Thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin trong dược liệu và ứng dụng khảo sát hàm lượng hoạt chất theo thời gian thu hái

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI VĂN SƠN THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG OXOSTEPHANIN TRONG DƯỢC LIỆU VÀ ỨNG DỤNG KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG HOẠT CHẤT THEO THỜI GIAN THU HÁI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2022 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI VĂN SƠN Mã sinh viên: 1701493 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG OXOSTEPHANIN TRONG DƯỢC LIỆU VÀ ỨNG DỤNG KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG HOẠT CHẤT THEO THỜI GIAN THU HÁI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Thuận ThS Trần Thị Thu Hiền Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa Dược, Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2022 LỜI CẢM ƠN Trước trình bày nội dung thuộc đề tài nghiên cứu mình, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến người đồng hành, giúp đỡ suốt trình nghiên cứu khoa học trường Đại học Dược Hà Nội Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến giảng viên hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Thị Thuận – giảng viên Bộ mơn Hóa Dược trường Đại học Dược Hà Nội ThS Trần Thị Thu Hiền – Học viện Y Dược học cổ truyền Việt Nam tận tình bảo hướng dẫn, động viên tơi q trình nghiên cứu, giúp tơi hồn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn đến giảng viên, kỹ thuật viên Bộ mơn Hóa Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Cuối cùng, xin dành lời cảm ơn chân thành cho gia đình, bạn bè ln ủng hộ động viên suốt năm tháng học tập nghiên cứu mái trường Đặc biệt, xin cảm ơn anh Dương Tiến Anh, chị Đinh Thị Lý, chị Trần Thị Huyền Trang, bạn Phạm Thị Thu Trang, bạn Nguyễn Bình Minh, em Lã Hải Long, em Phạm Thúy Hà, em Phạm Quỳnh Mai đồng hành, chia sẻ buồn vui giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu mơn Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Bùi Văn Sơn MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan củ dòm 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Thành phần hóa học .3 1.1.3 Oxostephanin 1.1.4 Tác dụng sinh học S.dielsiana Y.C.Wu oxostephanin .4 1.1.4.1 Tác dụng sinh học S.dielsiana 1.1.4 Các phương pháp định lượng oxostephanin 1.2 Vài nét thẩm định phương pháp phân tích 1.2.1 Độ phù hợp hệ thống 1.2.2 Độ đặc hiệu 1.2.3 Độ 1.2.4 Độ xác 1.2.5 Khoảng tuyến tính 1.2.6 Khoảng xác định 1.2.7 Giới hạn định lượng giới hạn phát CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Nguyên liệu, thiết bị đối tượng nghiên cứu 11 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 11 2.1.2 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung mơi 11 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ 11 2.2 Nội dung nghiên cứu 11 2.2.1 Khảo sát trình xử lý mẫu 11 2.2.2 Khảo sát lại phương pháp phân tích 11 2.2.3 Thẩm định lại phương pháp phân tích .12 2.2.4 Ứng dụng 12 2.3 Phương pháp nghiên cứu: 12 2.3.1 Xử lý mẫu 12 2.3.2 Lựa chọn phương pháp phân tích .13 2.3.3 Thẩm định quy trình phân tích 13 2.3.4 Ứng dụng thực tế: .14 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 15 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 16 3.1 Khảo sát trình xử lý mẫu 16 3.1.1 Khảo sát số lần chiết 16 3.1.2 Khảo sát lượng dung môi chiết 16 3.1.3 Khảo sát thời gian chiết 17 3.2 Khảo sát lại phương pháp phân tích 18 3.2.1 Lựa chọn pha động .18 3.2.2 Khảo sát lại tỷ lệ pha động 19 3.2.3 Khảo sát bước sóng phát 19 3.3 Thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin HPLC 20 3.3.1 Độ phù hợp hệ thống 20 3.3.2 Độ đặc hiệu 21 3.3.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 22 3.3.4 Độ 23 3.3.5 Độ xác (độ lặp lại độ xác trung gian) 25 3.3.6 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 27 3.4 Kết luận phương pháp định lượng oxostephanin dược liệu 28 3.5 Ứng dụng thực tế .29 3.6 Bàn luận .30 3.6.1 Về phương pháp xử lý mẫu 30 3.6.2 Về lựa chọn xác định phương pháp .30 3.6.3 Về thẩm định phương pháp phân tích 31 3.6.4 Về ứng dụng thực tế 31 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 33 4.1 Kết luận .33 4.2 Đề xuất .33 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên đầy đủ ACN Acetonitril AOAC Hiệp hội nhà phân tích hóa học thức CHCL3 Cloroform C8 Octylsilan C18 Octadecylsilan EtOH Ethanol H358 Tế bào ung thư biểu mô cuống phổi phế nang người HeLa Tế bào ung thư cổ tử cung Hep-2 Tế bào ung thư gan H2 O Nước HPLC Sắc ký lỏng hiệu HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu cao IC50 Nồng độ ức chế tối đa 50% LD50 Liều gây chết 50% LOD Giới hạn phát LOQ Giới hạn định lượng LU Tế bào ung thư phổi MDA Tế bào biểu mô phân lập từ mô vú bệnh nhân ung thư MeOH Methanol OVCAR-8 Tế bào ung thư buồng trứng OXO Oxostephanin R Hệ số tương quan RD Tế bào ung thư vân RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation) S Diện tích pic S dielsiana Stephania dielsiana TEA Triethylamin TB Trung bình DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1: Các phương pháp định lượng oxostephanin Bảng 1: Kết hàm lượng oxostephanin với số lần chiết khác nhau…… 16 Bảng 2: Kết hàm lượng oxostephanin với lượng dung môi khác 17 Bảng 3: Kết khảo sát thời gian chiết 17 Bảng 4: Kết độ phù hợp hệ thống 21 Bảng 5: Kết khảo sát độ tuyến tính 22 Bảng Kết độ thu hồi OXO 24 Bảng 7: Kết độ lặp lại ngày phân tích 25 Bảng 8: Kết độ xác trung gian khác người phân tích 26 Bảng 9: Kết thẩm định độ lặp lại LOD .27 Bảng 10: Kết độ lặp lại LOQ 27 Bảng 11: Kết định lượng Oxostephanin mẫu dược liệu 29 DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1:Cấu trúc hóa học oxostephanin Hình 3.1: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn OXO chạy pha động gradient ACN đệm phosphat – TEA pH = 3,0 18 Hình 3.2: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn OXO chạy MeOH: acid formic 0,1% (35:65) (v/v) 18 Hình 3.3: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn OXO chạy MeOH: acid formic 0,1% (v/v) (40:60) 19 Hình 3.4: Sắc ký đồ dung dịch thử OXO chạy MeOH: acid formic 0,1% (v/v) (40:60) .19 Hình 3.5: Phổ hấp thụ tử ngoại oxostephanin 20 Hình 3.6: Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu 21 Hình 3.7: Chồng phổ UV OXO dung dịch thử so với dung dịch chuẩn 22 Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính diện tích pic nồng độ OXO 23 Hình 3.9: Đồ thị biểu thị hàm lượng oxostephanin theo thời gian thu hái 29 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo báo cáo tổ chức y tế giới (WHO) ung thư nguyên nhân gây tử vong thứ hai giới với gần 9,8 triệu ca tử vong (tức 1/6 số ca tử vong) [16] Trong tình trạng kháng thuốc nguyên nhân dẫn đến thất bại điều trị, việc tìm liệu pháp điều trị trở nên cấp thiết việc điều trị ung thư Trong oxostephanin hoạt chất phân lập củ lồi Stephania dielsiana Y.C.Wu (củ dịm) có khả kháng mạnh dịng tế bào ung thư như: HeLa (tế bào ung thư cổ tử cung), HepG2, OVCAR-8 (tế bào ung thư buồng trứng), MDA H358 (tế bào ung thư biểu mô cuống phổi phế nang người) với giá trị IC50 nằm khoảng từ 1,66 đến 4,35 µM [1, 14] Do với nghiên cứu oxostephanin ngày thu hút nhiều quan tâm nhà khoa học Hiện mức độ quan tâm oxostephanin tập trung tác dụng chúng lâm sàng mà chưa có nhiều nghiên cứu định lượng oxostephanin dược liệu Đáp ứng nhu cầu dựa số nghiên cứu khả quan số tác giả tiến hành Stephania dielsiana Y.C.Wu, với điều kiện phịng thí nghiệm, đề tài: “Thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin dược liệu ứng dụng khảo sát hàm lượng hoạt chất theo thời gian thu hái” thực với mục tiêu sau: Thẩm định lại phương pháp định lượng oxostephanin dược liệu phương pháp HPLC Ứng dụng khảo sát hàm lượng oxostephanin dược liệu thu hái thời điểm khác năm PHỤ LỤC 3: SẮC KÝ ĐỒ CÁC MẪU QC PHỤ LỤC 3: SẮC KÝ ĐỒ CÁC MẪU ĐỘ LẶP LẠI SẮC KÝ ĐỒ MẪU LOD VÀ LOQ ... tài: ? ?Thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin dược liệu ứng dụng khảo sát hàm lượng hoạt chất theo thời gian thu hái? ?? thực với mục tiêu sau: Thẩm định lại phương pháp định lượng oxostephanin. .. TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI VĂN SƠN Mã sinh viên: 1701493 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG OXOSTEPHANIN TRONG DƯỢC LIỆU VÀ ỨNG DỤNG KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG HOẠT CHẤT THEO THỜI GIAN THU HÁI KHÓA LUẬN... trung gian) - Giới hạn phát (LOD) - Giới hạn định lượng (LOQ) 2.2.4 Ứng dụng Ứng dụng phương pháp thẩm định lại để xác định hàm lượng oxostephanin dược liệu thu hái thời điểm khác năm 2.3 Phương pháp