên cầu.Protein ngoại độc tố này có tác dụng sinh mủ và phân bào lymphocyte, đồng thời nó làmtăng nhạy cảm với nội độc tố như gây shock, hoại tử gan và cơ tim Gồm 3 loại ký hiệu

A, B, C Ba loại này khác nhau về trọng lượng phân tử và về tính đặc hiệu kháng nguyên,giống nhau về khả năng sinh mủ và phân bào

- Dung huyết tố (hemolycin staphylolycin): phá hồng cầu (tan máu) và gây chết các tếbào hạt cũng như đại thực bào

- Fribrinolysin (enzyme Staphylokinase): Nhiều chủng của Staph.aureus thể hiện mộthoạt hóa plasminogen gọi là staphylokinase Nó làm phá hủy fibrin Là một enzyme đặctrưng cho các chủng gây bệnh ở người trong các cục máu và gây vỡ các cục máu này tạonên tắc mạch Cơ chế này giống với Steptokinase, được sử dụng trong y học để điều trịbệnh nhân bị huyết khối động mạch vành

- Coagulase: làm đông huyết

tương người và thỏ, chống

đông với citrate natri và

oxalate natri Coagulase làm

dính tơ huyết vào bề mặt vi

khuẩn và do đó cản trở sự thực

bào Men này gắn với

prothrombin trong huyết tương

và hoạt hóa quá trình sinh

fibrin từ tiền chất fibrinogen

Enzyme này cùng với yếu tố

kết cụm và một enzyme vách vi khuẩn giúp S aureus tạo kết tủa fibrin trên bề mặt củanó

- Hyaluronidase: men này có khả phá hủy chất cơ bản của tổ chức, giúp vi khuẩn có thể

phát tán trong tổ chức Thủy phân axit hyaluronic của mô liên kết

- Beta- lactamase: men này phá hủy vòng beta lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh

như penicilline G, Ampicilline và Uredopenicilline làm cho các kháng sinh này mất tácdụng

2.3 Cơ chế gây độc của SEB:

- SEB là trung gian kích thích các lympho T ở hệ miễn dịch của các vật chủ các độc tốliên kết trực tiếp đến phức hợp protein (MHC) lớp II trên bề mặt tế bào đích sao đó kíchthích gia tăng số lượng lớn các lympho T SEB được xem là một siêu kháng nguyên của

vi khuẩn vì có thể tạo thành một cầu nối giữa MHC lớp II của các tế bào trình diện khángnguyên và vùng Vbeta của các thụ thể tế bào T như: CD4, CD7 Từ đó kích thích hoạthóa các tế bào T biểu hiện các đoạn gen Vbeta mà không cần thiết phải có một quá trìnhchế biến và trình diện thông thường

- Điều này gây ra sự sản sinh một số lượng lớn của cytokine và interleukin (IL-2), cácyếu tố hoại tử khối u beta (TNF-beta) và các interferon Nếu ăn thực phẩm có SEB bệnhnhân có các triệu chứng như: chán ăn, buồn nôn, tiêu chảy… Các triệu chứng này xuấthiện là do các cytokine trong các tế bào T của lông ruột được sinh ra ồ ạt

- SEB dễ hòa tan trong nước, tính chất hóa học tương đối ổn định, chịu được các tác động

cơ học vừa phải, chịu được nhiệt độ sôi

2.4 Bệnh và triệu chứng:

Ngộ độc thực phẩm bởi Staph aureus được đặc trưng bằng thời kỳ ủ bệnh ngắn,

điển hình là từ 2-4h Buồn nôn, ói mửa, co thắt bao tử và kiệt sức là những triệu chứngchủ yếu, và hồi phục hoàn toàn bình thường trong vòng 1-2 ngày Trong trường hợp mấtnước nghiêm trọng, xanh xao rõ rệt có lẽ cần phải điều trị bằng cách truyền dịch vào tĩnhmạch

Thời kỳ ủ bệnh ngắn là đặc trưng của một sự nhiễm độc nơi mà bệnh tật là kết quả

của việc ăn vào một độc tố được hình thành trước trong thực phẩm Staph aureus sản

xuất ít nhất 11 enterotoxin được định rõ từ SEA tới SEJ Để thêm vào một chút rắc rối vàgây nhầm lẫn cho người thiếu thận trọng, không có SEF và có ba biến thể của SEC Loạiđộc tố A và D, dù đơn độc hay trong kết hợp, đều thường xuyên có liên quan nhất trongnhững vụ ngộ độc thực phẩm Ở Anh , loại A chịu trách nhiệm cho 52% vụ, loại D chiếm6%, loại A và D kết hợp chiếm 19%, và loại C và D chiếm 9% Tính nhạy cảm khác nhaugiữa những cá thể đã được đánh giá rằng, trong những vụ ngộ độc đòi hỏi ít hơn 1mg độc

tố thuần để gợi ra những triệu chứng Những độc tố thì nhỏ (Mr 26–30 kDa) mỗi mắcxích polypeptide chia sẻ đáng kể amino acid đồng đẳng Ngoại trừ SEI, mỗi cái chứa một