Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu phương pháp tách, chiết và định lượng các chất chống oxy hóa trong một số loại rau, củ, quả

Mục tiêu nghiên cứu luận án là nghiên cứu phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector DAD (HPLC-DAD) để xác định đồng thời các anthocyanin và anthocyanidin. Nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách, chiết các anthocyanin và anthocyanidin. Áp dụng phương pháp để nhận biết và định lượng các anthocyanin và anthocyanidin trong một số loại rau, củ, quả Việt Nam.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - VŨ THỊ TRANG NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP TÁCH, CHIẾT VÀ ĐỊNH LƢỢNG CÁC CHẤT CHỐNG OXY HÓA TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU, CỦ, QUẢ Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 9440112.03 DỰ THẢO TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2019 Cơng trình đƣợc hồn thành Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia – Bộ Y tế Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo PGS.TS Nguyễn Xuân Trung Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ Họp vào hồi .giờ, ngày .tháng .năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm thông tin - thư viện Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Tính cấp thiết, mục tiêu nội dung luận án “Stress oxy hóa” tượng xuất thể sinh vật có cân việc sản xuất gốc tự hoạt động chất chống oxy hóa Hiện tượng nguyên nhân nhiều bệnh nguy hiểm, có ung thư, bệnh tim mạch, bệnh suy giảm hệ thần kinh (Alzheimer, Parkinson) lão hóa sớm Các nhà khoa học tồn xã hội quan tâm đến tác hại gốc tự do, xu hướng tìm kiếm chất chống oxy hố góp phần q trình giảm stress oxy hóa tập trung nghiên cứu Các hợp chất polyphenol có mặt khắp nơi tự nhiên thường tìm thấy cấu trúc phức tạp Anthocyanin số nhiều hợp chất thuộc nhóm polyphenol flavonoid bật với vai trị tạo màu sắc đỏ tươi, xanh lam tím thực vật Một vai trò quan trọng phát gần hợp chất anthocyanin khả chống oxy hóa chúng Các thử nghiệm invivo, invitro cho thấy tác dụng tích cực anthocyanin việc phòng chống ung thư, bệnh tim mạch béo phì Mức tiêu thụ hàng ngày anthocyanin Mỹ trung bình 12,5mg/người/ngày, Châu Âu 20 mg/người/ngày cao số nước Phần Lan 82 mg/người/ngày Hàm lượng anthocyanin sử dụng số đánh giá chất lượng số sản phẩm Các lý thúc đẩy phát triển kỹ thuật phân tích để nhận biết định lượng anthocyanin sản phẩm tự nhiên, nghiên cứu tác dụng chúng thể Anthocyanin tìm thấy tự nhiên dạng aglycon (anthocyanidin) liên kết với gốc đường (glycosid) Các nhà khoa học dự đốn có khoảng 1000 loại anthocyanin có khoảng 600 anthocyanin phát nhận danh cấu trúc Mặc dù số lượng anthocyanin lớn chúng tạo thành 23 loại anthocyanidin tự nhiên, sáu loại anthocyanidin phổ biến bao gồm: cyanidin, delphinidin, pelargonidin, peonidin, petunidin malvidin Các aglycon glycosid có hoạt tính sinh học khác nhau, đó, biết thành phần anthocyanin thực vật cung cấp thông tin độ bền, hoạt tính sinh học lợi ích chúng người Mỗi loài thực vật ẩn chứa thông tin cấu trúc độc đáo anthox – 0,9996 3249,2 Cyanidin y = 43952x – 1,0000 127,66 Petunidin y = 106479x – 1,0000 316,54 Pelargonidin y = 78235x – 1,0000 224,28 Peonidin y = 152603x – 1,0000 804,09 Malvidin y = 34717x – 1,0000 42,016 i i h n phát (M L) gi i h n định lư ng (M L) phương pháp Giới hạn phát (LOD) phương pháp 0,05 – 0,10µg/g (anthocyanidin) 0,1 µg/g (anthocyanin), giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp khoảng 0,165 – 0,33 µg/g (anthocyanidin) 0,33 µg/g (anthocyanin) Phương pháp sắc kí lỏng HPLC – PDA có độ nhạy độ chọn lọc cao, thời gian phân tích nhanh, cho phép định lượng đồng thời anthocyanidin anthocyanin mẫu Đánh giá độ chụm (độ lặp l i) RSD nằm khoảng 5,26% đến 6,45% Trong khoảng nồng độ từ 1ppm đến 10ppm, RSD cho phép AOAC 11% đến 7,3% Như vậy, độ lặp anthocyanin nằm giới hạn cho phép AOAC, cho thấy phương pháp có độ lặp lại tốt Độ lệch chuẩn lặp lại RSD(%) cyanidin dao động từ 2,63 – 5,38%, độ lệch chuẩn lặp lại RSD(%) peonidin từ 3,26 – 5,80% Delphinidin, pelargonidin, malvidin petunidin có RSD (%) 2,99%, 1,91% 5,18% 5,68% Hàm lượng malvidin petunidin khoảng từ 2mg/100g đến 4mg/100g RSD(%) cho phép tối đa từ 5,3% đến 7,3% Do đó, phương pháp có độ lặp lại phù hợp với yêu cầu AOAC phân tích anthocyanidin mẫu rau, củ, Đánh giá độ thu hồi Độ thu hồi trung bình anthocyanidin dao động khoảng từ 85,4% đến 106,5% Trong độ thu hồi đạt cao malvidin mẫu khoai, nhỏ với cyanidin mẫu mận Theo qui đinh AOAC, khoảng nồng độ 0,2ppm đến 4ppm, độ thu hồi AOAC cho phép từ 80,0% đến 110,0% Như vậy, độ thu hồi anthocyanidin nằm khoảng cho phép AOAC, cho thấy phương pháp có độ cao Ứng dụng phân tích mẫu thực tế Qua phân tích 31 loại mẫu lấy ngẫu nhiên thị trường cho thấy: hàm lượng tổng anthocyanidin rau, củ, khoảng 3-268 mg/100g Tổng hàm lượng anthocyanidin dâu tây 13,58mg/100g cao kết nghiên cứu Gisele A.B [17] công bố 7,33mg/100g Trong mẫu cà 19 chua đen, vỏ nho đen phát petunidin với hàm lượng cao vỏ nho đen 22,21mg/100g Peonidin phát nho tím, vỏ nho đen Malvidin có hàm lượng cao vỏ nho đen lên tới 191,22mg/100g Trong vỏ nho đen tìm thấy anthocyanidin phổ biến là: delphinidin, cyanidin, petunidin, peonidin malvinidin Tổng hàm lượng anthocyanidin vỏ nho đen khoảng 268,59mg/100g Hai mẫu rau cải sâm cà chua đỏ khơng phát anthocyanidin Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa anthocyanin, anthocyanidin số mẫu rau, củ, Khảo sát điều kiện tối ưu phản ứng anthocyanin/anthocyanidin DPPH Khi tăng nồng độ DPPH lên 400M nồng độ cyanidin-3-glucoside 10M có phụ thuộc tuyến tính % ức chế DPPH vào nồng độ cyanidin-3-glucoside, nồng độ cyanidin-3-glucoside tăng % ức chế tăng, phù hợp với nguyên lý phương pháp Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng khoảng 10 - 60 phút cho thấy: từ 10 – 25 phút, độ hấp thụ quang có giảm nhanh, khoảng thời gian phản ứng xảy ra, từ 25 – 35 phút độ hấp thụ quang có thay đổi khơng đáng kể, sau 35 phút, độ hấp thụ quang giảm theo thời gian Do đó, thời gian phản ứng chọn từ 25 – 35 phút Xác định ho t tính chống oxy hóa số anthocyanin anthocyanidin Trong số aglycon thử, delphinidin có hoạt tính cao cyanidin Monoglucoside cyanidin (cyanidin-3-glucoside) có hoạt tính tương tự aglycon (cyanidin) Điều cho thấy gốc đường khơng ảnh hưởng đến hoạt tính cyanidin cyanidin-3-glucoside Cyandin-3-glucoside có hoạt tính cao pelargonidin-3,5-glucoside So với vitamin C, delphinidin, cyanidin cyanidin-3-glucoside có hoạt tính cao chút Pelargonidin3,5-diglucoside có hoạt tính thấp vitamin C Đánh giá ho t tính chống oxy hóa số mẫu thực ph m Do sắc tố nằm chủ yếu phần vỏ nên mẫu vỏ (vỏ nho đen, vỏ măng cụt) có hàm lượng anthocyanidin tương đối cao hoạt tính mạnh Các mẫu nguyên quả, (mận, mai, bắp cải tím) chứa hàm lượng anthocyanidin thấp hoạt tính thấp Điều mẫu chứa lượng nước tương đối lớn Vỏ nho đen chứa đầy đủ sáu thành phần anthocyanidin Đáng ý vỏ măng cụt thể hoạt tính chống oxy hóa cao chứa thành phần cyanidin Loại phổ biến miền Nam Việt nam Đây sở để khai thác, phát triển nguồn nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức chống lão hóa KẾT LUẬN Trên sở kết thực nghiệm nghiên cứu phương pháp tách, chiết xác định chất chống oxy hóa số loại rau, củ, phương pháp sắc ký, thu kết sau: 1) Tối ƣu hóa đƣợc điều kiện sắc ký lỏng hiệu cao với detector DAD (HPLC-DAD) sắc ký lỏng siêu hiệu với detector khối phổ (UPLC20 MS/MS) để tách, nhận biết định lƣợng đồng thời anthocyanin anthocyanidin: - Điều kiện HPLC-DAD tối ưu hóa phương pháp mặt mục tiêu sử dụng mơ hình bậc hai tâm xoay bao gồm: detector DAD bước sóng phát 520 nm, cột tách C18 (250mm ì 4,6mm ì 5àm) v tin ct tng ứng, pha động kênh B acetonitril kênh A acid formic 10% theo chương trình gradient bắt đầu với 10% ACN, tốc độ dòng 0,8 ml/phút - Điều kiện UPLC-MS/MS bao gồm: Cột C18 (100 mm x 4,6 mm; 2,5 µm) tiền cột tương ứng Pha động kênh A acid formic 0,05%, kênh B ACN với chương trình rửa giải gradient Tốc độ dịng: 0,4 mL/phút Thể tích tiêm mẫu: µL 2) Tối ƣu hóa đƣợc quy trình xử lý mẫu để tách, chiết anthocyanin anthocyanidin mẫu rau, củ, - Điều kiện chiết anthocyanin: dung môi MeOH, nhiệt độ 100 oC, thời gian: 30 phút, tỉ lệ dung môi : mẫu (100:1, v/w) - Điều kiện thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin dịch chiết anthocyanin: dung môi thủy phân HCl 2,4M MeOH, nhiệt độ 90 oC, thời gian 60 phút - Quy trình chiết thủy phân anthocyanidin trực tiếp từ mẫu phương pháp mặt mục tiêu sử dụng mơ hình bậc hai tâm xoay Điều kiện tối ưu bao gồm: nhiệt độ 900C, thời gian 99 phút, nồng độ acid HCl 2,17M MeOH Hiệu suất thủy phân trung bình 91,5 – 106,7% 3) Đánh giá kết phƣơng pháp phân tích thơng qua: khoảng tuyến tính từ 0,1 – 10µg/mL, giới hạn phát (MDL) (0,05 – 0,10µg/g), giới hạn định lượng (MQL) (0,17 – 0,33µg/g), độ lệch chuẩn tương đối (1,91 – 5,80%), hiệu suất thu hồi từ 85,4% – 106,5% 4) Áp dụng quy trình phân tích định lƣợng anthocyanidin phổ biến 31 đối tượng mẫu thực thu hàm lượng từ 2,90 – 268,59mg/100g 5) Bƣớc đầu đánh giá hoạt tính chống oxy hóa số anthocyanin anthocyanidin theo phương pháp khử gốc tự DPPH thu trật tự hoạt tính chất sau: delphinidin > cyandin, cyanidin-3-glucoside > pelargonidin-3,5-diglucoside Cyanidin, cyanidin-3-glucoside delphinidin có hoạt tính cao chút so với chất đối chứng dương vitamin C 21 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN [1] Lê Việt Ngân, Vũ Thị Trang, Lê Thị Hồng Hảo, Nguyễn Xuân Trung, Lê Đình Chi (2016), Xây dựng quy trình định lượng đồng thời anthocyanidin số loại rau, củ, kỹ thuật HPLC, Tạp chí Dược học, số 484, trang 26-30 [2] Vũ Thị Trang, Lê Thị Hồng Hảo, Nguyễn Xuân Trung, Tăng Thị Phương (2016), Xác định đồng thời anthocyanidin số loại rau, củ, phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS, Tạp chí Khoa học Đại học quốc gia hà nội, tập 32, số 4, trang 305-309 [3] Vũ Thị Trang, Chu Thị Thanh, Lê Thị Hồng Hảo, Nguyễn Xuân Trung (2018), Tối ưu hóa điều kiện thủy phân anthocyanin đỗ đen Việt nam sử dụng phương pháp mặt mục tiêu, Tạp chí phân tích Hóa lý sinh học, T23, số 2, trang 42-48 [4] Vũ Thị Trang, Lê Thị Hồng Hảo, Nguyễn Đức Hảo, Nguyễn Hoài Thu, Lê Hoàng Đức, Nguyễn Xn Trung (2018), Xác định tính chống oxy hóa số anthocyanin anthocyanidin phương pháp đo quang sử dụng phản ứng với 2,2’-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), Tạp chí phân tích hóa, lý sinh học, tập 23, số 5, trang 33-38 [5] Chu Thị Thanh, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Nguyễn Thị Hoàng Lan, Vũ Thị Trang, Lê Thị Thúy (2018), Nghiên cứu trình chiết rung siêu âm chất màu thực phẩm anthocyanin từ đỗ đen, Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn, tháng 12/2018, trang 83-88 [6] Vu Thi Trang, Le Hoang Duc, Nguyen Thi Hoai Thu, Le Thi Hong Hao, Nguyen Xuan Trung, Multiseparation of anthocyanins and anthocyanidins by high performance liquid chromatography combined with response surface methodology, Health risk analysis, xác nhận đăng số 03/19 ngày 17/7/2019 22 ... kết thực nghiệm nghiên cứu phương pháp tách, chiết xác định chất chống oxy hóa số loại rau, củ, phương pháp sắc ký, thu kết sau: 1) Tối ƣu hóa đƣợc điều kiện sắc ký lỏng hiệu cao với detector DAD... kiếm chất chống oxy hố góp phần q trình giảm stress oxy hóa tập trung nghiên cứu Các hợp chất polyphenol có mặt khắp nơi tự nhiên thường tìm thấy cấu trúc phức tạp Anthocyanin số nhiều hợp chất. .. cyanidin Loại phổ biến miền Nam Việt nam Đây sở để khai thác, phát triển nguồn nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức chống lão hóa KẾT LUẬN Trên sở kết thực nghiệm nghiên cứu phương pháp tách, chiết