ựược lọc tinh và cơ dịch bằng 1/10 thể tắch ban ựầu bằng máy siêu lọc với kắch thước màng lọc 30 kDa. Polymannuronic ựược kết tủa bằng acid acetic tại các nồng ựộ theo sơ ựồ thực nghiệm, tiếp tục chiết theo sơ ựồ chiết thu sản phẩm. Xác ựịnh khối lượng sản phẩm. Chọn nồng ựộ acid acetic thắch hợp.
2.2.1.4. Khảo sát nồng ựộ ethanol ựể tách mannuronan ra khỏi dung dịch: dịch:
10 20 30 40 50 60 70
Hình 2.5: Khảo sát nồng ựộ ethanol ựể tách mannuronan ra khỏi dung dịch.
Dịch chiết trung tắnh
Kết tủa polymannuronic và rửa bằng EtOH, 80% ọ96%(v/v). (Xác ựịnh nồng ựộ EtOH ựể tách mannuronan ra khỏi dung dịch)
Sấy khơ trong chân khơng
polymannuronic
Xác ựịnh khối lượng sản phẩm
Chọn nồng ựộ EtOH ựể kết tủa polymannuronic tối ưu
Cách tiến hành:
Kết tủa ựược trung hịa bằng NaOH 0,1M, sau ựĩ ựược ly tâm thu dịch lọc. Polymannuronic axit ựược kết tủa bằng EtOH nồng ựộ ựược bố trắ theo sơ ựồ thực nghiệm. sản phẩm thu ựược, sẽ ựược phân tắch khối lượng mannuronan trong sản phẩm. Chọn nồng ựộ EtOH thắch hợp.
2.2.2. Chuẩn bị mẫu cho phân tắch thành phần mannuronan:
Mẫu mannuronan khơ (0.2 mg) cho vào ống nghiệm cĩ nút vặn, thêm vào 0.3 ml TFA 2M, thuỷ phân trong 6h ở 120oC. Cho bay hơi ựến khơ trong chân khơng ở nhiệt ựộ 40oC (2 ngày) rồi thêm 0.5 ml MeOH, cho bay hơi, lặp lại hai lần, quá trình này nhằm ựuổi hết TFA ra khỏi mẫu tránh gây hư thiết bị phân tắch. sản phẩm tạo thành là các ựơn phân tử của mannuronan.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1: Khảo sát nhiệt ựộ chiết ựể sản phẩm khơng chứa alginate
Cơng ựoạn nấu chiết cĩ vaì trị hết sức quan trọng trong tồn bộ quy trình sản xuất polymanuronic. Cơng ựoạn này ảnh hưởng rất lớn tới chất lượng và lượng sản phẩm chiết ựược. Nhiều tác giả ựã tập trung nghiên cứu cơng ựoạn này ựã cho thấy các yếu tố ảnh hưởng tới cơng ựoạn nấu chiết là: Thời gian, nhiệt ựộ. Các yếu tố này ựều cĩ ảnh hưởng hai mặt ựối với chất lượng và sản lượng sản phẩm chiết ựược. Việc tăng hay giảm quá mức giá tri các yếu tố này dẫn tới việc giảm chất lượng và sản lượng của sản phẩm chiết. Việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới cơng ựoạn này khơng những xác ựịnh ựược ựiều kiện ựể cĩ sản phẩm ựạt yêu cầu về chất lượng cũng như số lượng mà cị cĩ vai trị lượng hĩa sự ảnh hưởng của các yếu tố này. đề tài tập trung nghiên cứu các thơng số tối ưu là nhiệt ựộ, thời gian.
Trong quá trình nấu chiết polymanuronic cần nhiệt ựộ cao hợp lý nhằm phá vỡ nhanh tế bào cây rong trong thời gian hợp lý, thực hiện nhanh chiết polymanuronic nhất. Nhiệt ựộ và thời gian nấu chiết cĩ tác dụng làm tăng sản lượng chiết. Khi nhiệt ựộ tăng làm tốc ựộ phản ứng hĩa học diễn ra nhanh hơn. đồng thời nhiệt ựộ tăng, thời gian nấu chiết kéo dài sẽ làm tăng hiệu suất chiết. điều này tạo ựiều kiện cho dung mơi chiết khuyết tán vào sâu trong tế bào cây rong, làm tăng cường phản ứng hĩa học, mặt khác tế bào cây rong bị phá hủy sẽ tạo ựiều kiện cho phân tử polymanuronic khuyết tán ra ngồi dịch chiết, kết quả sẽ làm tăng hiệu suất chiết.
Theo bố trắ thực nhgiệm, tơi ựã bố trắ nấu chiết tại các nhiệt ựộ khác nhau trong phạm vi 40, 50, 60, 70, 80, 90, 1000C tách kết tủa ở pH=2, cho ra sản phẩm M1, M2, M3, Ầ M7. Phân tắch thành phần mannuronic trong sản phẩm: M1ẦM4 chỉ cĩ mannuronic axắt, từ M5..M7 cĩ mặt axắt guluronic.
Kết quả phân tắch ựịnh tắnh uronic axắt của sản phẩm theo nhiệt ựộ chiết (Theo kết quả phân tắch của Viện NC&UDCN Nha Trang):
Nhiệt ựộ chiết (0C) 40 50 60 70 80 90 100 uronic axắt M M M M M,G M,G M,G
Qua mỗi bố trắ thắ nghiệm tại mỗi nhiệt ựộ khác nhau. đã thấy rõ ựược sự liên hệ giữa việc tăng nhiệt ựộ nấu chiết và hiệu suất chiết. Khi nấu chiết tại nhiệt ựộ 40-70ồC thì chỉ cĩ mannuronic axắt, nhưng khi nấu tại nhiệt ựộ 80-100ồC thì cĩ mặt axắt guluronic. Từ kết quả thực nghiệm cho thấy khi nấu chiết tại nhệt ựộ nhỏ hơn 70ồC thì cĩ mặt mannuronic axit trong sản phẩm thu ựược, nhưng khi tăng nhiệt ựộ cao hơn 70 ồC thì cĩ mặt axắt guluronic trong sản phẩm thu ựược sau khi chiết. Kết luận chiết ở 700C là tối ưu ựể cĩ mannuronan sạch, khối lượng sản phẩm chiết khơng bị ảnh hưởng bởi yếu tố nhiệt ựộ, mà lại giảm ựược chi phắ sản xuất.
3.2 Khảo sát thời gian chiết:
Kết quả khối lượng sản phẩm thu ựược từ 1kg rong nâu theo thời gian chiết ở nhiệt ựộ 700C (phân tắch hàm lượng mannuronan trong dịch chiết thơ):
Thời gian
chiết (giờ) 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Khối lượng
sản phẩm 1.02g 1.3g 1.5g 1.5g 1.52g 1.52g 1.53g 1.53g 1.53g
Qua kết quả thu ựược từ khối lượng sản phẩm thu ựược sau khi sấy khơ, nhận thấy thời gian chiết chỉ cần 4giờ, khối lượng sản phẩm tăng lên khơng ựáng kể ở thời gian sau ựĩ.
3.2 Khảo sát nồng ựộ ethanol ựể tách mannuronan ra khỏi dung dịch:
Dịch lọc sau khi ựược trung hịa, ly tâm ựể loại bỏ kết tủa thu dịch lọc, polymannuronic nằm lại trong dịch lọc sẽ ựược kết tủa bằng etannol. để kết tủa triệt ựể polymannuronic trong dịch lọc, mà vẫn giảm ựược chi phắ sản xuất chắnh vì thế tơi ựã khảo sát nồng ựộ cồn ựể kết tủa polymannuronic ở 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70% (v/v) cồn, sau khi thu sản phẩm, mẫu sản phẩm ựã ựược phân tắch xác ựịnh sự cĩ mặt polymannuronic. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả xác ựịnh khối lượng sản phẩm kết tủa từ 1kg rong theo nồng ựộ cồn:
EtOH (%v/v) 20 30 40 50 60 70
uronic axắt 1.1g 1.42g 1.45 1.46 1.47 1.47
Qua kết quả phân tắch mẫu ựã xác ựịnh sau 40% cồn khơng cịn mannuronan kết tủa.
3.3. Khảo sát nồng ựộ axắt acetic ựể tách mannuronan ra khỏi dịch chiết nước ban ựầu.
Dịch chiết ựược lọc tinh và cơ dịch nhằm loại bỏ tạp chất, và các polysaccharide khác cĩ trong dịch chiết. để kết tủa polymannuronic cĩ trong dịch chiết bằng dung dịch axit acetic tơi ựã khảo sát nồng ựộ axit acetic ựể kết tủa mannuronan ở 20, 30, 40, 50, 60% (v/v). Thơng qua ựánh giá cảm quan trực tiếp quá trình kết tủa mannuronan của dịch lọc tại mỗi nồng ựộ khảo sát, tơi ựã xác ựịnh sau 40% khơng cĩ xuất hiện thêm kết tủa.
Nồng ựộ acetic axắt
(%) 20 30 40 50 60
Kết tủa + + + - -
Mẫu Mannuronan ựược ựem làm sạch và ựo phổ NMR, sau ựĩ so sánh với phổ ựã ựược cơng bố ta cĩ kết quả như sau:
Phổ CNMR của sản phẩm:
So với phổ chuẩn ựã ựược cơng bố rõ ràng sản phẩm thu ựược chắnh là polymannuronic axắt, tuy nhiên do chưa hồn tồn tinh sạch nên trên phổ vẫn cịn các tắn hiệu của vết guluronan xen lẫn
Phổ HNMR của sản phẩm cũng cho thấy sự trùng khớp với phổ chuẩn của mannuronan, ựồng thời cũng cho thấy sản phẩm vẫn cịn lượng rất nhỏ guluronan:
Vậy ta hồn tồn ựủ căn cứ kết luận sản phẩm chắnh là mannuronan.
3.5. đỀ XUẤT QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT POLYMANURONIC TỪ RONG NÂU. RONG NÂU.
Sau quá trình nghiên cứu các thơng số tối ưu của các cơng ựoạn xử lý sơ bộ và nấu chiết tơi xin ựề xuất quy trình tách chiết polymanuronic từ rong nâu.
Hình 3.1: sơ ựồ quy trình chiết polymannuronic axit từ rong nâu.
Rong nâu chọn, rửa, ngâm bằng nước ngọt.
Ngâm EtOH tỉ lệ dung dịch v/w=1:1, thời gian 24 giờ, ngâm ở nhiệt ựộ bình thường
Nấu chiết trong nước thường, tỉ lệ dung dịch w/v=1:10 nấu ở nhiệt ựộ 70ồC và thời gian chiết 4 giờ
Lọc thu dịch chiết
Lọc tinh và cơ dịch chiết cịn 1/10 thể tắch ban ựầu bằng máy siêu lọc kắch thước màng lọc 30 kDa , tốc ựộ bơm nhu ựộng 100 v/ph
Kết tủa polymannuronic bằng acid acetic
Ly tâm thu kết tủa, tốc ựộ 2600v/ ph, thời gian 1giờ
Trung hịa kết tủa bằng dung dịch NaOH 0,1M.
Ly tâm thu dịch lọc
Polymannuronic ựược kết tủa bằng EtOH nồng ựộ 40%(v/v), ựược rửa bằng EtOH 80% ọ96%(v/v).
sấy khơ trong chân khơng
Thuyết minh quy trình:
* Nguyên liệu: Rong nâu, nguyên liệu yêu cầu cần phải sạch sẽ khơng mốc, khơng thối, khơng giịn gãy. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Ngâm rửa: đem rong ngâm rửa trong nước ngọt từ 1,5-2 giờ cho sạch tạp chất muối cịn lại.
* Xử lý ngâm EtOH: Rong ựã ngâm rửa sạch ở trên cho vào ngâm trong dung dịch EtOH vĩi tỉ lệ dung dịch w/v=1/10 lần lượng rong khơ. thời gian ngâm từ 24 giờ, ngâm ở nhiệt ựộ thường luơn luơn nhấn chìm rong trong dung dịch EtOH sau khi kết thúc ựem rửa sạch, ựể ráo và cắt nhỏ.
* Nấu chiết:
Rong ựược cho vào nồi nấu, cho lượng nước gấp 10-12 lần lượng rong khơ vào nồi nấu. Nấu trong mơi trường trung tắnh, cĩ thể thử pH bằng thiết bị ựo pH hoặc giấy quỳ. Nâng nhiệt ựộ nấu lên ựến 50ồC, khuấy ựều rong trong nồi nấu và kiểm tra pH của mơi trường nấu trong suốt quá trình nấu. Giữ nhiệt ựộ nồi nấu bằng 70ồC, thời gian nấu 4 giờ là ựược.
* lọc tách tạp chất:
Trong ựiều kiện phịng thắ nghiệm, lên tơi ựã sử dụng phương pháp lọc thơ ựơn giản là lọc qua giấy lọc, thời gian lọc tuỳ thuộc vào lượng dịch chiết. Lọc thơ nhằm loại bỏ cặn rong cịn laị sau khi nấu, hoặc các chất màu, keo rongẦ
* Lọc tinh và cơ ựặc dịch chiết:
Dịch lọc sau khi ựã lọc thơ, sẽ ựược tiếp tục lọc tinh và cơ dịch qua máy lọc, dịch lọc ựược lọc và cơ bằng máy siêu lọc với màng siêu lọc cĩ kắch thước 30kDa, tốc ựộ nhu ựộng của máy 100 v/ph. Các phân tử trong dịch lọc cĩ khối lượng phân tử bé hơn 30kDa sẽ ựược loại bỏ ra ngồi, cơ dịch tới khi bằng 1/10 thể tắch ban ựầu
* Kết tủa Ờ ly tâm thu kết tủa:
Polymanuronic trong dịch chiết ựược kết tủa bằng dung dịch axit acetic 40%(v/v), kết tủa sẽ lắng xuống. Thu kết tủa bằng máy ly tâm, tốc ựộ máy 2600v/ph, ở nhiệt ựộ lạnh, trong thời gian 1h.
*Trung hịa kết tủa:
Sau khi ly tâm thu ựược kết tủa ựể loại bỏ hết acid HCI cĩ trong kết tủa, thuận lợi cho qúa trình tách nước và thu kết tủa, vì thế cần trung hồ kết tủa bằng dung dịch NaOH 0,1M cho tới khi trung tắnh.
* Ly tâm:
Dịch trung tắnh sẽ ựược ly tâm ựể loại bỏ kết tủa nằm trong dịch lọc, thu dịch lọc chứa polymanuronic axit.
* Kết tủa và tách nước:
Dịch sau khi ựược trung tắnh, sẽ phải tách polymanuronic ra bằng phương pháp alcol. Khi cho alcol với nồng ựộ cao với tỉ lệ cao so với dịch trung tắnh sẽ xảy ra hiện tượng polymannuronic kết tủa do alcol cạnh tranh dung mơi nước của polymanuronic. Sau ựĩ tách kết tủa ra khỏi dung dịch, phần nước thải chứa ựựng các tạp chất cần loại ra.
Cách tiến hành:
Dịch trung tắnh sẽ ựược kết tủa bằng etanol 40% (v/v) cồn tuyệt ựối và ựược rửa bằng etanol 80ọ96% (v/v) ựể tách triệt ựể nước và muối NaCI ra khỏi kết tủa.
* Sấy chân khơng:
để thu ựược kết tủa và sản phẩm dạng bột, sấy khơ trong chân khơng, xay nhỏ trong cối mã não ta thu ựược sản phẩm polymannuronic
* sản phẩm:
Sản phẩm là bột màu kem tan tốt trong nước, dimetylsulfoxit, khơng tan trong alcohol, aceton, hexan, dietyl ete.
KẾT LUẬN
* Thơng qua quá trình nghiên cứu, ựề tài tập trung nghiên cứu chủ yếu 4 nội dung chắnh mà ựề tài thực hiện:
- Nghiên cứu các phương pháp tách chiết polymannuronic axắt ựã ựược cơng bố, từ ựĩ rút ra phương pháp chiết polymannuronic axắt, phù hợp với ựiều kiện sử dụng làm thực phẩm chức năng.
- Tách chiết polymannuronic axắt từ rong nâu ựộc lập với tách chiết alginic axắt.
- Xác ựịnh sự cĩ mặt và hàm lượng của polymannuronic axắt trong sản phẩm.
- Phân tắch các chỉ tiêu hĩa, lý, sinh và tìm tài liệu ựã cơng bố polymannuronic axắt cĩ khả năng ựiều trị bệnh ung thư ựể chứng minh sản phẩm ựủ ựiều kiện làm thực phẩm chức năng.
Trong nội dung ựề tài thực hiện ựã tìm hiểu một số phương pháp tách chiết polymannuronic acid từ rong nâu như tách chiết mannuronan từ axit alginic, ựã tìm ra phương pháp mới chiết mannuronan trực tiếp từ rong nâu ựể phù hợp với mục ựắch sử dụng làm thực phẩm chức năng. Ngồi ra phát hiện polymannuronic tồn tại ựộc lập trong rong nâu và tách chiết trực tiếp ựược. trong quá trình thực nghiệm ựã xác ựịnh một số, thơng số tối ưu bao gồm : xác ựịnh nhiệt ựộ chiết tối ưu là 70ồC, thời gian chiết là 4 giờ, nồng ựộ cồn và axit acetic 40% ựể kết tủa mannuronan trong dịch chiết nhằm nâng cao hiệu suất chiết và giảm ựược chi phắ sản xuất và ựề xuất quy trình chiết mannuronan hịa chỉnh.
Trong khuơn khổ của luận văn về chế biến thực phẩm tơi khơng trực tiếp tiến hành tiến hành xác ựịnh sự cĩ mặt của mannuronan trong sản phẩm. Dựa (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
vào kết quả do Viện nghiên cứu và ứng dụng cơng nghệ Nha Trang xét nghiệm sản phẩm của tơi. Tìm hiểu các cơng bố về hoạt tắnh sinh học ựặc biệt là khả năng ựiều trị bệnh ung thư ựể chứng minh sản phẩm ựủ ựiều kiện làm thực phẩm chức năng.
đỀ XUẤT Ý KIẾN
*Trong quy trình tách chiết polymanuronic từ rong nâu, thì cơng ựoạn xử lý rong ngâm rong dung dịch formol, tác hại của formol làm ơ nhiễm mơi trường và gây ựộc cho người lao ựộng, vì vậy khi xử lý ngâm formol, cần ngâm trong thiết bị kắn, và cần trang bị ựồ bảo hộ cho người lao ựộng. Phải xử lý nước thải trước khi thải ra nguồn nước thải thành phố.
*đối với phương pháp alcol ựể kết tủa polymanuronic axit, ưu ựiểm của phương pháp này nhanh, tách trực tiếp ựược sản phẩm polymanuronic nhưng phải sử dụng lượng alcol lớn chắnh vì thế phương pháp này chỉ áp dụng cho việc nghiên cứu, khĩ khăn trong việc sản xuất lớn. Cĩ thể thay thế phương pháp acid hĩa, dùng acid vơ cơ bổ sung vào dịch lọc ựể kết tủa polymanuronic ra khỏi tạp chất hịa tan.
*Cĩ thể kết hợp giữa việc tách chiết polymanuronic, ta cĩ thể sử dụng bã rong ựĩ ựể chiết fucoidan, laminarin, alginat, alginic bằng những phương pháp khác nhau. đem lại hiệu qủa tận dụng ựươc bã rong ựể làm thức ăn gia súc.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Trần Thị Luyến, đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngơ đăng Nghĩa, (2001), chế biến rong biển, nhà xuất bản nơng nghiệp.
2. Nguyễn Duy Nhất, Bùi Minh Lý (năm), Nghiên cứu thành phần hố học và hoạt tắnh sinh học của polysacarit từ một số lồi rong nâu ở tỉnh Khánh Hồ,
ựề tài khoa học, viện nghiên cứu và ứng dụng cơng nghệ Nha Trang.
3. T.N. Zvyagintseva (2005), ỘJournal of Experimental Marine Biology and EcologyỢ.
4. Riki Shiroma (2007), ỢThe Japanese society of applied glycoscienceỢ.
5. Marit Otterlei (1993), ỘInfection and immunityỢ.
6.Goril Berntzen (1999), ỘClinical and diagnostic laboratory immunology Ộ.