VI SINH VẬT HỌC THÚ Y
bộ giáo dục v đo tạo bộ nông nghiệp v PTNT Viện Thú Y Phạm quang thái Nghiên cứu chế tạo vacxin nhũ dầu tụ huyết trùng trâu bò từ chủng p52 Chuyên ngành : Vi sinh vật học thú y Mã số: 62 42 50 10 Tóm tắt luận án tiến sĩ nông nghiệp H Nội - 2008 Công trình đợc hon thnh tại Viện thú y Ngời hớng dẫn khoa học: PGS. TS Trơng Văn Dung GS. TSKH Phan Thanh Phợng Phản biện 1: gs ts. Hồ Đình Chúc Cục Thú y Phản biện 2: pgs. ts Hoàng Đạo Phấn Cục Thú y Phản biện 3: pgs. Ts Trần Đình Từ Trờng Đại học Hồng Bàng Luận án đợc bảo vệ tại hội đồng chấm luận án Nhà nớc Vào hồi: 8 giờ30 ngày 23 tháng 5 năm 2008 Có thể tìm luận án tại: - Th viện Quốc gia. - Th viện Thú y Quốc gia Các công trình nghiên cứu đ công bố có liên quan 1. Phạm Quang Thái (2006), Kiểm tra độ an toàn và hiệu lực của vacxin vô hoạt phèn chua phòng bệnh tụ huyết trùng trâu bò sản xuất theo công nghệ lên men cải tiến, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y tập VIII, số 4, trang 85-91 2. Phạm Quang Thái, Trần Xuân Hạnh, Tô Thị Phấn, Nguyễn Thiên Thu, Phạm Hào Quang, Đỗ Văn Dũng (2007), An toàn và hiệu lực vacxin tụ huyết trùng nhũ hoá chủng P52 Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y tập XIV, số 2, trang 16-23. 3. Phạm Quang Thái, Trần Xuân Hạnh, Tô Thị Phấn, Nguyễn Thiên Thu, Phạm Hào Quang, Trơng Văn Dung (2007), Độ dài bảo quản và độ dài miễn dịch của vacxin tụ huyết trùng nhũ dầu chủng P52, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y tập XIV, số 5, trang 17-22. 1 M U Nghề chăn nuôi trâu bò có vai trò quan trọng trong việc cung cấp sức kéo, phân bón cho trồng trọt, thịt sữa cho nhu cầu tiêu dùng và nguyên liệu nh da, sừng cho ngành công nghiệp. Tuy nhiên, tại một số nớc Châu á trong đó có Việt Nam ngành chăn nuôi trâu bò luôn phải đối phó với các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, và một trong những bệnh đó là bệnh tụ huyết trùng (THT). Bệnh THT trâu bò lần đầu tiên đợc mô tả bởi Bollinger (1878) tại Đức và ở Việt Nam, bệnh đợc phát hiện lần đầu tiên vào cuối thế kỷ XIX (Phan Đình Đỗ, Trịnh Văn Thịnh, 1958). Đến nay bệnh đã có mặt ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nớc và gây thiệt hại đáng kể cho chăn nuôi trâu bò. Để giảm bớt thiệt hại do bệnh THT trâu bò gây ra, việc dùng vacxin phòng bệnh là biện pháp kinh tế và hiệu quả nhất. Tuy nhiên trong thực tế sử dụng vacxin hiện nay cho thấy chất lợng của vacxin còn nhiều hạn chế, do vậy việc nghiên cứu chế tạo vacxin mới có chất lợng tốt là một đòi hỏi chính đáng nhằm phục vụ tốt hơn cho công tác phòng chống dịch bệnh THT trâu bò. Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: "Nghiên cứu chế tạo vacxin nhũ dầu Tụ huyết trùng trâu bò từ chủng P52" Mục tiêu của đề tài: Nghiên cứu sản xuất vacxin THT nhũ dầu có chất lợng cao để cung cấp cho ngời chăn nuôi, làm cơ sở tốt xây dựng một chơng trình tiêm phòng vacxin hiệu quả, góp phần mang lại lợi ích cho ngời chăn nuôi trâu bò. Nội dung nghiên cứu bao gồm: - Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn P. multocida chủng P52 - Nghiên cứu sản xuất vacxin và đánh giá chất lợng của vacxin - So sánh đáp ứng miễn dịch của vacxin tụ huyết trùng trâu bò keo phèn và nhũ dầu. 2 - Xác định độ dài bảo quản và độ dài miễn dịch của vacxin - Thử nghiệm tiêm phòng vacxin trong thực tế sản xuất Một số đóng góp mới của đề tài - Nghiên cứu sản xuất đợc vacxin tụ huyết trùng trâu bò nhũ dầu từ chủng P52, có chất lợng cao so với các vacxin nghiên cứu trớc đây. Ưu điểm của nó là vacxin có độ nhớt thấp, dễ sử dụng, nguyên vật liệu dễ kiếm và có thể sản xuất ở qui mô công nghiệp. - Là vacxin nhũ dầu tụ huyết trùng đợc nghiên cứu khá đầy đủ về độ dài bảo quản và độ dài miễn dịch. Là công trình đầu tiên ở Việt Nam áp dụng thành công kỹ thuật ELISA để kiểm tra mức độ đáp ứng miễn dịch trong bệnh tụ huyết trùng và nghiên cứu đánh giá sự tơng quan giữa các phơng pháp dùng, kỹ thuật ELISA, PMPT và công độc trực tiếp cho bê. Cấu trúc của Luận án Cấu trúc của luận án gồm 135 trang: Mở đầu 3 trang, Chơng 1: Tổng quan tài liệu 45 trang, Chơng 2: Nội dung và phơng pháp nghiên cứu 17 trang, Chơng 3: Kết quả và thảo luận 48 trang, Chơng 4: Kết luận và đề nghị 2 trang, tài liệu tham khảo 18 trang gồm: 24 tài liệu tiếng Việt và 116 tài liệu tiếng nớc ngoài và một số phụ lục. Luận án có 27 bảng biểu, 1 đồ thị và 12 hình ảnh minh họa. Chơng 1 Tổng quan ti liệu 1.1. Vi khuẩn Pasteurella multocida Vi khuẩn P.multocida đợc Kitt phân lập lần đầu tiên vào năm 1879. Tới năm 1939 Rosenbusch và Merchant đề nghị tên gọi là P.multocida (Rimler và Glisson, 1997). Vi khuẩn P.multocida serotype B:2 và serotype E:2 đợc xác định gây bệnh tụ huyết trùng thể bại huyết xuất huyết cho trâu bò. 3 Hiện nay một số loại vacxin THT trâu bò đợc sản xuất và sử dụng rộng rãi ở nớc ta là : Vacxin tụ huyết trùng vô hoạt keo phèn chủng P52, sản xuất tại Công ty Thuốc Thú y TW-NAVETCO; vacxin tụ huyết trùng vô hoạt keo phèn chủng 4T, sản xuất tại Xí nghiệp Thuốc Thú y TW; vacxin tụ huyết trùng vô hoạt keo phèn chủng Iran, sản xuất tại Phân viện Thú y Miền Trung. Tuy nhiên trong thực tế vacxin keo phèn hoặc phèn chua vẫn tồn tại một số nhợc điểm nh đáp ứng miễn dịch cha cao, độ dài miễn dịch ngắn, phản ứng của vacxin sau khi tiêm vẫn xảy ra gây lo ngại cho ngời chăn nuôi. Nghiên cứu vacxin nhũ dầu tụ huyết trùng trâu bò đầu tiên đợc Phan Thanh Phợng và cs (1990) thực hiện tại Việt Nam. Mặc dù thu đợc một số kết quả đáng khích lệ, nhng vacxin vẫn còn một số nhợc điểm cần giải quyết nh độ nhớt cao, gây phản ứng cục bộ; không chủ động đợc nguyên vật liệu do phải nhập từ nớc ngoài và giá nguyên liệu thờng cao; đặc biệt một số chỉ tiêu kỹ thuật về độ dài miễn dịch và độ dài bảo quản của vacxin cha đợc nghiên cứu đầy đủ. Trên cở sở những hiểu biết về vi khuẩn P. multocida và bệnh gây ra do vi khuẩn này ở động vật, xuất phát từ thực tế sản xuất và đòi hỏi của ngời chăn nuôi cần có vacxin THT trâu bò đạt chất lợng tốt, nhằm nâng cao hiệu quả cho công tác phòng chống bệnh tụ huyết trùng cho đàn trâu bò nuôi ở nớc ta chúng tôi tiến hành nghiên cứu chế tạo vacxin nhũ dầu tụ huyết trùng trâu bò từ chủng P52. Đây là giống vi khuẩn đã đợc dùng để sản xuất vacxin tụ huyết trùng trâu bò với chất bổ trợ là keo phèn hoặc phèn chua tại Công Ty Thuốc Thú Y TW từ năm 1991 đến nay. Chơng 2 NI DUNG V PHNG PHáP NGHIêN CU 2.1. Nội dung 4 - Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn P. multocida chủng P52 - Nghiên cứu sản xuất vacxin và đánh giá chất lợng của vacxin - So sánh đáp ứng miễn dịch của vacxin tụ huyết trùng trâu bò keo phèn và nhũ dầu. - Xác định độ dài bảo quản và độ dài miễn dịch của vacxin - Thử nghiệm tiêm phòng vacxin trong thực tế sản xuất 2.2. Nguyên vật liệu, thiết bị Vi khuẩn P. multocida chủng P52 dùng để sản xuất và kiểm nghiệm vacxin. Một số chủng P. multocida phân lập: PKT99 và VP 250 (phân lập từ bò); VP 251 (phân lập từ trâu); HKT99, VP 247, VP 712, VP 366 và PLA2 (phân lập từ heo) và chủng vacxin FgHC dùng để nghiên cứu so sánh. Bê, thỏ, chuột bạch khỏe mạnh. Các chất bổ trợ, môi trờng nuôi cấy, các cặp mồi, hoá chất thuốc thử, dụng cụ, thiết bị cần thiết cho sản xuất và kiểm nghiệm vacxin. 2.3. Phơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phơng pháp giám định vi khuẩn P.multocida. - Thử phản ứng lên men đờng - Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) - Kỹ thuật REP-PCR (Repetitive Extragenic Palindromic -PCR). - Kỹ thuật SDS-PAGE 2.3.2. Phơng pháp sản xuất vacxin Vi khuẩn đợc nuôi cấy trong môi trờng Hottinger bằng phơng pháp lên men vi sinh vật. Từ canh khuẩn này, vi khuẩn sẽ đợc cho hấp phụ với keo phèn hoặc phối trộn với nhũ dầu theo tỷ lệ thích hợp. Nồng độ vi khuẩn trong 1 ml vacxin cuối cùng phải đạt ít nhất 10 x 10 9 CFU/ml. 2.3.3. Phơng pháp đánh giá chất lợng vacxin - Phơng pháp kiểm tra tính chất và tính ổn định của vacxin nhũ dầu. 5 - Phơng pháp kiểm tra độ nhớt của vacxin. - Phơng pháp kiểm tra vô trùng theo Qui trình kỹ thuật kiểm nghiệm vacxin dùng trong thú y TCN 162-92, 1994. - Phơng pháp kiểm tra an toàn của vacxin theo Qui trình kỹ thuật kiểm nghiệm vacxin dùng trong thú y TCN 162-92, 1994. - Phơng pháp kiểm tra hiệu lực của vacxin trên bê theo Qui trình kỹ thuật kiểm nghiệm vacxin dùng trong thú y TCN 162-92, 1994. - Phơng pháp kiểm tra kiểm tra hiệu lực của vacxin trên chuột theo Ose va Muenster (1986). - Phơng pháp bảo hộ chuột thụ động (PMPT) theo miêu tả của De Alwis (1978). - Phơng pháp xác định độ dài bảo quản vacxin trên thỏ và bê. - Phơng pháp đánh giá độ dài miễn dịch của vacxin bằng kỹ thuật ELISA và công cờng độc cho bê. 2.3.4. Một số phơng pháp khác - Phơng pháp lấy huyết thanh bê. - Phơng pháp xác định số lợng vi khuẩn của canh trùng. Chơng 3 Kết quả v thảo luận 3.1. Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn P.multocida chủng P52 3.1.1. Đặc điểm sinh hóa học của vi khuẩn Vi khuẩn P.multocida chủng P52 không gây dung huyết, không phát triển khi cấy trên môi trờng MacConkey, phản ứng catalase, oxidase, indol, ornithine dơng tính, phản ứng ure âm tính. Vi khuẩn lên men đờng glucose, mannitol, sorbitol, sucrose, xylose; không lên men lactose, arabinose, dulcitol, maltose, dulcitol và trehalose. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn P.multocida chủng P52 6 tơng tự các chủng PKT99, VP 251 phân lập đợc trong các ổ dịch tụ huyết trùng trâu bò (bảng 3.1). Bảng 3.1: Tính chất sinh hoá của vi khuẩn P. multocida chủng P52 Chủng vi khuẩn Các chất thử PLA2 P52 PKT99 VP 51 HKT99 Dung huyết MacConkey catalase oxidase ODC Indol Urea Glucose Arabinose Dulcitol Lactose Maltose Mannitol Sorbitol Sucrose Trehalose Xylose - - + + + + - + - - - - + + + - + - - + + + + - + - - - - + + + - + - - + + + + - + - - - - + + + - + - - + + + + - + - - - - + + + - + - - + + + + - + - - - - + + + - + 3.1.2. Giám định vi khuẩn P. multocida bằng kỹ thuật PCR. Kết quả giám định cho thấy vi khuẩn chủng P52 và các chủng khác PKT99, VP 251 đều cho kết quả dơng tính với các cặp mồi PM, HSB và CAP-B (hình 3.2). Theo nghiên cứu của Townsend (1998) bất cứ chủng vi khuẩn P.multocida nào dơng tính với ba cặp mồi nêu trên đều thuộc serotype B:2 hoặc B:2,5. Nh vậy vi khuẩn P.multocida thuộc serotype B:2 nh các chủng PKT99, VP 251. 3.1.3. So sánh chủng P52 và các chủng P. multocida dựa trên kỹ thuật REP-PCR và SDS-PAGE Vi khuẩn P.multocida chủng P52 cho sản phẩm REP-PCR giống nh các chủng khác dùng nghiên cứu (Hình 3.2). Sản phẩm này gồm 12 đoạn DNA với kích thớc khác nhau, phân bố trong khoảng từ 250 bp đến 3000 bp. 7 Hình 3.2: Kết quả PCR với cặp mồi PM và CAP-B. Các mẫu: PLA2 (Phân lập từ heo, serotype A:1); P52 (chủng vacxin); PKT99 (Phân lập từ bò, serotype B:2); VP 251 (Phân lập từ trâu, serogroup B:2); HKT99 (Phân lập từ heo, serotype B:2); M. thang DNA chuẩn (1kb DNA ladder, GeneRulerTM, MBI Fermentas) Hình 3.3: Kết quả REP - PCR của chủng PCR và các chủng vi khuẩn P. multocida serotype B:2 phân lập từ trâu, bò, heo bị bệnh THT. Từ trái qua phải: (P52 - chủng vacxin; PKT99 - chủng phân lập từ bò, serotype B:2; VP 251 - chủng phân lập từ trâu, serotype B:2; HKT99 - chủng phân lập từ heo, serotype B:2; FgHC - chủng vacxin của heo, serotype B:2; VP 247 - chủng phân lập từ heo, serotype B:2; VP 250 - chủng phân lập từ bò, serotype B:2; M- thang DNA chuẩn. [...]... trình b y, chúng tôi đa ra một số kết luận sau đ y: 1 Bằng vi c sử dụng các kỹ thuật truyền thống và các kỹ thuật sinh học phân tử (PCR, REP-PCR,SDS-PAGE) đã xác định đợc vi khuẩn P multocida chủng P52 có đặc tính sinh vật hóa học, typ kháng nguyên (serotype), cấu trúc gen và protein giống với các chủng P multocida phân lập đợc trong các ổ dịch Tụ huyết trùng g y bại huyết, xuất huyết ở trâu bò tại Vi t... nhận th y đàn trâu bò đợc phòng bệnh tốt với bệnh THT Không có bất cứ trâu bò tiêm phòng vacxin chết đợc xác định là do bệnh THT Thử nghiệm tiêm phòng vacxin cũng đợc thực hiện ở một số vùng thờng hay có dịch THT nh huyện Hng Nguyên tỉnh Nghệ An Đ y là Huyện đợc thông báo hay x y ra dịch tình trạng bò bê bị phản ứng sau khi tiêm vacxin THT trâu bò keo phèn Kết quả theo dõi sau khi tiêm phòng tại huyện... chú: *Thời gian theo dõi 14 ng y KTĐ: Không nhận th y có sự thay đổi TLD: tách lớp dầu Kết quả ở (bảng 3.2) cho th y vacxin khi thử ở các nhiệt độ khác nhau 2-8oC, 25-28oC và 37oC trong vòng 14 ng y, không có những thay đổi về mặt vật lý Theo tiêu chuẩn của hãng Seppic (Pháp) thì sự tách lớp dầu trên bề mặt vacxin cho phép