Tiểu luận môn vi sinh thực phẩm: Tìm hiểu về vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm mà cụ thể là vi khuẩn clostridium botulinum và độc tố botulin của vi khuẩn này

Tìm hiểu về vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm mà cụ thể là vi khuẩn Clostridium botulinum và độc tố botulin của vi khuẩn này. Từ đó đưa ra một số biện pháp phòng ngừa và kiểm soát chúng trong việc chế biến và bảo quản thực phẩm.

 TIỂU LUẬN MÔN HỌC VI SINH THỰC PHẨM ………… ĐỀ TÀI: Tp HCM, 5/2011 MỤC LỤC I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích .1 1.3 Nội dung tìm hiểu II NỘI DUNG 2.1 Tổng quan Clostridium botulinum .2 2.1.1 Lịch sử phát 2.1.2 Đặc điểm Clotridium botulinum .3 2.1.2.1 Phân loại 2.1.2.2 Đặc điểm hình thái 2.1.2.3 Đặc điểm cấu trúc 2.1.3 Phân nhóm .6 2.1.4 Phân bố 2.2 Bệnh triệu chứng lâm sàng 2.2.1 Độc tố botulin 2.2.2 Ngộ độc botulin .9 2.4.2 Nguyên nhân ngộ độc 11 2.2.3 Cơ chế ngộ độc tố 11 2.3.4 Phương pháp điều trị 14 2.3 Phân lập nhận dạng 15 2.3.1 Điều kiện nuôi cấy .15 2.3.2 Thí nghiệm chuột 16 2.3.3 Phương pháp đại (PCR) .18 2.4 Clostridium botulinum liên quan đến thực phẩm 20 2.4.1 Khả nhiễm Clostridium botulinum thực phẩm .20 2.4.2 Cách phòng tránh 24 2.5 Tình hình nhiễm độc tố botulin 24 2.5.1 Trên giới 24 2.5.2 Ở Việt Nam 25 III KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 27 IV Tài liỆu tham khẢo 28 Clostridium botulinum 2011 I Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề Thế giới vi sinh vật phong phú đa dạng Chúng phân bố rộng khắp hệ sinh thái: đất, nước, khơng khí, thể động – thực vật… Tuy nhiên thành phần số lượng hệ vi sinh vật phụ thuộc nhiều vào điều kiện mơi trường – đặc biệt mơi trường thực phẩm Thực phẩm tổng hòa sản phẩm người ăn tiêu hóa được, thực phẩm tươi sống thịt cá, rau loại thực phẩm chế biến ăn liền Đây mơi trường thuận lợi cho vi sinh vật sinh trưởng phát triển đầy đủ dinh dưỡng, pH từ – 6.5, nhiệt độ thích hợp số điều kiện khác Các vi sinh vật có mặt thực phẩm số có lợi cịn lại chúng đa số làm hư hỏng thực phẩm gây ngộ độc cho người Một số loài gây hại điển Staphylococcus Aureus, Samonella, E.coli số phải kể đến loài Clostridium botulinum – loài gây bệnh độc thịt sinh độc tố thần kinh cực độc – nguyên nhân gây hàng loạt vụ tử vong cho người Trên giới ghi nhận nhiều trường hợp ngộ độc sau sử dụng loại đồ hộp, xúc xích hay lạp xưởng loại thực phẩm có điều kiện khơng có oxy 1.2 Mục đích Tìm hiểu vi sinh vật gây bệnh thực phẩm mà cụ thể vi khuẩn Clostridium botulinum độc tố botulin vi khuẩn Từ đưa số biện pháp phịng ngừa kiểm sốt chúng việc chế biến bảo quản thực phẩm 1.3 Nội dung tìm hiểu  Tìm hiểu đặc điểm tổng quan Clostridium botulinum  Khả gây bệnh, tính lâm sàng Clostridium botulinumt rong thực phẩm mối liên quan chúng với loại thực phẩm  Tìm hiểu độc tố botulin gây bệnh thực phẩm nhằm ngăn ngừa khả nhiễm loại độc tố cực độc Clostridium botulinum 2011 II Nội dung 2.1 Tổng quan Clostridium botulinum 2.1.1 Lịch sử phát Năm 1793 thị xã Wildbad thuộc Bang Wurttemburg nước Đức, 13 người bị bệnh người sau chết sau ăn Blunzen – loại xúc xích làm từ huyết thành phần khác bọc dày lợn Các xúc xích luộc xơng khói, sau xúc xích coi bền vững nhiệt độ phòng vịng vài tuần thích hợp để tiêu thụ mà khơng cần phải hâm nóng Nhiều vụ ngộ độc xúc xích, ghi lại năm tiếp theo, thường gắn liền với xúc xích có chứa thành phần động vật khác so với mô Điều khiến viên chức y tế địa phương Justinius Kerner tiến hành thực nghiên cứu bệnh gọi bệnh ngộ độc Kerner lưu ý số đặc điểm quan trọng bao gồm việc làm nóng cần thiết để ngăn cản phát triển độc tính xúc xích Những xúc xích nhỏ chứa túi khơng có khơng khí có khả trở thành độc hại Mãi 1896 vi sinh vật chịu trách nhiệm vụ ngộ độc phân lập mô tả Van Ermengem – Giáo sư Vi trùng trường Đại học Ghent học trò cũ Robert Koch Đây kết điều tra ông ổ dịch xảy bệnh ngộ độc, nơi 34 thành viên câu lạc âm nhạc Bỉ ăn sống thịt chưa hun khói Một số ghi nhận có thịt mà họ ăn có mùi vị tương tự bơ ôi Khoảng ngày sau 23 người nhóm lâm bệnh người chết vịng tuần sau Van Ermengem cho bệnh ngộ độc kết việc ăn thực phẩm có chứa chất độc khơng bền nhiệt tạo vi sinh vật kỵ khí, hình thành bào tử mà ơng gọi Botulinus Bacillus Ơng chứng minh độc tố khơng tạo mơi trường có mặt muối Mặc dù phần lớn chứng ban đầu cho thấy bệnh ngộ độc giới hạn sản phẩm từ thịt, nhiên sau độc tố tìm thấy xảy nơi cung cấp thực phẩm có điều kiện chế biến thích hợp sinh trưởng phát triển sinh vật gây bệnh Nó xác định với chứng ngộ độc cá thối, bệnh có liên quan với việc sử dụng cá muối sống, biết đến Clostridium botulinum 2011 Nga kể từ năm 1880 vào năm 1904 đợt bùng phát bệnh ngộ độc Darmstadt, Đức nguyên nhân gây đậu trắng đóng hộp 2.1.2 Đặc điểm Clotridium botulinum 2.1.2.1 Phân loại Clostridium Botulinum thuộc: Vực (domain): Bacteria Lớp (class): Clostridia Bộ (ordo): Clostridiales Họ (familia): Clostridiaceae Chi (genus): Clostridium Loài (species): C botulinum Clostridium giống trực khuẩn Gram dương, thuộc ngành Firmicutes Đây vi khuẩn kỵ khí bắt buộc có khả sinh nha bào môi trường sống bất lợi Tên chúng bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp kloster có nghĩa trục quay Từ đặc điểm điển hình trên, người ta xếp vi khuẩn vào giống Clostridium, nhiên gần nhiều chủng phân loại vào giống khác Giống Clostridium bao gồm khoảng 100 lồi có chủng sống tự mơi trường số diện mầm bệnh tiềm ẩn với người.Trong nhóm có bốn vi khuẩn chủ yếu gây bệnh cho người:  C botulinum, có khả sinh độc tố thức ăn, vết thương gây bệnh độc thịt  C difficile, tồn mầm bệnh hội thuộc hệ vi sinh vật ruột phát triển có điều kiện liệu pháp chữa trị kháng sinh gây chứng viêm đại tràng màng giả  C perfringens, ban đầu có tên C welchii, nguyên nhân gây loạt hội chứng khác nhau, từ ngộ độc thức ăn bệnh hoại thư sinh Loài sản sinh độc tố ruột huyết gây bệnh nhuyễn thận cừu dê Lợi ích C perfringens thay nấm men phương pháp bánh mì muối  C tetani, gây bệnh uốn ván Khi phát triển thực phẩm, C Botulinum tiết độc tố, có loại loại A, B E thuộc loại gây ngộ độc nguy hiểm, gây chết người tác động lên hệ thống thần kinh Loại A thường thấy châu Mỹ, loại B thường thấy Châu Âu loại E thường thấy Nhật Bản Clostridium botulinum 2011 2.1.2.2 Đặc điểm hình thái Van Ermengems định thay định ban đầu vào năm 1923 sinh vật chịu trách nhiệm bệnh ngộ độc xếp lại lớp Clostridium Botulinum Độ pH tối thiểu mà Clostridium botulinum tăng trưởng phụ thuộc nhiều vào yếu tố nhiệt độ, hoạt động nước (aw) acid sử dụng để điều chỉnh pH Sự thống từ lâu cho độ pH khoảng 4,7 mức tối thiểu điều thực tế có ý nghĩa quan trọng thiết thực cho ngành công nghiệp đồ hộp Các chủng khơng phân giải protein có khả dung nạp acid thấp nói chung bị ức chế pH 5,0 – 5,2 Các báo cáo cho có tăng trưởng sản xuất độc tố giá trị pH thấp 4.0 lớp protein bảo vệ Trong trường hợp bệnh ngộ độ có xảy thực phẩm nơi mà độ axit hàng rào bảo vệ quan trọng, chẳng hạn hoa đóng hộp, loại nấm men nấm mốc, tăng trưởng sản phẩm làm tăng độ pH Độ pH tối đa cho tăng trưởng Clostridium botulinum 8,5 – 8,9 chất độc không bền giá trị pH kiềm Điều nói chung đặc điểm quan trọng sinh lý sinh vật hầu hết tất loại thực phẩm có tính axit nhẹ Nó có ý nghĩa nhiên số sản phẩm lên men Bắc Mỹ liên quan đến bệnh ngộ độc mà tăng độ pH trình lên men yếu tố bảo vệ Clostridium botulinum bị ức chế NaCl 5% NaNO3 2.5% Trong đa số trường hợp Clostridium botulinum sinh khí tạo mùi khó chịu, ta nhận biết loại bỏ chúng đặc điểm Tuy nhiên vài trường hợp ngoại lệ ta nhận Clostridium botulinum cảm quan, bị nhiễm độc Clostridium botulinum phân bố khắp nơi đất, đặc biệt nơi đất vườn, nghĩa trang, nơi chăn nuôi gia súc, gia cầm Trong loại rau quả, kể mật ong Chúng có ruột động vật ni nhà, ruột cá, đơi có ruột người, nơi nước bị ô nhiễm Do vi khuẩn có tự nhiên nên thực phẩm dễ bị nhiễm trình sản xuất, chế biến, vận chuyển Clostridium botulinum 2011 bảo quản Đặc biệt chúng có khả lây nhiễm phát triển mạnh loại thực phẩm thịt cá ướp muối, ướp lạnh, hun khói, đồ hộp, xúc xích, lạp xưởng, phomat bị đóng kín có độ dày lớn…vì loại thực phẩm môi trường thuận lợi điều kiện kỵ khí, nhiệt độ, độ pH, đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho chúng sinh trưởng phát triển Clostridium botulinum có khả sinh độc tố botulin cực độc điều kiện kỵ khí, nhiệt độ 30 – 370C, 10 – 120C độc tố tạo thành bị chậm lại – 50C ngừng hẳn Botulin loại độc tố thần kinh, gây tê liệt bó thần kinh nguyên nhân gây tử vong người nhiều động vật 2.1.2.3 Đặc điểm cấu trúc Clostridium botulinum vi khuẩn Gram dương, di động với tiên mao lung nhung, chúng vật kỵ khí bắt buộc, hình dáng thẳng cong que, dài 2-10 µm, hình thành bào tử hình bầu dục trung tâm hình dùi trống Chủng loại Clostridium Botulinum biểu đầy đủ đặc điểm sinh lý sinh hóa khơng giống lồi Đặc điểm thơng dụng quan trọng lồi việc sản xuất dược lý độc tố thần kinh công nhận chịu trách nhiệm bệnh ngộ độc Tám huyết độc tố khác biệt công nhận là: A, B, C1, C2, D, E, F, G, C2 chất độc thần kinh, chủng Clostridium Botulinum thường sản xuất loại, có ngoại lệ Năm 1985, số chủng Clostridium barati Clostridium butyricum chịu trách nhiệm trường hợp bệnh ngộ độc cho trẻ sơ sinh phát có sản xuất độc tố thần kinh tương tự, chúng không liên quan đến trường hợp ngộ độc thực phẩm Clostridium botulinum 2011 2.1.3 Phân nhóm Dựa vào đặc điểm sinh lý người ta phân Clostridium botulinum thành nhóm bảng sau: Nhóm I II III IV Loại độc tố A, B, F B, E, F C1, C2, D G Phân giải Protein Có Khơng Khơng Có Phân giải Lipid Phân giải Saccharose Psychrotrophic (t0min tăng trưởng) Sự ức chế muối (aw) Bền nhiệt Đối tượng gây bệnh Có Có Khơng (10 – 120C) Có Có Có (3 – 50C) 10% (0.94) 5% (0.975) Có (Chết 1210C, 0.1 – 0.25 phút) Người Không (Chết 800C, 0.6 – 3.3 phút) Người Có Có Khơng (150C) 3% Chim động vật Khơng Khơng (120C) >3% Người Nhóm I phân giải protein mạnh mẽ thường cho ta biết diện chúng thực phẩm phần sản phẩm bị phân rã trở nên có mùi Nhóm I chủng khơng ưa lạnh liên quan đến sản phẩm đơng lạnh Tuy nhiên chúng thực việc sản xuất phần lớn bào tử chịu nhiệt gây vấn đề loại thực phẩm phụ thuộc vào bước làm nóng Ngược lại, nhóm II chủng đại diện cho mối nguy hiểm tiềm lớn thực phẩm đông lạnh Chúng không phân giải protein với protein có nguồn gốc, phát triển sản xuất chất độc nhiệt độ xuống 30C sản sinh bào tử với sức đề kháng nhiệt thấp Chúng có xu hướng dễ bị ức chế muối (bảng 1) Tỷ lệ tăng trưởng sản xuất độc tố giới hạn nhiệt độ thấp làm chậm giảm yếu tố khác bất lợi đến tăng trưởng Nghiên cứu thực nghiệm thời gian lưu trữ – tháng cần thiết để sản xuất chất độc 3.30C Cá trích đóng gói hút chân khơng cấy vào 100 bào tử / bao trở thành độc hại sau 15 ngày lưu trữ 0C Hầu hết trường hợp bệnh ngộ độc người típ chất độc loại A, B, E tỷ lệ gây bệnh típ độc khác cho người Clostridium botulinum 2011 Nhóm III sản xuất chất độc chủng loại C D thường liên quan với bệnh động vật chim Kể từ bệnh ngộ độc không thiết phải nguyên nhân gây chết trường hợp này, có khơng có báo cáo có mặt típ G loại thực phẩm, vai trị việc gây bệnh từ thực phẩm đáng ngờ Nhóm IV chủng sản xuất độc tố loại G số Clostridium botulinum không sinh độc tố định loài mới, Clostridium argentinense 2.1.4 Phân bố Mặc dù có trường hợp tìm thấy đường tiêu hóa lồi chim động vật có vú, Clostridium botulinum chất vi khuẩn hoại sinh sống đất Nó xuất phổ biến, phân bố địa lý không đồng Khảo sát tiến hành Hoa Kỳ tìm thấy típ độc loại A phổ biến phía Tây, có thung lũng Mississippi, vùng dọc theo ven biển phía Đơng, nơi típ độc loại B chiếm ưu Phân phối phản ánh dịch bệnh ngộ độc Hoa Kỳ giai đoạn 1950 – 1979, 85% người phía tây sông Mississippi bị ngộ độc loại độc tố A 63% người phía đơng bị ngộ độc loại B Vùng đất châu Âu típ độc loại B có xu hướng phổ biến loại A Bùn thủy sản cung cấp ẩm, kỵ khí, mơi trường giàu chất dinh dưỡng Clostridium botulinum phát triển, việc phân lập Clostridium botulinum từ nguồn nhiều từ loại đất Típ độc loại E ưa lạnh Clostridium botulinum 2011 đặc biệt liên quan đến môi trường khu vực miền tây Bắc Mỹ, Nhật Bản bờ biển Baltic Kết là, loại E thường nguyên nhân bùng phát bệnh ngộ độc mà cá phương tiện lây nhiễm chủ yếu 2.2 Bệnh triệu chứng lâm sàng 2.2.1 Độc tố botulin Clostridium botulinum có típ độc tố A, B, C1, C2, D, E, F, G, (mặc dù C2 chất độc thần kinh), gọi chung botulin Phân biệt chúng với đặc tính kháng ngun Trong có típ gây độc A, B, E (độc típ A, đến típ B) Độc tố có tính độc mạnh chất độc biết Nó độc gấp lần so với độc tố uốn ván, gây chết người với lượng nhỏ 10 -8g Lợi dụng độc tố người sử dụng chúng chiến tranh để làm vũ khí sinh học Hình: Ảnh 3D độc tố botulin Đặc điểm độc tố có khơng bị phân hủy môi trường aicd dày tác dụng enzyme tiêu hóa (pepsin, trysin), chịu Clostridium botulinum 2011 2.3.4 Phương pháp điều trị Để chẩn đoán bệnh ngộ độc, bác sĩ kiểm tra xem có dấu hiệu suy yếu tê liệt bắp, mí mắt rủ giọng nói yếu Bác sĩ hỏi loại thực phẩm ăn vài ngày qua, yêu cầu tiếp xúc với vi khuẩn qua vết thương Xét nghiệm máu xác nhận diện độc tố Trong trường hợp ngộ độc trẻ sơ sinh, bác sĩ hỏi, trẻ ăn mật ong gần có vấn đề táo bón, trì trệ Phân tích phân chất nơn cho chứng độc tố giúp xác nhận trẻ sơ sinh chẩn đốn ngộ độc thực phẩm, thử nghiệm hàng ngày, kiểm tra lâm sàng bác sĩ phương tiện chẩn đoán Đối với trường hợp ngộ độc thực phẩm, bác sĩ đơi làm hệ tiêu hóa cách gây ói mửa cho thuốc để tăng tiêu Nếu có bệnh ngộ độc vết thương, bác sĩ cần phải phẫu thuật loại bỏ mô bị nhiễm bệnh ● Kháng độc tố: Nếu chẩn đoán ban đầu với bệnh ngộ độc qua thực phẩm vết thương, tiêm thuốc kháng độc làm giảm nguy biến chứng Các thuốc kháng độc tự gắn với độc tố mà cịn lưu hành máu giữ làm hại dây thần kinh Các thuốc kháng độc khơng gắn với độc tố, nhiên, đảo ngược thiệt hại thần kinh thực Thuốc kháng độc không đề nghị cho trường hợp ngộ độc trẻ sơ sinh, khơng ảnh hưởng đến vi trùng gây bệnh hệ thống tiêu hóa bé Một điều trị gọi globulin miễn dịch bệnh ngộ độc sử dụng để chữa trị cho trẻ sơ sinh ● Hỗ trợ thở: Nếu gặp khó thở, cần phải có thơng khí khí Các lực thở khơng khí vào phổi thơng qua ống đưa vào đường thở mũi miệng Có thể dùng máy thở vài tuần tác động độc tố giảm bớt Phục hồi chức năng: Khi khơi phục lại, cần điều trị để cải thiện giọng nói, nuốt chức khác bị ảnh hưởng bệnh 14 Clostridium botulinum 2011 2.3 Phân lập nhận dạng 2.3.1 Điều kiện nuôi cấy Trong quan điểm đa dạng trao đổi chất loài trung gian chọn lọc sử dụng hạn chế cô lập Clostridium botulinum xác định dựa khả sản xuất độc tố khuẩn lạc điển hình ni cấy Clostridium botulinum thường chiếm tỷ trọng nhỏ tổng số phong phú hệ vi sinh vật tiền ấp cần thiết đến hồn thiện khả lập Đơi dịch ni cấy làm nóng trước ủ để loại bỏ vi khuẩn kị khí không sinh bào tử Tuy nhiên, tùy thuộc vào chế độ làm nóng sử dụng, 800C 10 phút thường dùng, điều loại bỏ chủng kháng nhiệt Clostridium botulinum thường bị bỏ qua Sau làm giàu tạo chủng C.botulinum môi trường nước luộc thịt 300C ngày ta tiến nuôi cấy ria máu ngựa tươi lịng đỏ trứng có bổ sung agar ủ yếm khí ngày Tính trạng khuẩn lạc mịn, đường kính đến 3mm với rìa cạnh không thấy hoạt động phân giải lypid lịng đỏ trứng mơi trường thạch (trừ loại G) chuyển vào môi trường nước, dùng để kiểm tra xem có sản xuất độc tố khơng 15 Clostridium botulinum 2011 Một kỹ thuật đơn giản hoá cách kết hợp thuốc kháng độc vào môi trường thạch agar để sản xuất chất độc, khuẩn lạc bao quanh khu vực kháng độc tố làm kết tủa với độc tố 2.3.2 Thí nghiệm chuột Mặc dù phát triển loạt ống nghiệm quy trình xét nghiệm miễn dịch độc tố, xét nghiệm trung hịa chuột (hình 2), cịn nhạy cảm (liều gây chết điển hình độc tố chuột vài picogram) Tuy nhiên, chất khó khăn việc kiểm tra đảm bảo thay cuối sau hệ thống miễn dịch khuếch đại cải thiện đầy đủ 16 Clostridium botulinum 2011 Hình 3: Thí nghiệm độc tố chuột Một mẫu độc tố chia thành ba phần: phần thứ để phục vụ kiểm soát, đun nóng 100 0C 10 phút để phá hủy loại độc tố mẫu, phần thứ hai xử lý trypsin để kích hoạt tiền độc tố có phần thứ ba không xử lý Mỗi phần tiêm intraperitoneally vào chuột quan sát ngày việc phát triển triệu chứng điển khó thở xuất “thắt lưng ong” đặc trưng Sự diện loại độc tố có chuột xác nhận thuốc kháng độc polyvalent loại độc tố xác định cách sử dụng kháng huyết monovalent 17 Clostridium botulinum 2011 2.3.3 Phương pháp đại ( PCR) Nhu cầu thực tế đưa ra, cần có phương pháp phát nhanh C botulinum gây ngộ độc diện thực phẩm, thay cho phương pháp truyền thống Sự phát triển lĩnh vực Sinh học phân tử năm qua tạo nhiều kỹ thuật phát mới, cho phép phát vi sinh vật mục tiêu có mẫu thực phẩm hay bệnh phẩm Trong kỹ thuật PCR ứng dụng rộng rãi giới quy trình phân tích vi sinh ( PCR machine) Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa khuôn trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng khuôn thành hàng triệu khuân thành hàng triệu nhờ hoạt động enzyme polymerase cặp mồi(primer) đặc hiệu cho đoạn DNA Phương pháp cho phép tổng hợp nhanh xác đoạn DNA riêng biệt Đây phương pháp đại thuận tiện cho việc xác định có mặt gen đối tượng vi sinh vật với độ xác cao Nguyên tắc phương pháp là: Một cặp mồi thối hóa chọn để khuếch đại đặc hiệu đoạn DNA 260-bp từ Clostridium botulinum loại A, B, E, F, G, năm mẫu dò riêng lẻ cho phép xác định toxinotype lai sản phẩm PCR 72 chủng loài Clostridium khác thử nghiệm 11 lồi vi khuẩn khác thường tìm thấy mẫu thực phẩm cho sản phẩm khuếch đại Xét nghiệm phát Clostridium botulinum loại A B 10 chủng Clostridium botulinum loại E cho phản ứng Với 184 mẫu thực phẩm bị ô nhiễm nhân tạo, sau bước làm giàu 18h, độ nhạy 10 vi khuẩn/g mẫu tương đương với BioAssay chuột đạt 95,6% 18 Clostridium botulinum 2011 Quy trình: Nhằm khảo sát khả nhân gen BoNT cặp mổi CBML phản ứng PCR phát C.btulinum, ta tiến hành thí nghiệm sau: TN1: Thực phản ứng PCR phát riêng chủng C.btulinum nhóm A, B, E, F cặp mồi CBMLA, CBMLB, CBMLE, CBMLF với DNA mẫu tương ứng TN2: Thực phản ứng PCR phát riêng chủng C.btulinum nhóm A, B, E, F cặp mồi CBMLA, CBMLB, CBMLE, CBMLF với hỗn hợp DNA bốn chủng C.botulinum nhóm A, B, E F TN1 TN2 ta thu sản phẩm PCR: sản phẩm có kích thước bốn sản phẩm sau: Sản phẩm có kích thước 782 bp (đối với trường hợp sử dụng cặp mồi CBMLA) Sản phẩm có kích thước 205 bp (đối với trường hợp sử dụng cặp mồi CBMLB) Sản phẩm có kích thước 389 bp (đối với trường hợp sử dụng cặp mồi CBMLE) Sản phẩm có kích thước 543 bp (đối với trường hợp sử dụng cặp mồi CBMLF) Kết trình bày Bảng đây: Nhóm A Mồi CBMLA1 CBMLA2 CBMLB1 CBMLB2 CBMLE1 CBMLE2 CBMLF1 CBMLF2 B E F 19 Trình tự từ 5’ – 3’ AGCTACGGAGGCAGCTATGTT CGTATTTGGAAAGCTAGGAAGG CAGGAGAAGTGGAGCGAAAA CTTGCGCCTTTGTTTTCTTG CCAAGATTTTCATCCGCCTA GCTATTGATCCAAAACGGGA CGGCTTCATTAGAGAACGGA TAACTCCCCTAGCCCCGTAT Độ dài sản phẩm PCR (bp) 782 205 389 543 Clostridium botulinum 2011 Điện di gel agarose 1,5%, xem kết điện di đèn UV Nếu giếng mẫu phân tích có vạch sau kết luận mẫu bị nhiễm C.botulinum tương ứng: + Sản phẩm có kích thước 782 bp: mẫu bị nhiễm C.botulinum A; + Sản phẩm có kích thước 205 bp: mẫu bị nhiễm C.botulinum B; + Sản phẩm có kích thước 389 bp: mẫu bị nhiễm C.botulinum E; + Sản phẩm có kích thước 543 bp: mẫu bị nhiễm C.botulinum F ● Ưu điểm phương pháp PCR: - Thời gian cho kết nhanh - Hóa chất sẵn có dễ tồn trữ hơn, khơng cần dụng cụ chuẩn đốn phức tạp, thực trường - Ít tốn mặt nhân ● Nhược điểm: - Phương pháp không phân biệt tế bào sống với tế bào chết Do dẫn đến trường hợp dương tính giả DNA từ tế bào chết Ngược lại phương pháp cho phép phát bào tử, dạng tiềm sinh, hay tế bào chết 2.4 Clostridium botulinum liên quan đến thực phẩm 2.4.1 Khả nhiễm Clostridium botulinum thực phẩm Khi nhiễm vào thực phẩm, gặp điều kiện thích hợp nhiệt độ, độ pH, hàm lượng nước C.botulinum sinh trưởng, phát triển cách sử dụng nguồn dinh dưỡng có sẵn phong phú thực phẩm, phân giải cao phân tử gồm protein, lipid, saccharose sinh khí tạo mùi khó chịu…và tiến hành sản sinh độc tố botulin Bốn đặc điểm chung nhận thấy bùng phát bệnh ngộ độc thực phẩm là: 20 Clostridium botulinum 2011  Các ăn bị nhiễm bào tử tế bào sinh dưỡng vi khuẩn Clostridium botulinum từ đầu trình chế biến  Thực phẩm bị phân hủy phần vi dinh vật cạnh tranh , vi điều kiện thường nên kiểm sốt C.botulinum  Thực phẩm mơi trường thuận lợi cho phát triển vi sinh vật nhiệt độ, hoạt độ nước, pH, dinh dưỡng…  Các thực phẩm bảo quản lạnh sau xử lý nhiệt nhẹ khơng đủ để vơ hiệu hóa độc tố Ở môi trường acid thấp sản phẩm đồ hộp, môi trường đáp ứng đầy đử tiêu chí trên, việc sản xuất đồ hộp cơng nghiệp q trình kiểm sốt nghiêm ngặt cần thiết Khi sản phẩm đồ hộp sản xuất theo quy mô nhỏ hộ gia định trình kiểm tra nghiêm ngặt việc phát loại bỏ mầm bệnh gây độc tố chưa phổ biến Ở Mỹ, nơi sản xuất nhỏ lẽ hộ gia đình cách xử lý thực phẩm chưa cách, đặc biệt sản phẩm từ rau nguyên nhân ca ngộ độc thịt Giữa năm 1899 – 1991 có 522 vụ liên quan đến ngộ độc sản phẩm đồ hộp gia đình gây ra, điều quan tâm có 432 vụ liên quan đến rau Điều so sánh với 55 vụ ngộ độc sản phẩm thương mại đồ hộp gây trước giai đoạn 1925 Một loạt loại thực phẩm có liên quan đến ngộ độc Vương quốc Anh mà nguyên nhân sản phẩm đồ hộp hộ sản xuất quy mô nhỏ Tuy nhiên tỷ lệ thấp so với số báo cáo số nước châu Âu Cá bị nhiễm độc Clostridium botulinum, ngộ độc độc tố loại E, môi trường nước sản phẩm từ cá tươi nguyên nhân gây vụ ngộ độc độc tố loại E kiểm sốt phát triển Clostridium botulinu biện pháp nhờ vào ức chế muối, hun khói, gia nhiệt phương pháp sấy để ngăn chặn tiêu diệt chúng Với phát triển công nghệ lạnh, thực phẩm hun khói ướp muối giảm bớt thay vào ưa thích người tiêu dùng dành cho sản phẩm có chút hương vị đặc trưng Trong năm 1960, hai vụ ngộ độc lớn xảy bắc Mỹ độc thịt loại E gây ra, mà nguyên nhân sản phẩm cá hun khói bao gói bao bì hút chân khơng Vụ ngộ độc có sức lan tỏa lớn, Canada định cấm nhập sản phẩm từ cá hun khói Năm 21 Clostridium botulinum 2011 1970, vụ ngộ độc xảy tương tự Đức mà nguyên nhân cá hồi hun khói trang trại cá Bảng: Ngộ độc thực phẩm Vương quốc Anh Số Năm người Loại thực phẩm chết/vụ 1922 1932 1934 1935 1935 1949 1955 1978 1987 1989 1998 2003 2005 8/8 1/2 0/1 4?/5? 1/1 1/5 0/2 2/4 0/1 1/27 1/2 1/1 0/1 Pate vịt Nước luộc thỏ chim bồ câu Thỏ hầm nồi đất Món chay hạt bắp Bánh nhân thịt bằm Pho - mát Cá muối Cá hồi đóng hộp Rau đóng hộp Hazelnutbổ sung vào sữa chua Nấm đóng chai Xúc Xích Balan Thịt lợn (Sản Độc xuất tố tìm thấy nhà) (No) A (Yes) ? (Yes) ? (Yes) A (Yes) B (Yes) ? (?) A (No) E (No) A (No) B (Yes) B (Yes) B (Yes) (-) Bảng: Ngộ độc botulin Châu Âu Belgium Denmark England and Wales Finland France Germany Greece Italy Scotland Spain Sweden 22 198 199 199 0 199 199 199 0 199 199 27 0 1 0 15 54 0 11 15 45 10 23 12 5 26 12 0 10 17 39 0 13 13 26 7 11 41 12 58 32 0 NA 19 26 11 1996 1998 1 Clostridium botulinum 2011 The Netherlands 0 0 0 0 0 Đầu tiên, cá bảo quản túi chân không nguyên nhân đáng sợ cho vụ ngộ độc, tạo mơi trường yếm khí thuận lợi cho phát triển mạnh mẽ Clostridium botulinum Và thật nguyên nhân bị ảnh hưởng nhiều yếu tố Ướp muối hun khói khơng đủ để loại bỏ Clostridium botulinum ức chế phát triển chúng trình bảo quản Người ta khuyến cáo để bảo quản cá: tỷ lệ muối khoảng 3% nhiệt độ khơng khí xung quanh khơng 630C suốt q trình hun khói Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ sản phẩm/thời gian cần thiết cho Clostridium botulinum phát triển khả tạo độc tố Sản phẩm cá nên lưu giữ nhiệt độ 0C Cuối cùng, sản phẩm đóng gói chân khơng cải tiến: thời hạn sử dụng sản phẩm in bao bì để giới hạn thời gian cần thiết cho phát triển vi sinh vật, nấm mốc, khuôn mẫu để biểu thaị sản phẩm ăn Sản phẩm cá thủy phân sống sau trình lên men nguyên nhân gây vấn đề ngộ độc, ví dụ isushi Năm 1896, tây bắc Canada xảy vụ ngộ độc loại E ghi lại sau dùng bữa ăn với cá, thịt loại thủy sản chân chim cánh cụt lên men Các ăn chuẩn bị xơ nhựa bịt kín lại đưa chúng vào nhiệt độ phịng để lên men Q trình có khác biệt so với bình thường chúng lưu trữ vịng ngày bình thường diễn khoảng ngày thời tiết khơng phải mùa nóng Điều làm cho động vật biển sau lên men có hương vị khác thường sau điều tra cho thấy rắng có xuất Clostridium botulinum sản sinh độc tố loại E sản phẩm Ở châu Âu, Nauy vụ ngộ độc thịt xảy lên men cá hồi không hồn tồn Trong thời gian dài, có mặt Clostridium botulinum thịt ý q trình xử lý khơng phù hợp cách bữa ăn làm tăng số vụ ngộ độc số nước châu Âu Cụ thể vương quốc Anh xảy số vụ ngộ độc từ thịt, vụ ngộ độc lớn xảy năm 1989, có 27 người bị trúng độc người chết ăn phải sữa chua Độ pH sữa chua thấp độc tố phát triển, độc tố loại B phát triển q trình xử lý nhiệt không triệt để Đất ô nhiễm nguyên nhân Clostridium botulinum thực phẩm gây ra, ngồi có thực vật đặc biệt trồng lấy củ tránh khỏi Ba vụ ngộ độc thịt loại A xảy Mỹ cho từ nơi chế biến khoai tây xà lách phần khoai tây lưu trữ vài ngày nhiệt độ môi trường 23 Clostridium botulinum 2011 điều kiện yếm trước sử dụng Năm 1987, hành khách hãng hàng không châu Âu bị nhiễm độc tố botulin loại A ăn phải rau xà lách đóng gói từ trước Điều quan trọng vụ ngộ độc trình sử dụng nhiệt độ điều kiện mơi trường yếm khí túi chân khơng gói nhơm mà loại độc tố botulin phát triển Năm 2006, Mỹ Canada số vụ xảy khử trùng nước ép cà rốt nhiệt độ lạnh chưa phù hợp 2.4.2 Cách phòng tránh nhiễm Clostridium botulinum Để phòng tránh ngộ độc cho thân, thực phẩm trước ăn cần phải nấu chín kĩ lưỡng đặc biệt loại đồ hộp thực phẩm làm từ thịt cá ăn liền Khơng nên ăn hay nếm loại thịt có mùi ôi, loại đồ hộp bị phồng…Không sử dụng thực phẩm nấu chín khơng bảo quản tốt khơng hâm nóng Thời gian hâm nóng phải 15 phút thấy nghi ngờ Khi sử dụng thực phẩm xơng khói cần phải tuân thủ số nguyên tắc để đảm bảo an tồn ln giữ sản phẩm sạch, q trình hun khói bao gói phải theo tiêu chuẩn y tế Các loại thực phẩm sản xuất quy mơ cơng nghiệp phải có cơng đoạn xử lý vi sinh vật hình thức khống chế nhiệt, độ pH, điều kiện khơng khí…để thực phẩm đạt tiêu vi sinh trước tung thị trường phục vụ người tiêu dùng 2.5 Tình hình nhiễm độc tố botulin 2.5.1 Trên giới Những năm gần có thông báo ngộ độc thức ăn loại Clostridium botulinum gây Bệnh thường gặp nước hay dùng đồ hộp Mỹ dùng rau hộp, Đức, pháp dùng dăm bông, lạp xưởng, Ở Liên Xô dùng lạp xưởng, cá ướp muối 24 Clostridium botulinum 2011 Theo số liệu Cơ quan Phòng chống bệnh tật Mỹ (CDC), hàng năm giới có tới 76 triệu người bị ngộ độc thực phẩm, nhiều ca nặng dẫn đến tử vong Mùa hè thời tiết nóng nực nên thực phẩm dễ bị nhiễm bào tử sinh dưỡng Clostridium botulinum, thực phẩm khơng có thiết bị bảo quản hợp lý Hàng năm, trường hợp ngộ độc botulin báo cáo Thái Lan giới Nhưng lần thí nghiệm khẳng định thức ăn nhiễm botulin Thái xảy phía bắc năm 1998, nguồn gốc phát từ thức ăn măng tre nhiễm Clostridium botulinum 2.5.2 Ở Việt Nam Trong vài năm gần bắt đầu ứng dụng độc tố botulin type A điều trị số bệnh rối loạn vận động chuyên khoa thần kinh, số bệnh thuộc chuyên khoa khác mắt, tai mũi họng, thẩm mỹ, hậu môn học, tiết niệu Kể từ năm 2003, phương pháp điều trị chứng loạn trương lực độc tố botulin đưa vào ứng dụng phân khoa thần kinh Bệnh Viện Đại Học Y Dược Tp Hồ Chí Minh bước đầu đáp ứng tốt nhu cầu điều trị người dân nhóm bệnh Những nhận định xác hệ thống phương pháp điều trị độc tố botulin điều kiện Việt Nam cần thiết cho việc triển khai tiếp tục kỹ thuật qui mô rộng rãi cho thời gian tới 25 Clostridium botulinum 2011 Tình hình ngộ độc thực phẩm nước ta vấn đề nóng xã hội, ngành y tế phối hợp với bộ, ngành liên quan tăng cường biện pháp an toàn vệ sinh thực phẩm khó khăn kiểm sốt ngộ độc thực phẩm Các số liệu cho thấy tỷ lệ vụ ngộ độc cồn công nghiệp chiếm 33.3%, ăn phải nấm độc chiếm 23.8%, ngộ độc cá chiếm 16.7% Cịn ngộ độc nhiễm botulin chưa có số liệu thống kê cụ thể 26 Clostridium botulinum 2011 III Kết luận kiến nghị Qua nội dung tìm hiểu trên, thấy thực phẩm đóng vai trị quan trọng mắc xích với giới vi sinh vật Rõ ràng thực phẩm môi trường lý tưởng cho chúng sinh sôi phát triển Sự có mặt vi sinh vật loại thực phẩm phần có lợi, song nhiều trường hợp chúng mối đe dọa lớn người Clostridium botulinum tỏ loài đáng sợ nhiều thập kỷ trước Việc tránh tác hại loại thực phẩm điều cần thiết Trong sản xuất chế tạo sản phẩm thực phẩm cần tuân thủ điều kiện vệ sinh tránh nhiễm vi sinh vật nhiều lồi có hại khác Bên cạnh tác hại thấy rõ, y học ngày biết cách khống chế sử dụng độc tố botulin liều thuốc làm trẻ hóa Điển hình Botox sản phẩm Botulinum Toxin type A cơng ty Allergan (Mỹ) sản xuất, có tác dụng xóa nếp nhăn vùng hai chân mày, trán mắt Cần phải có hiểu biết Clostridium botulinum độc tố botulin loài vi sinh vật để tránh tác hại đáng tiếc xảy Hy vọng tiểu luận giúp phần để đạt mong muốn nói Để nghiên cứu Clostridium botulinum câu chuyện dài Hơn tài liệu đa số tài liệu tiếng anh nên khó khăn cho người thực Vì nhóm khơng thể tránh sai sót nội dung lẫn hình thức Xin ý kiến đóng góp Cơ tất bạn! Nhóm xin kết thúc đề tài đây! Xin chân thành cảm ơn! 27 Clostridium botulinum 2011 IV Tài liệu tham khảo [1] Food Microbiology – Martin R Adams and Maurice O Moss, University of Surrey, Guildford, UK [2] Clostridium botulinum – Julie A Albrecht, Ph.D., Associate Professor [3] Vi sinh thực phẩm – Viện công nghệ Sinh học – Thực phẩm, Đại học Công nghiệp, Tp.HCM – 2009 [4] Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm, mỹ phẩm – Trần Linh Thước – NXB Giáo Dục – 2009 [5] Xây dựng quy trình chế tạo kit PCR để xét nghiệm vi khuẩn gây bệnh, gây ngộ độc thực phẩm – Trần Linh Thước – NXB ĐH Quốc gia Tp.HCM – 2010 ... xích hay lạp xưởng loại thực phẩm có điều kiện khơng có oxy 1.2 Mục đích Tìm hiểu vi sinh vật gây bệnh thực phẩm mà cụ thể vi khuẩn Clostridium botulinum độc tố botulin vi khuẩn Từ đưa số biện pháp... chúng với loại thực phẩm  Tìm hiểu độc tố botulin gây bệnh thực phẩm nhằm ngăn ngừa khả nhiễm loại độc tố cực độc Clostridium botulinum 2011 II Nội dung 2.1 Tổng quan Clostridium botulinum 2.1.1... Người ta tin vi khuẩn gây bệnh ngộ độc sử dụng làm vũ khí – cách cố ý bỏ vi khuẩn vào thực phẩm, thả vào khơng khí để người khác hít vào 2.2.3 Cơ chế ngộ độc tố Các độc tố botulin chất độc hại biết