NGHIÊN cứu PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT POLYMANNURONIC AXÍT từ RONG nâu ở TỈNH KHÁNH HOÀ

Các hợp chất trong rong nâu có nhiều tắnh chất hóa lý, hoạt tắnh sinh học quắ như alginate, fucoidan, laminaran, mannitol, iod hữu cơ, các hợp chất chuyển hóa thứ cấp Ầ, ựược sử dụng rất

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

KHOA CHẾ BIẾN

====


====

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT POLYMANNURONIC AXÍT TỪ RONG NÂU

Ở TỈNH KHÁNH HỒ

GVHD : Nguyễn Duy Nhất SVTH : Nguyễn Văn Long MSSV : 47134271

LỚP : 47TP - 3

Nha Trang, tháng 06 năm 2009

LỜI CẢM ƠN

được sự ựồng ý của ban giám hiệu trường ựại học Nha Trang, ban chủ nhiệm khoa chế biến tôi ựược giao thực hiện luận văn tốt nghiệp tại viện nghiên cứu và ứng dụng Nha Trang

Trong quá trình thực hiện luận văn tôi ựã nhận ựược sự gúp ựỡ của thầy

cô trong khoa, giáo viên hướng dẫn, các bộ công tác trong viện nghiên cứu và ứng dụng nha trang Tôi xin trân thành cảm ơn TS Nguyễn Duy Nhất, TS Vũ Duy đô, thầy cô trong khoa chế biến, các bộ trong viện nghiên cứu và ứng dụng Nha Trang ựã gúp tôi hòan thành luận văn tốt nghiệp

MỤC LỤC

Trang

ðẶT VẤN ðỀ 1

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 9

1.1.PHÂNLOẠIVÀỨNGDỤNGRONGBIỂNTRÊNTHẾGIỚI 9

1.1.1.TÌNH HÌNH Sử DụNG RONG BIểN 9

1.1.2.PHÂN LOạI RONG BIểN 10

1.1.3.PHÂN Bố CủA 3 NGÀNH RONG BIểN TRÊN THế GIớI : 12

1.1.4.SảN LƯợNG RONG BIểN TRÊN THế GIớI: 13

1.1.5.RONG MƠ VIệT NAM: 14

1.2.XÁCðỊNHPOLYMANNURONICAXÍT(MANNURONAN) 15

1.2.1.CấU TRÚC MANNURONAN 15

1.2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CứU Sự CÓ MặT CủA NANNURONAN 16

1.2.2.1.Xác ñịnh thành phần mannuronic bằng phương pháp HPEAD: 16

1.2.2.2 Phổ NMR của mannuronan 16

1.3.PHƯƠNGPHÁPCHIẾTTÁCHMANNURONANTỪRONGNÂU 18

1.3.1PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIếT MANNURONAN THÔNG QUA TÁCH CHIếT ALGINATE 18

I.3.1.1 Phương pháp chiết alginate 18

1.3.1.2 Thủy phân từng phần alginate thu mannuronan 21

1.3.2PHƯƠNGPHÁPTÁCHCHIẾT MANNURONAN KHÔNG QUA TÁCH CHIẾT ALGINATE 22

1.4.TÁCDỤNGSINHHỌCCỦAMANNURONAN 24

CHƯƠNG 2: ðỐI TƯỢNG VÀ THỰC NGHIỆM 25

2.1.ðỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU: 25

2.2.THỰC NGHIỆM: 26

2.2.1.TÁCHCHIẾT MANNURONAN:SƠðỒNGHIÊNCỨUTỔNGQUÁTTHỰC NGHIỆM 26

2.2.1.1 Bố trí khảo sát nhiệt ñộ chiết ñể sản phẩm không chứa alginate: 27

2.2.1.2 Khảo sát thời gian chiết: 28

2.2.1.3 Khảo sát nồng ñộ axít acetic ñể tách mannuronan ra khỏi dịch chiết nước

ban ñầu: 30

2.2.1.4 Khảo sát nồng ñộ ethanol ñể tách mannuronan ra khỏi dung dịch: 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1:KHảO SÁT NHIệT ðộ CHIếT ðể SảN PHẩM KHÔNG CHứA ALGINATE 33

3.2KHảO SÁT THờI GIAN CHIếT: 34

3.2KHảO SÁT NồNG ðộ ETHANOL ðể TÁCH MANNURONAN RA KHỏI DUNG DịCH: 35

3.3.KHảO SÁT NồNG ðộ AXÍT ACETIC ðể TÁCH MANNURONAN RA KHỏI DịCH CHIếT NƯớC BAN ðầU 35

3.5.ðỀXUẤTQUYTRÌNHTÁCHCHIẾTPOLYMANURONICTỪRONGNÂU 38

KẾT LUẬN 41

ðỀ XUẤT Ý KIẾN 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1: Thành phần hoá học (trên 100g rong) của một số loài rong trong 3 ngành chính 10 Bảng 1.2: Các dạng hydratcacbon trong 3 ngành rong biển 11 Bảng 1.3 ñộ dịch chuyển hóa học trong phổ CNMR của mannuronan 17

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1: phổ CNMR của mannuronan 17

Hình 1.2 phổ HNMR và CNMR của alginate gồm khối G và khối M 18

Hình 1.3 : Sơ ñồ chiết alginate từ rong nâu 20

Hình 1.4 : Sơ ñồ tách chiết mannuronan từ alginate 22

Hình 2.1: Sơ ñồ nghiên cứu tổng quát thực nghiệm 26

Hình 2.2: sơ ñồ khảo sát nhiệt ñộ chiết ñể sản phẩm không chứa alginate 27

Cách tiến hành: 27

Hình 2.3 Sơ ñồ khảo sát thời gian nấu chiết 28

Hình 2.4: Sơ ñồ khảo sát nồng ñộ axít acetic ñể tách mannuronan 30

Hình 2.5: Khảo sát nồng ñộ ethanol ñể tách mannuronan ra khỏi dung dịch 31

Hình 3.1: sơ ñồ quy trình chiết polymannuronic axit từ rong nâu 38

đẶT VẤN đỀ

Việt Nam có hơn 3.000 km bờ biển với sự thay ựổi môi trường sinh thái rất ựa dạng, phong phú Trong số các tài nguyên sinh vật biển của Việt Nam thì nguồn rong biển, ựặc biệt là rong nâu có ý nghĩa rất quan trọng Theo

thống kê chưa ựầy ựủ thì chỉ riêng chi Sargassum của ngành rong nâu ở nước

ta ựã có hơn 70 loài với sản lượng ước tắnh trên 10.000 tấn khô/năm

Các hợp chất trong rong nâu có nhiều tắnh chất hóa lý, hoạt tắnh sinh học quắ như alginate, fucoidan, laminaran, mannitol, iod hữu cơ, các hợp chất chuyển hóa thứ cấp Ầ, ựược sử dụng rất nhiều trong công nghiệp thực phẩm,

mỹ phẩm, dệt, nhuộm, in, thức ăn gia súc, dược liệu ẦNgoài những thành phần ựó, rong nâu còn chứa một lượng tương ựối lớn polymannuronic axắt (mannuronan), thông thường ựể có ựược mannuronan, người ta phải tách chiết alginate sau ựó thủy phân trong môi trường axắt mạnh thành các khối mannuronan (block M), guluronan (block G) và block MG Tuy nhiên, trong một vài nghiên cứu gần ựây các nhà khoa học ựã cho thấy mannuronan thực

tế là một thành phần riêng biệt có mặt trong rong nâu, có thể tách chiết khỏi các polysacarit khác mà không cần phải thủy phân từ alginic axắt Mannuronan có hoạt tắnh sinh học rất quắ ựó là có khả năng sử dụng ựể ựiều trị bệnh ung thư Khác với các polysacarit khác có hoạt tắnh kháng ung thư trong rong nâu như fucoidan, alginate (heteropolysaccharide), laminaran (có tỉ

lệ liên kết 1→3 và 1→6 biến ựổi tùy theo loài rong), mannuronan có cấu trúc

rõ ràng, thành phần ựơn phân tử chỉ có mannuronic axắt, các ựơn phân tử liên kết với nhau theo mạch thẳng đó chắnh là ựặc ựiểm cần thiết ựể ổn ựịnh hoạt lực và là ựiều kiện kiên quyết ựể sử dụng làm thuốc trong y học đẩy mạnh nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tắnh sinh học của các loài rong biển Việt Nam, trong ựó có rong nâu, tìm ra các công nghệ sử dụng, khai thác có hiệu quả chúng là hoàn toàn phù hợp với chiến lược phát triển kinh tế của

ðảng và Chính phủ ðây là vấn ñề có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và kinh tế

xã hội rất cao, phù hợp với xu hướng phát triển của ñất nước

Từ những lý do nêu trên, ñể hoàn chỉnh thêm những nghiên cứu về rong nâu, nhằm khai thác nguồn tài nguyên biển dồi dào và ñể tạo ra những chế phẩm phục vụ chăm sóc sức khoẻ cộng ñồng chúng tôi ñặt vấn ñề thực hiện

ñề tài:

“ Tách chiết polymannuronic axít từ rong nâu ở tỉnh Khánh Hoà sử

dụng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ ñiều trị bệnh ung thư”

Với nhiệm vụ của luận án là:

- Nghiên cứu các phương pháp tách chiết polymannuronic axít

ñã ñược công bố, từ ñó rút ra phương pháp chiết polymannuronic axít, phù hợp với ñiều kiện sử dụng làm thực phẩm chức năng

- Tách chiết polymannuronic axít từ rong nâu ñộc lập với tách

chiết alginic axít

- Xác ñịnh sự có mặt và hàm lượng của polymannuronic axít

trong sản phẩm

- Phân tích các chỉ tiêu hóa, lý, sinh và tìm tài liệu ñã công bố

polymannuronic axít có khả năng ñiều trị bệnh ung thư ñể chứng minh sản phẩm ñủ ñiều kiện làm thực phẩm chức năng

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 1.1 PHÂN LOẠI VÀ ỨNG DỤNG RONG BIỂN TRÊN THẾ GIỚI

1.1.1 Tình hình sử dụng rong biển

Rong biển ñã ñược sử dụng từ rất sớm, khoảng 2700 năm trước công nguyên ở Trung quốc, 600 năm trước công nguyên, rong biển ñã ñược chế biến thành một món ăn quí dành cho vua chúa Thuốc “trường sinh bất tử” ñược vị hoàng ñế ñầu tiên của Trung Hoa là Tần Thuỷ Hoàng sử dụng vào năm 200 trước công nguyên ñã ñược khoa học hiện ñại chứng minh ñó chính

là hợp phần của rong nâu sau hơn 2000 năm Trong mười năm gần ñây, chính quyền Trung Quốc ñã chi phí ñến 12 triệu USD ñể phát triển một loại thuốc trị AIDS từ rong nâu với tên thương phẩm là FUCOIDAN-GLYCOCALYX (F-GC) Loại thuốc tự nhiên này có khả năng diệt virus HIV, tăng sức chịu ñựng của phân tử miễn dịch Ngày 01 tháng 01 năm 2003 loại thuốc này ñã ñược chính phủ Trung Quốc cấp phép cho sản xuất và ñưa vào sử dụng

Tại Nhật rong nâu ñã ñược sử dụng làm thức ăn từ thế kỷ thứ V Cuối năm 2001 cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm của Mỹ ñã xem xét và xác nhận các sản phẩm thực phẩm chức năng ở Nhật ñược bổ sung thêm thành phần fucoidan có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch, giảm cholesterol, giảm mỡ máu, các sản phẩm này ñã trở thành thực phẩm hỗ trợ trị bệnh nan y phổ biến của nước Nhật

Rong biển ñã ñược dùng làm thực phẩm trên toàn thế giới rất quen thuộc với chúng ta (rong ñỏ: agar, carrageenan, rong nâu: alginat), chúng cũng là nguồn bổ sung dưỡng chất (protein, vitamin, khoáng vi lượng) cho thức ăn nuôi tôm, thức ăn gia súc, ñược dùng trong công nghiệp dệt, nhuộm, mực in, sơn, hàn ñiện, lọc và hấp phụ các hợp chất, công nghiệp giấy, trong

kỹ thuật nuôi cấy vi sinh, ñiện di Sản phẩm từ rong biển còn là nguyên liệu không thể thiếu cũng như trong công nghiệp nước giải khát và ñồ hộp, socola,

mỹ phẩm cao cấp (carrageenan) Ngoài ra rong biển còn dùng làm chất kích thích sinh trưởng với chất oligo alginat, laminaran (rong nâu) cùng các hợp chất như auxin, gibberelin, cytokinin, thường có trong hầu hết các ngành rong Rong biển còn ñược sử dụng chữa trị ung thư theo các bài thuốc gia truyền dưới dạng dùng kết hợp với các thuốc khác và polyphenol trong rong nâu cũng ñược dùng làm trà chống lão hoá ðặc biệt trong thời gian gần ñây

ñã có sáng chế ñăng ký tại Mỹ về nghiên cứu rong biển ñể sản xuất nhiên liệu sinh học (biodiesel)

1.1.2 Phân loại rong biển

Hiện nay, rong biển ñược phân thành 3 ngành chính :

Bảng 1.1: Thành phần hoá học (trên 100g rong) của một số loài rong trong 3 ngành chính

Ascophyllum nodosum

Laminaria digitata

Alaria esculenta

Palmaria palmata Porphyra sp.

Porphyra yezoensis

Ulva species

Nước (%) 70-85 73-90 73-86 79-88 86 Nd 78 Tro 15-25 73-90 73-86 15-30 8-16 7.8 13-22

Axít polyuronic 15-30 20-45 21-42 0 0 0 0

Mannitol 5-10 4-16 4-13 0 0 0 0

Protein 5-10 8-15 9-18 8-25 33-47 43.6 15-25 Chất béo 2-7 1-2 1-2 0.3-0.8 0.7 2.1 0.6-0.7

Magie 0.5-0.9 0.5-0.8 nd 0.4-0.5 2.0 nd nd Iod 0.01-0.1 0.3-1.1 0.05 0.01-0.1 0.0005 nd nd

ðể thấy rõ hơn sự khác nhau về các dạng hydratcacbon trong các ngành rong ta xem thành phần có mặt của chúng theo bảng 1.2

Bảng 1.2: Các dạng hydratcacbon trong 3 ngành rong biển

Dạng tan trong nước Agar Hetero-complex Alginat

Carrageenan Ion/trung tính Fucoidan Carragar

Xylan sulfat hoá Các loại khác Trong dịch tế bào Tinh bột Floridean Tinh bột Laminaran

Từ thành phần các polysaccharide trên bảng 1.1 cho thấy polyuronan chỉ có trong rong nâu

1.1.3 Phân bố của 3 ngành rong biển trên thế giới :

Xét về số lượng các loài rong, thì rong lục (Chlorophyta) trên thế giới chủ yếu phân bố tập trung tại Philippin, tiếp theo là Hàn Quốc, kế tiếp là

Indonesia, Nhật Bản và ắt hơn là ở Việt Nam với các loài Caulerpa racemosa,

Ulva reticulata, Ulva lactuca Ngoài ra, rong lục còn phân bố rải rác ở các

nước bao gồm: Achentina, Bangladesh, Canada, Chile, Pháp, Hawaii, Israel, Italy, Kenya, Malaysia, Myanmar, Bồ đào Nha, ThailanẦ

Rong ựỏ (Rhodophyta) phân bố nhiều ở Việt Nam bao gồm một số loài

như: Betaphycus gelatinum, Calaglossa leprieurii, Gelidiella acerosa,

Gigartina intermedia, Gloiopeltis spp., Gracilaria spp., Gracilaria asisatica, Gracilaria coronopifera, Gracilaria eucheumoides, Gracilaria firma, Gracilaria heteroclada, Gracilaria salicornia, Gracilaria tenuistipitata var liui, Hypnea muscoides, Hypnea valentiae, Kappaphycus cottonii, Porphyra crispata, Porphyra suborbiculata, Acanthophora spicifera Sau Việt Nam là

Nhật Bản, Chile, Indonesia, Philippin, Canada, Hàn Quốc cùng số lượng loài tương ựương nhau, tiếp theo sau là Thailan, Brazil, Pháp, Bồ đào Nha, Trung Quốc, Hawaii, Myanmar, Nam Phi, ắt hơn nữa là Anh, Bangladesh, Caribbe, Ireland, Peru, Tây Ban Nha, Achentina, ấn độ, Italy, Malaysia, Mexico, New Zealand, Mỹ Ngoài ra rong ựỏ còn rải rác có mặt ở Iceland, Alaska, Kenya, Madagascar, Kiribati, Ai Cập, Israel, Ma rốc, Namibia, Tanzania

Rong nâu (Phaeophyta) phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, ấn độ, kế tiếp là Chile, Achentina, Brazil, Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ đào Nha Trong ựó bộ Fucales, ựối tượng phổ biến và kinh tế nhất của rong nâu ựại

diện là họ Sargassaceae với hai giống Sargassum và Turbinaria phân bố chủ

yếu ở vùng cận nhiệt ñới

Hệ thống phân loại Sargassum trtên thế giới rất phức tạp, năm 1753 ba loài thuộc chi Fucus: Fucus natans, F acinarius và F lendigerus do Linnaeus mô tả lần ñầu tiên nay ñược thay thế bằng chi Sargassum Giữa những năm 1808 ñến 1819, 36 loài rong thuộc chi Fucus ñược mô tả ngày nay cũng ñược chuyển sang chi Sargassum, năm 1820 J.Agardh giới thiệu chi

Sargassum với số loài lúc này là 62 loài Sau thời gian ñó rất nhiều tác giả

khác tiếp tục giới thiệu về Sargassum như Yendo (1907), Reinbold (1913), Grunow (1915, 1916) and Setchell (1931) Số loài Sargassum lên ñến 230 Năm 1954 Womersley công bố hệ thống phân loại Sargassum của mình ở Úc,

cùng với các tác giả ñương thời ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới như Phạm Hoàng Hộ của Việt Nam, Chou, Chiang của Taiwan và Ang, Trono của

Philippin, ñến nay tổng số loài của chi Sargassum ñã lên ñến hơn 500

Sargassum tại Việt Nam hiện nay có khoảng 70 loài (thực vật chí Việt Nam),

số lượng loài Sargassum phân bố trên các nước luôn thay ñổi theo các nghiên cứu gần ñây nên khó có thể kết luận hiện nay Sargassum phân bố nhiều nhất

ở nước nào Riêng tính ñến 1998 thì nhiều nhất là ở ấn ðộ, Philippin và Việt Nam

Phân bố về số loài rong biển tuy ñã ñược tổng kết sơ bộ, tuy nhiên, tuỳ theo diện tích lãnh hải, ñiều kiện môi trường phát triển, kỹ thuật nuôi trồng khác nhau của các nước mà sản lượng rong biển trên thế giới khác với phân

bố các loài rong

1.1.4 Sản lượng rong biển trên thế giới:

Rong lục chủ yếu là của Nhật Bản khoảng 4.000 tấn khô với các chi

như Enteromorpha, Monostroma, Ulva, trong ñó nuôi trồng khoảng 2.500

tấn, kế tiếp là Hàn Quốc khoảng 1.000 tấn chi Enteromorpha, Philippines

khoảng 800 tấn chi Caulerpa, gần như toàn bộ do nuôi trồng

Rong ựỏ chủ yếu là Pháp khoảng 600.000 tấn, chi Maerl, tiếp theo là Anh khoảng 200.000 tấn, chi Maerl (t ww), ắt hơn là Chile khoảng 75.000 tấn gồm các chi Gracilaria, Gigatina, Gelidium Nhật Bản khoảng 65.000 tấn, trong ựó khoảng 60.000 tấn là do nuôi trồng, gồm các chi Porphyra và

Gelidium Philippines khoảng 40.000 tấn do nuôi trồng bao gồm chi Euchuema và Kapaphycus Hàn Quốc cũng có sản lượng tương ựương với

chi Porphyra, tiếp ựến là Trung Quốc với khoảng 31.000 tấn chủ yếu là

Porphyra, Indonesia khoảng 26.000 tấn chi Euchuema và GracilariaẦViệt

Nam khoảng 2.000 tấn chi Gracilaria

Sản lượng rong nâu lớn nhất thế giới tập trung tại Trung Quốc với trên

667.000 tấn khô, tập trung vào 3 chi Laminaria, Udaria, Ascophyllum Korea khoảng 96.000 tấn với 3 chi Udaria, Hizakia, Laminaria Nhật Bản khoảng 51.000 tấn Laminaria, Udaria, Cladosiphon, Na Uy khoảng 40.000 tấn, Chile khoảng 27.000 tấnẦ

1.1.5 Rong mơ việt nam:

Năm 1790 Loureiro là tác giả ựầu tiên ựể ý ựến một số loài rong mơ nhưng chỉ mô tả sơ lược, không hình vẽ trong thực vật chắ đông Dương

ỘFlora CochinchinensisỢ Năm 1837 cuộc thám hiểm bờ biển Việt Nam ựược

thực hiện trên tàu ỘLa BoniteỢ, Gaudichaud ựã thu ựược một loài Turbinaria

và 4 loài Sargassum, sau ựó Busseuil thu thêm 4 loài nữa Mãi ựến năm 1954

Dawson ựến làm việc tại Viện Hải Dương Học Nha Trang có mô tả thêm 2 loài Toàn bộ các mẫu vật ựó hiện nay ựều không còn lưu giữ tại Việt Nam Giáo sư Phạm Hoàng Hộ năm 1961 trong luận án ựã mô tả 15 loài, ựến năm

1967 mô tả ựược 41 loài ở miền bắc, Nguyễn Hữu Dinh trong luận án năm

1972 mô tả ựược 22 loài, so với rong miền nam ựã bổ sung ựược 9 loài Năm

1992 Nguyễn Hữu đại trong luận án ựã mô tả 52 loài và trong ỘRong mơ Việt Nam nguồn lợi và sử dụngỢ 1997 ựã mô tả 68 loài

Hầu hết các loài rong Mơ sinh trưởng và phát triển ở dạng sống bám, thắch hợp với ựiều kiện sinh thái môi trường có ựộ mặn cao, nước trong và có sóng Vì vậy rong Mơ phân bố phổ biến ở các bãi triều ựáy cứng (ựá tảng, ựá, san hô chết, các rạn ngầm ) ven biển và các ựảo Do ựặc ựiểm của ựịa hình

có nhiều núi ở ven biển hoặc lấn ra sát biển, ựộ muối ổn ựịnh và cao quanh năm, các dòng sông ngắn và có nhiều ựảo, nên vùng biển đà Nẵng (chân ựèo Hải Vân, bán ựảo Sơn Trà), Quảng Nam (Cù Lao Chàm, Núi Thành), Quảng Ngãi (Bình Châu, ựảo Lý Sơn, Sa Huỳnh), Bình định (Phù Mỹ, Qui Nhơn), Phú Yên (vịnh Xuân đài, Cù Mông), Khánh Hòa (vịnh Văn Phong, Hòn Khói, vịnh Nha Trang, vịnh Cam Ranh), Ninh Thuận (huyện Ninh Hải, Ninh Phước) có nhiều rong Mơ Còn vùng bờ biển từ Bình Thuận ựến Bà Rịa-Vũng Tàu, ven biển có nhiều bãi triều ựáy cát, chỉ có một ắt mũi bãi triều ựáy

ựá ở mũi Né, Long Hương (Bình Thuận), Long Hải, Vũng Tàu (Bà Rịa - Vũng Tàu) nên rong Mơ không nhiều đoạn bờ biển Tây Nam Bộ thuộc tỉnh Kiên Giang chỉ từ Hòn Chông, Hòn Trẹm (xã Bình An) ựến thị xã Hà Tiên,

Mỹ đức, giáp biên giới Campuchia, xuất hiện nhiều bãi triều ựáy ựá và các ựảo, ựộ muối cao và ổn ựịnh mới có rong Mơ phát triển Nhìn một cách tổng quan vùng ven biển và ựảo từ đà Nẵng ựến Vũng Tàu và huyện Hà Tiên (từ

xã Bình An ựến Mỹ đức Hà Tiên) là hai khu vực ở ven biển phắa Nam Việt Nam rong Mơ phân bố tập trung

1.2 XÁC đỊNH POLYMANNURONIC AXÍT (MANNURONAN)

1.2.1.Cấu trúc mannuronan

Mannuronan hay polymannuronic axắt là một polyme mạch thẳng thành phần là các ựơn phân tử liên kết với nhau bằng liên kết ựường β)1→4

1.2.2 Phương pháp nghiên cứu sự có mặt của nannuronan

Trong khuôn khổ của luận văn về chế biến thực phẩm chúng tôi không trực tiếp tiến hành tiến hành xác ñịnh sự có mặt của mannuronan trong sản phẩm Dựa vào kết quả do Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang xét nghiệm sản phẩm chúng tôi có ñưa ra phần sơ lược giải trình các kết quả phân tích như sau:

1.2.2.1.Xác ñịnh thành phần mannuronic bằng phương pháp HPEAD:

Mẫu mannuronan ñược thủy phân trong axít trichloacetic thành monomer sau ñó ñược xác ñịnh trên sắc ký trao ñổi ion hiệu năng cao (HPEAD) với detector xung ampe ñiện hóa (ñiện cực chuẩn Ag/AgCl ñiện cực làm việc là ñiện cực Au) chất rửa giải là dung dịch NaOH 0.1N, chất chuẩn là mannuronic axít

1.2.2.2 Phổ NMR của mannuronan

Phổ NMR của mannuronan ñược tác giả T.N Zvyagintseva mô tả trong công bố ở tạp chí Journal of Experimental Marine Biology and Ecology vào năm 2005 có các tín hiệu ñộ dịch chuyển hóa học của carbon trong bảng 1.3

n

Bảng 1.3 ñộ dịch chuyển hóa học trong phổ CNMR của mannuronan[3]

với phân bố các pic phổ như hình 1.1

Hình 1.1: phổ CNMR của mannuronan Tác giả Riki Shiroma năm 2007 trên tạp chí The Japanese society of applied glycoscience cũng ñã ñưa ra phổ alginate với các tín hiệu khối G (guluronic axít) và khối M (mannuronic axít) riêng biệt trong hình 1.2

Hình 1.2 phổ HNMR và CNMR của alginate gồm khối G và khối M

Từ các dữ liệu phổ nêu trên ta có thể xác ñịnh ñược sự có mặt và ñộ sạch của polymannuronic axít trong sản phẩm ñiều chế ñược dựa trên phổ NMR

1.3 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH MANNURONAN TỪ RONG NÂU

1.3.1 Phương pháp tách chiết mannuronan thông qua tách chiết alginate

I.3.1.1 Phương pháp chiết alginate

Cho ñến nay, trên thế giới cũng như trong nước ñã có rất nhiều bài viết công bố về phương pháp chiết alginat Hầu hết các phương pháp ñều dựa vào tính tan của alginate sodium và kết tủa của alginic axít ở pH<2 hoặc kết tủa

của muối calcium alginate Ví dụ như các phát minh của Clack & Green (1936), Lee Gloahec & Hecter (1938), Stanford (1884)… Ở Việt Nam Vào những năm 70, Bộ Thủy sản ñã nghiên cứu ban hành quy trình sản xuất Alginate bằng phương pháp formol, Trường ðại Học Thủy sản năm 1997 ñã nghiên cứu ñưa ra quy trình sản xuất Alginate bằng phương pháp CaCl2 trên các loài rong Nâu ở vùng biển Nha Trang và quy trình sản xuất Alginate bằng phương pháp xử lý Formol trên hai loại rong S.mcclurei và S.kjellmanianum vùng biển Nha Trang – Khánh Hòa

Trước hết, rong nâu phơi khô ñược chiết với HCl loãng ở pH=2 ñể loại

bỏ phần lớn fucoidan và laminaran tan trong dịch chiết Tiếp theo ñó, bã rong còn lại ñược rửa hết axít và nấu với dung dịch Na2CO3 3% trong 3 giờ ñể chuyển alginic axít có trong rong thành dạng alginate tan, phần lớn các kim loại ngoài kiềm kết hợp với carbonate tạo thành kết tủa ñược giữ lại trong bã rong Quá trình chiết ñược tiến hành 2 lần ñể tận thu alginate Dịch chiết ñược tách khỏi bã rong bằng máy ly tâm và chạy qua lọc rây phân tử ñến còn lại khoảng 1/10 thể tích ban ñầu, axít alginic ñược tách khỏi các thành phần khác bằng cách ñưa HCl vào dịch chiết ñến pH=1, kết tủa alginic acid ñược ly tâm tách rửa với HCl 0.1M, sau ñó hòa tan lại bằng dung dịch NaOH loãng thu alginate sodium

Hình 1.3 : Sơ ñồ chiết alginate từ rong nâu

chiết trong HCl 0.2M 24 giờ

Lọc rây phân tử 100 kDa ñến 1/10 thể tích ñầu ñầu

Alginate sodium

1.3.1.2 Thủy phân từng phần alginate thu mannuronan

Alginate (A) ñược thủy phân trong HCl 0.3M ở 1000C kéo dài 5 giờ Dung dịch thủy phân và kết tủa ñược ly tâm tách riêng ra, dịch thủy phân là mạch polymer hỗn hợp bao gồm guluronic axít và mannuronic axít hay còn gọi là khối MG Kết tủa ñược hòa tan một phần bằng dung dịch NaOH 0.1M ñến pH=3.5 Dung dịch và kết tủa ñược ly tâm tách thành 2 phần, dung dịch A1 chứa khối mannuronate sodium, phần kết tủa ñược hòa tan hoàn toàn trong NaOH 0.1M và dung dịch A2 sau này chứa khối guluronate sodium Uronan trong 2 dung dịch A1 và A2 ñược kết tủa bằng cách thêm vào một thể tích ethanol bằng với thể tích từng dung dịch, kết tủa ñược ly tâm, rửa vài lần với ethanol 50% (v/v), ñông khô, phun sấy, hoặc sấy trong chân không ñều cho thu ñược AlgG và algM (Phun sấy ở dạng huyền phù trong EtOH ñể nhiệt ñộ sấy thấp)

Hình 1.4 : Sơ ñồ tách chiết mannuronan từ alginate

1.3.2 Phương pháp tách chiết mannuronan không qua tách chiết alginate

Một phần mannuronan nằm ñộc lập bên ngoài khối alginate có thể chiết thẳng

từ rong nâu bằng phương pháp như sau:

Rong nâu yêu cầu cần phải sạch sẽ không mốc, không thối, không giòn gãy ðem rong ngâm rửa trong nước ngọt từ 1,5-2 giờ cho sạch tạp chất muối còn lại Rong sau khi ñã ngâm rửa sạch ở trên cho vào ngâm trong dung dịch

Hòa tan kết tủa bằng NaOH 0.1N ñến

Kết tủa với EtOH nồng ñộ 50% (v/v), lọc rửa, làm khô

Mannuronate Na

rắn

Guluronate Na rắn