Nghiên cứu kỹ thuật tách chiết silumarin từ hạt kế sữa và axit amin từ đậu tương làm nguyên liệu cho thực phẩm chức năng tăng cường chức năng gan

Một trong những hoạt tính triển vọng của silymarin là chống ung thư, vì vậy có thể sử dụng silymarin kết hợp với phương pháp hóa trị liệu.. Protein đậu tương được sử dụng rộng rãi như mộ

NGUYỄN THỊ QUY

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT SILUMARIN TỪ HẠT KẾ SỮA

VÀ AXIT AMIN TỪ ĐẬU TƯƠNG LÀM NGUYÊN LIỆU CHO THỰC

PHẨM CHỨC NĂNG TĂNG CƯỜNG CHỨC NĂNG GAN

Ngành: Sinh học

2015

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh, bên cạnh sự

nỗ lực cố gắng của bản thân còn có sự hướng dẫn nhiệt tình của quý Thầy Cô, cũng như sự động viên ủng hộ của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian học tập nghiên cứu và thực hiện luận văn thạc sĩ

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Việt Cường- Phòng Công nghệ sinh học - Viện Hóa sinh Biển, người đã hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này

Đồng thời, tôi xin được gửi lời cảm ơn tớ

các anh chị em trong phòng Công nghệ sinh học - Viện Hóa sinh Biển đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành đề tài luận văn Xin chân thành biết ơn đến toàn thể quý Thầy Cô trong bộ môn Vi sinh vật học đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu và cho đến khi thực hiện đề tài luận văn

Cuối cùng xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã không ngừng động viên, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn

Hà Nội, Ngày 21 tháng11năm 2014

Học viên

Nguyễn Thị Quy

MỤC LỤC

4

5

6

7

9

9

9

9

1.1.3 Đặc điể ủa flavonoid 10

1.1.4 Tác dụng sinh học của 14

1.1.4.1 Sơ lược về lịch sử sử dụng cây làm thuốc 14

1.1.4 ủa silymarin và ứng dụng 15

1.1.5 18

1.1.6 Những thành tựu trong nghiên cứu chế phẩm silymarin 18

20

1.2.1 Cây đậu tương 20

20

21

1.2.3.1 Thành phần Protein đậu tương 21

1.2.3.2 Tính chất của Protein đậu tương 21

ậu tương 23

26

2.1 Vật liệu 26

2.1.1 Nguyên liệu 26

2.1.2 Hoá chấ 26

2.2 Phương pháp 27

silymarin 27

2.2.2 Phương pháp Sắc ký HPLC 28

2.2.3 29

2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng axit amin tự do 29

2.2.5 29

2.2.5 29

2.2.5 30

2.2.5 30

2.2.5 31

2.2.6 32

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ 33

33

ết xuất silymarin 33

3.1.2 Kết sắc kí HPLC 37

ả 39

ận axit amin tự tương 42

3.4 Một số đặc tính sinh học của chế phẩm chứa sylimarin 47

48

49

3.4.3 52

3.4.3.1 Tác dụng trên lưu lượng mật 53

3.4.3.2 Tác dụng trên hàm lượng cắn khô và bilirubin trong dịch mật 54

56

4.1 Kết luận 56

56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

ADN Acid Deoxyribo Nucleic

-Bảng 3.1 Kết khảo sát dung môi để chiết xuất silymarin 34

Bảng 3.2 Kết chiết xuất silymarin bằng các phương pháp khác nhau 35

axit amin 39

3.4: ảnh hưởng của thời gian thủy phân bột đậu tương bằng protease lên 44

3 44

3.6: Hàm lượng axit amin tự ch thủ 45

3.7: Hàm lượng axit amin tự ủ 46

Bảng 3.8: Liều uống chế phẩm silymarin trong các lô chuột thực nghiệm thử độc tính cấp 48

Bảng 3.9: Tác dụng của chế phẩm silymarin trên hoạt độ enzym ALT huyết thanh chuột thực nghiệm 51

Bảng 3.10: Tác dụng của chế phẩm silymarin trên bilirubin huyết thanh chuột thực nghiệm 52

Bảng 3.11: Lưu lượng mật ở các lô chuột thí nghiệm 53

Bảng 3.12: Hàm lượng cắn khô trong dịch mật của chuột thực nghiệm 54

Bảng 3.13: Hàm lượng bilirubin trong dịch mật của chuột thực nghiệm 54

10

37

3.2: Sắc ký đồ mẫu silymarinthu đƣợc sau khi tách chiế 38

3.3: Sắc ký đồ mẫu silybin chuẩn 38

3.4: 40

3.5 44

V dùng thuốc có nguồn gốc từ thảo dược hoặc phối hợp sử dụng thuốc đông dược và tân dược hiện cộng đồng Do các loại thuốc thảo dược và sự kết hợp đông –tây y không những chữa được bệnh

mà ít có tác dụng phụ Vì vậy, thuốc có nguồn gố , đặc biệt là những cây thuốc đã được dùng rộng rãi theo kinh nghiệm cổ truyền để chữa bệnh được các nhà khoa học trên thế giới và Việt Nam quan tâm nghiên cứu

và nguy hiểm nhất là siêu vi B và C Khoảng 2 tỷ người trên thế giới đã hoặc đang nhiễm virus viêm gan B

Có khoảng 3% dân số thế giới nhiễm virus viêm gan C và trên 170 triệu người

n

[62], [63]

Đã có những bằng chứng cho thấy silymarin có tác dụng chữa bệnh xơ gan do rượu Một trong những hoạt tính triển vọng của silymarin là chống ung thư, vì vậy có thể sử dụng silymarin kết hợp với phương pháp hóa trị liệu Silymarin hoạt động như chất chống oxy hóa, bảo

vệ mô và loại bỏ chất gây độc cho gan [5], [10]

Protein đậu tương được sử dụng rộng rãi như một thành phần chức năng trong rất nhiều loại thực phẩm chế biến bởi khả năng tạo gel và các tính chất hóa lý, cảm quan và dinh dưỡng cao Việc thủy phân protein các hạt họ đậu cải thiện các đặc tính dinh dưỡng của chúng như làm chậm quá trình hư hỏng, cải thiện cấu trúc, tăng hoặc giảm độ hòa tan, ngăn cản những tương tác không mong muốn, loại mùi khó chịu và các thành phần độc [27], [57]

, để có thể sản xuất một số loại sản phẩm tăng cường chức năng gan cũng như hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến gan tại Việt Nam, thay thế các sản phẩm nhập ngoại, là cơ sở để chúng tôi thực hiện đề tài:

.”

1 Nghiên cứu quy trình tách chiết Sylimarin từ hạt kế sữa

2 Nghiên cứu quy trình thuỷ phân thu nhậ

CHƯƠNG 1 1.1

1.1.1

(Sylibum marianum (L.) Gaernt)

thẳng và phân nhánh Lá xanh, không có lá kèm, bóng láng, thường có nhiều đốm trắng dọc theo các gân, mép có răng dạng gai, gai màu vàng và rất nhọn; các lá phía trên và ở giữa ôm lấy thân; các lá ở dưới rất to, có phiến chia thuỳ

và có cuống Cụm hoa đầu đơn độc, rộng 3-10cm Lá bắc ngoài và giữa có một phần phụ hình tam giác màu lục thu lại thành một gai to, ở gốc có 4-6 gai nhỏ, ngắn hơn, ở mỗi bên Hoa màu tím, hiếm gặp màu trắng, hơi giống nhau, đều có 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 1 ô với 2 lá noãn và 2 vòi nhuỵ phình ở gốc

bế hình bầu dục thuôn, dài 7-8mm, màu đen bóng có vân vàng nhiều hoặc ít, tùy thuộc vào giống S.marianum [15], [24], [26] Ra hoa vào tháng 5 đến tháng 8 của năm thứ hai

Cây có nguồn gốc ở Địa Trung Hải và mọc hoang dại ở nhiều nơi trên thế giới như miền Nam và Trung Âu, Bắc Phi, Trung Đông, Ấn Độ, Trung Quốc, Bắc và Nam Mỹ [26]

1.1.2

Dịch chiết của hạt cây chứa khoảng 70-80% silymarin flavonolignans và khoảng 20-30% thành phần không xác định, chủ yếu là các hợp chất polyphenol oxy hóa và trùng hợp Thành phần chính của tổ hợp silymarin là silybin, đồng nghĩa với silybinin Ngoài silybin là hỗn hợp của 2 diastereomers A và B với tỉ lệ khoảng 1:1, một lượng lớn các flavonolygnants

khác có trong silymarin, đó là iosilybin, dehydrosilybin, silychristin, silydanin, và một số flavonoids, chủ yếu là taxifolin (hình 1.1) [28]

Những tài liệu dược lý, y học và quang hóa, tranh luận rất nhiều về hiệu của silymarin/silybin Nguyên nhân chính của sự không thống nhất và không chắc chắn về hiệu của silymarin/silybin là thành phần khác nhau của chế phẩm silymarin được sử dụng trong phần lớn nghiên cứu Các dẫn chứng tài liệu cho thấy tỉ lệ của từng chất trong các loại silymarin khác nhau

phụ thuộc rất lớn vào nguồn S.marianum (giống cây và điều kiện trồng) và

quá trình tách chiết, xử lý Gần đây, silymarin/silybin nhận được sự quan tâm

do các hoạt tính có lợi của nó không liên quan trực tiếp đến hiệu bảo vệ gan và chống oxy hóa [28], [39], [42], [53], [54]

silymarin

Flavonoid là một trong những nhóm chất polyphenol thường gặp trong thực vật, là những sắc tố phần lớn có màu vàng, tan trong nước nên có tên là

“flavonoid” Tuy nhiên, một số sắc tố có màu xanh, đỏ, tím hoặc không màu nhưng cũng được sắp xếp vào nhóm flavonoid vì nó cũng có đặc điểm về cấu trúc giống nhau [2], [10]

 Tính chất lý học

Flavonoid là một hợp chất phenol có một số tính chất sau:

Flavonoid tinh khiết có dạng tinh thể hoặc dạng vô định hình, có nhiệt độ nóng chảy nhất định, có màu vàng như flavon, chalcon hoặc không màu như isoflavonoid, catechin, hay có màu sắc thay đổi tùy thuộc pH môi trường như antoxyanidin (ở môi trường acidcó màu đỏ, ở môi trường kiềm có màu xanh) Các aglycon (nhân phenol) của flavonoid hòa tan trong dung môi hữu cơ như ether, cồn etylic, aceton và hầu như không tan trong nước

dạng liên kết (glycosid) hòa tan được trong nước nhưng không tan trong ether và chloroform Flavonoid có hương thơm và vị đắng

Có khả năng hấp thụ tia tử ngoại nhờ hai vòng benzen A và B Có hai dải hấp

thụ cực đại: Dải I ở bước sóng 320-380nm, dải II ở bước sóng 220-280nm

 Tính chất hóa học

Do đặc điểm cấu tạo của flavonoid có các nhóm hydroxyl phenolic, nhóm carbonyl, vòng thơm benzen nên chúng có khả năng phản ứng rất lớn Tính chất hóa học của flavonoid còn phụ thuộc vào vị trí nhóm OH, hệ nối đôi liên hợp và các nhóm thế

phản ứng hóa học đặc trưng của flavonoid:

*Phản ứng của nhóm hydroxyl (OH)

Tính oxy hóa: Dưới tác dụng của các chất oxy hóa ( nitrat bạc, ferricyanit, persulfate, các gốc tự do…) hay enzym polyphenoloxydase ,flavonoid sẽ bị oxy hóa thành các gốc phenoxy ArO* (gốc tự do bền) Các gốc này có thể dimer hóa hay phản ứng oxy hóa và các phản ứng làm bẻ gãy vòng

Tính axit: Các flavonoid có tính acidyếu nên dễ dàng phản ứng với dung dịch kiềm để tạo thành muối tan trong nước khi đun nóng, cho màu vàng cam hay đỏ thắm Antoxyan trong dung dịch amoniac hay natri cacbonate cho màu xanh hoặc tím

Sự tạo thành liên kết hydro: Khi không có trở ngại gì về mặt cấu trúc không gian liên kết hydro được hình thành giữa các nhóm OH trong cùng phân tử hoặc giữa các phân tử với nhau

Đặc điểm này làm ảnh hưởng đến tính chất hóa học như: Điểm sôi, điểm nóng chảy, độ hòa tan, đặc tính phổ tử ngoại, cấu trúc phân tử và khả năng phản ứng

Phản ứng ether hóa: Ether thiên nhiên của phenol thường gặp trong thực vật, đặc biệt là những ether etylic Những nhóm OH phenol dễ dàng tham gia phản ứng ether hóa

*Phản ứng của nhóm cacbonyl

Phản ứng này đặc trưng cho các chất flavonoid có nhóm cacbonyl ở vị trí C4 và có nối đôi ở giữa C2 và C3, điển hình là flanonol, flavon không có OH

ở C3 nên phản ứng khó hơn và cho màu nhạt nên đôi khi khó phát hiện

Phản ứng tạo phức với kim loại: Khả năng tạo chelat với kim loại nặng

là một trong những tính chất quan trọng của flavonoid, liên quan đến hoạt tính sinh học của chúng Các phức màu xanh đen với molipden và sắt Các flavonoid có nhóm cacbonyl ở vị trí C4 và hydroxyl ở vị trí C3-C5 dễ tạo phức với kim loại, đặc biệt với nhôm cho màu vàng hoặc vàng xanh, phát quang ở bước sóng 365nm

 Tác dụ của flavonoid

Flavonoid có nhiều ứng dụng quan trọng trong y học Những flavonoid

có hoạt tính sinh học gọi là bioflavonoid phụ thuộc vào cấu trúc của chúng Khi đưa flavonoid vào cơ thể sẽ sinh ra các gốc tự do bền vững hơn các gốc

tự do hình thành trong quá trình viêm nhiễm bệnh lý Chúng có khả năng giải tỏa các điện tử tự do trên mạch vòng của nhân thơm và hệ thống nối đôi liên hợp, làm triệt tiêu các nguồn gốc tự do sinh ra trong quá trình viêm nhiễm, do tính bền vững về mặ a học nên chúng không tham gia vào dây chuyền phản ứng oxy hóa [23]

Flavonoid còn có tác dụng bảo vệ cho adrenalin hoạt động một cách bình thường do chúng có khả năng tạo phức với Cu2+

,có tác dụng là chất xúc tác cho phản ứng oxy hóa adrenalin, leucholamin [23]

Flavonoid ảnh hưởng đến hệ thống nội tiết, làm tăng sức đề kháng của

cơ thể đối với tác dụng gây độc bất kể loại nào, tăng chức năng thải độc của gan, tăng trao đổi glucose, tăng tổng hợp glucogene, ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp prothrombin của gan [25]

Các chất thuộc nhóm flavonoid có tác dụng làm giảm sức thấm của mạch mao như sinh tố P, một trong những chất quan trọng đó là rutin Rutin có tác dụng chữa các bệnh xuất huyết mao n, làm cho thành mạch được bền vững, chữa cao huyết áp tăng, cường công hiệu vitamin khỏi bị oxy hóa Nó còn ảnh hưởng tốt đến chuyển hóa canxi và còn chống được tia phóng xạ

Về mặt dược lý, các bioflavonoid có tác dụng chống viêm, giãn cơ trơn, chống dị ứng, ức chế sự phát triển của ung thư, làm giảm các tổn thương xuất huyết nhỏ trong bệnh đái đường

Về mặt miễn dịch học, nhiều bioflavonoid có tác dụng kích thích lympho bào, sản xuất interferol, ức chế hiện tượng thoát bọng chứa các amin hoạt mạch từ tế bào mastocyte, ức chế sụ nhân lên của virus

Việc nghiên cứu và ứng dụng các chế phẩm flavonoid trên thế giới ngày càng phát triển Ở Việt Nam đã có những nghiên cứu mà kết được ứng dụng vào thực tiễn, tạ số thuốc chữa bệnh có hiệu

1.1.4 Tác dụng sinh học của

1.1.4.1 Sơ lược về lịch sử sử dụng cây làm thuốc

Cao chiết đã được sử dụng làm thuốc từ thời Hy Lạp cổ đại Dioscorides, một nhà dược thảo học Hy Lạp thế kỷ thứ I đã viết rằng,

pha thành trà uống có thể chữa được rắn độc cắn Pliney The Elder (năm 23-79 sau CN) ghi lại rằng, nước ép cây trộn với mật ong làm thuốc lợi mật rất tốt Đây có thể là ghi nhận đầu tiên về tác dụng của cây liên quan đến gan [20]

Nhiều thế kỷ sau, đã trở thành một cây thuốc quen thuộc ở Đức

và đã được nhắc đến trong một bản thảo tiếng Đức cổ “Physica” của Hildegarde viết năm 1150 và được xuất bản vào năm 1533 Tác giả đã viết về công dụng của rễ, toàn cây và lá Một số tác giả khác như Otto Brunfels (1534), Hieronimus Bock (1595), Jacobus Theodorus (1664) và Adam Lonicerus (1679) đã giới thiệu dùng để trị bệnh về gan [24] Vào cuối thế kỷ XVIII, Culpepper (1787) cho rằng là thứ thuốc tuyệt vời làm thông tắc gan, lách và vì vậy dùng rất tốt để chữa bệnh vàng da Giữa những năm 1772 đến 1850, một chế phẩm có tên gọi là “Cồn thuốc của Rademacher”, cao chiết cồn hạt đã được dùng phổ biến để trị các rối loạn về gan, lách Tương tự, cuối thế kỷ XIX đầu thế kỷ XX, một trường đào tạo các nhà dược thảo học tên là “Eclectic” đã dùng cao chiết để điều trị sung huyết gan, giãn tĩnh mạch, rối loạn kinh nguyệt và các bất thường của

lá lách và thận [20], [21]

Năm 1958, các nhà khoa học người Đức bắt đầu chú ý nghiên cứu cây Các nghiên cứu về tác dụng bảo vệ gan, thành phần hoạt chất và cơ chế tác dụng đã được thực hiện Thành phần hoạt chất trong đã được xác định là silymarin, một hỗn hợp các flavonolignan mà các chất chính là silybin, silychristin và silydianin Từ năm 1969, chế phẩm silymarin chiết

xuất từ bắt đầu được sử dụng rộng rãi trong điều trị ở Đức và sau

đó là trên khắp thế giới Vào những năm 1990, doanh số bán chế phẩm này ở Đức lên tới trên 180 triệu đôla/năm 31% số bệnh nhân mắc bệnh về gan ở

Mỹ đã dùng dược thảo mà chủ yếu là dùng [20]

1.1.4.2 của silymarin và ứng dụng

Hạt củ (Sylibum marianum (L.) Gaernt.) đã được sử dụng

hơn 2000 năm nay để chữa các bệnh rối loạn gan và túi mật như viêm gan, xơ gan, vàng da và bảo vệ gan khỏi tác động có hại của hóa chất và các chất độc ngoài môi trường như nọc rắn, côn trùng, ngộ độc nấm hoặc rượu [43], [52]

 Hiệu bảo vệ gan:

s Đã có những bằng chứng cho thấy silymarin có tác dụng chữa bệnh xơ gan do rượu Cơ chế của quá trình này do silymarin phục hồi alanin transaminase, aspartate transaminase và bilirubin huyết thanh về mức bình thường, giảm γ-glutamyl transpeptidase, làm tăng đáng kể vận tốc biến đổi của lymphhoccytes và giảm rõ ràng lượng tế bào CD8+

Có thể thấy cơ chế này dựa trên hoạt tính điều biến miễn dịch của silymarin Silymarin cũng được dùng để chữa xơ gan do biến chứng tiểu đường và viêm gan C mãn tính cùng với các chất khác, gan nhiễm mỡ và đều cho kết khả quan [18]

Các cơ chế bảo vệ chống bệnh gan

- Chống oxy hóa: Khả năng chố của silymarin đã được chứng minh bởi nhiều thử nghiệm Các kết nhận được chỉ ra rằng silymarin là dạng chống oxy hóa bẻ chuỗi (chain-breaking) và loại gốc tự do Cơ chế phân

tử của hoạt tính chống oxy hóa có thể suy ra từ cấu trúc các sản phẩm nhị trùng nhận được từ các phản ứng của silybin

- Ức chế tạo NO: Trường hợp gan nhiễm mỡ, NO dư thừa sẽ cảm ứng sự thiếu oxy máu và tăng độc tính đối với mononuclear macrophage hoạt tính Silymarin ức chế tế bào Kupffer của gan tạo NO và giảm tương tác với O2

- Giảm hoạt tính của phospholipase và bảo vệ màng gan bằng cách chống lại thromboxane A, làm cho mạch máu chắc, ngăn phản ứng độc của tế bào T và tăng lượng cAMP nội bào

- Bảo vệ màng tế bào: Thông qua phản ứng chống oxy hóa lipid Silymarin điều chỉnh tính lưu động của microsome gan và màng mitochondria

và giữ cho tính lưu động của màng ở trạng thái chuyển động hoàn hảo

- Màng tế bào ổn định và trao đổi năng lượng thuận tiện: Sử dụng silymarin làm giảm đáng kể chức năng dị thường và quá trình xơ hóa

- Đẩy mạnh hepatic cytothesis: Silymarin có thể kết hợp với estradiol receptor và hoạt hóa nó trong tế bào gan và kết là tăng hoạt tính của RNA polymerase nội bào

- Cytokine và chức năng miễn dịch: Hiệu kháng viêm và kháng xơ hóa là do silymarin hoạt hóa tế bào hình sao (stellate) của gan và ổn định tế bào lớn (mast) Silymarin có thể làm giảm lượng và hoạt tính cytotoxic lymphocytes và các tế bào natural killer trong máu, điều đó cho thấy silymarin có chức năng điều biến miễn dịch

 Chất bảo vệ và chống ung thư : Silymarin/silybin ức chế tác dụng gây

ung thư của nhiều loại hóa chất Một số khối u phụ thuộc hormone steroid cũng bị ức chế Những kết nhận được khi thử nghiệm với các dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt, buồng trứng…cho rằng điều chỉnh xuống thụ thể phát triển màng trong mạch (vascular endothelial growth recptor 4 – VEGR)

và điều chỉnh lên angiopoietin-2 là các cơ chế tiềm năng chịu trách nhiệm cho hoạt tính của các chất này [28], [45], [58]

Chất hỗ trợ trong liệu pháp chống ung thư: Một trong những hoạt tính triển vọng của silybin là chống ung thư, vì vậy có thế sử dụng kết hợp với phương pháp hóa trị liệu Silybin hoạt động như chất chống oxy hóa và bảo

vệ mô và loại bỏ chất độc cho gan

 Bảo vệ thần kinh: Nhờ hoạt tính chống oxy hóa của chất này

Silymarin ức chế sựu tạo thành các chất trung gian gây viêm như TFN-α và nitric oxide và như vậy làm giảm hư tổn cho thần kinh dopaminergic Dịch chiết bảo vệ thần kinh cá ngựa khỏi stress oxy hóa [40]

 Chữa và phòng chống các vấn đề dạ dày – ruột: Hiệu phòng bệnh đái đường của silymarin là do hoạt tính chống oxy hóa hoặc tăng nồng

độ glutathione tuyến tụy và huyết tương, hoặc cả hai Silymarin là một khả năng mới trong chữa bệnh đái tháo đường do khả năng tăng lượng insulin và phục hồi chức năng tuyến tụy Silymarin cũng hoạt động trong ruột kết như các chất ức chế đặc biệt β-glucoronidase vi khuẩn đường ruột [40]

 Phòng và chữa bệnh thận: Cũng như đối với các bộ phận khác,

silymarin bảo vệ thận và chống oxy hóa

 Phòng và chữa bệnh tim phổi: Silymarin tăng hiệu chữa bệnh tim phổi khi được sử dụng kết hợp với các loại thuốc Hiệu chữa bệnh của silymarin có thể giải thích bởi tác dụng sinh học khác nhau của chất này, đó là

ổn định màng tế bào, chống viêm và ức chế con đường arachiddonic axit Hiệu phòng bệnh của silymarin có lẽ do cơ chế gián tiếp làm giảm đáp ứng đến histamine và kết là đáp ứng quá mẫn tức thì [40]

 Bảo vệ da: Cả silymarin và silybin đều biểu hiện hi bảo vệ chống ung thư do ánh sáng gây ra trên mô hình chuột Cơ chế bảo vệ da được chứng minh do khả năng làm giảm và ức chế tác dụng có hại của tia UV mặt trời như stress oxy hóa, viêm, đáp ứng miễn dịch và tổn thương DNA cũng như cảm ứng chương trình tự chết của tế bào [40]

 Tương tác với các thụ thể hormone steroid: Cả silymarin và silybin

đều biể hoạt tính antiandrogenic trong dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt, chúng ức chế sựu tăng sinh của tế bào ung thư phụ thuộc thụ thể homonee steroid

 Điều biến sự vận chuyển thuốc: Một cơ chế nhờn thuốc quan trọng là

do protein màng, ví dụ Pgp trong tế bào động vật Silymarin ức chế protein này và làm tăng sự tích tụ của thuốc trong tế bào

 Điều khiển chương trình tự chết tế bào (apoptosis) và quá trình viêm:

Silybin biết cảm ứng chương trình tự chết của tế bào màng trong (endothelial) và ức chế hình thành mạch, là quá trình quan trọng để khối u phát triển và di căn Slymarin có hoạt tính chống xơ vữa động mạch, có thể là

do bảo vệ lipoprotein vận chuyển cholesterol khỏi bị oxy hóa

flavonolignans gồm silyibin, silychristin, silydianin

, aceton, methanol, clorofom [35], [55]

cs

cetat ethyl

t [61]

1.1.6 Những thành tựu trong nghiên cứu chế phẩm silymarin

Các chế phẩm chủ yếu của slymarin là viên nang, viên rắn, thể nhũ,

muối silymarin tiêm, hoặc phối trộn với một số tá dƣợc khác nhƣ PEG, PVP, cyclodextrin…[18]

Thuốc viên: Nature,

Nature,s Bounty

, N- Acetyl Cy

công ty US Trusted LLC

, Inc

Bột: Hepatis B Xintai của ng Châu, Trung Quốc có 5 loại thảo dƣợc khác nhau: Dành dành (gardenia); rễ hòe (sophora), cành cây amoorcom, rễ danshen và silymarin

Thuốc tiêm: Muối meglumine là sản phẩm của phản ứng giữa silibin và

amine hữu cơ Muối Di-meta-succinate sodium có chức năng bảo vệ gan mạnh

Các sản phẩm khác: Hỗn hợp β-cyclodextrin (β-CD) với silymarin; chất

phân bố silymarin rắn là PVP hoặc PEG; liposome; hỗn hợp phospholipid; các hạt nano

Có nhiều phương pháp để chiết silymarin như ép lạnh và chiết bằng các loại dung môi khác nhau [51] hoặc sử dụng n-hexane [52] Mỗi phương pháp

có những lợi thế và những bất lợi khác nhau

1.2

1.2.1 Cây đậu tương

Glycine max

Trên thế giới có trên

1000 loại đậu tương với nhiều đặc điểm khác nhau, hạt đậu tương có kích thước nhỏ nhất như hạt đậu Hà lan (pea) cho tới lớn nhất giống trái anh đào (cherry), hạt đậu có nhiều màu sắc như đỏ, vàng, xanh, nâu và màu đen [12], [13]

tương : Tryptophan 1,1%, Leucine 8,4%, Isoleucine 5,8%, Valine 5,8%, Threo

ác acidbéo không thay thế có giá trị dinh dưỡng cao,

acidkhông no: linoleic 52-65%, oleic 25-36%, linolenoic 2-3%, acidno: Acidpanmitic 6-8%, stearic 3-5%, arachidoic 0,1-1,0% [7], [12], [13] Carbohydrates trong thường có : Các polysaccharide không hòa tan như hemicellulose, các peptin, cellulose và các oligosaccharide như hexose, rafinose, stachiose, verbascose Tro của rất giàu sắt và kẽm [7], [12], [13]

1.2.3 Protein

1.2.3.1 Thành phần Protein đậu tương

Sau khi hoà tan trong nước hoặc ở pH kiềm nhẹ, các protein của tương có thể tách ra nhiều đoạn bằng các sắc kí thấm gel, bằng điện di, bằng siên li tâm… Với phương pháp siên li tâm người ta tách ra được 4 đoạn ứng với các hệ số sa lắng S20,W là 2S, 7S, 11S, 15

Trong thực phẩm có PH trung tính và không gia nhiệt thì các globulin 7S

và 11S nói chung đều ở trạng thái hoạt động, không bị biến tính, phân tử ở dạng dime (7S) và oligome (11S) vì lực ion yếu Các xử lí nhiệt và thay đổ

1.2.3.2 Tính chất của Protein đậu tương

 Sự phân li và sự tập hợp của protein đậu tương

Khi đun nóng dung dịch -conglixinin loãng ở pH=7-8 và lực ion yếu, đến 1000

C thì các phân tử của chúng sẽ phân li thành các dưới đơn vị mà không kèm theo các hiện tượng tập hợp phân tử

Khi gia nhiệt đến 1000C dung dịch glixinin có nồng độ loãng(<1%P/V

) ), ở pH=7-7,6 và lực ion 0,2-0,4 thì các phân tử cũng phân li thành các dưới đơn vị và sau đó thì tập hợp lại

Khi đun nóng đến 800

C một dung dịch vừa chứa glixinin và conglixinin có nồng độ loãng (<1%P/V) ở PH =8 thì các phản ứng phân li và tập hợp sẽ xảy ra

- Sự tạo gel của protein đậu tương

Khi dung dịch protein có nồng độ đậm đặc (>5% P/V) được đun nóng ở PH gần trung tính thì sẽ gel Dung dịch đầu tiên qua một trạng thái lỏng có độ nhớt tăng cao, giai đoạn tiền gel Khi lực ion còn yếu thì trạng thái này sẽ xảy ra từ 700C là thời điểm mà -conglixinin được giãn mạch hoàn toàn Khi lực ion cao thì việc tăng độ nhớt chỉ xảy ra ở nhiệt độ cao hơn Việc tạo thành gel protein sẽ phụ thuộc vào cân bằng giữa liên kết protein – nước

và liên kết protein – protein

Độ cứng của gel protein đậu nành sẽ giảm cùng nồng độ NaCl và

Axit hoá dung dịch protein đến pH =5,5 hoặc thêm ion Ca2+sẽ làm đông tụ protein thành từng cục tương đối đàn hồi Nếu đun nóng các cục

đã thu được bằng kết tủa đẳng điện hoặc bằng canxi sẽ làm các chuỗi polypeptide bị giãn mạch và tạo nên một mạng lưới protein ba chiều có kết cấu của một gel thực thụ

 Một vài tính chất khác

Protein cực kỳ bền nhiệt, có thể chịu nhiệt đến 77oC Tuy nhiên ở nhiệt độ đó protein không thể tan trở lại Protein có thể bền nhiệt đến 100oC khi thêm vào các yếu tố làm tăng lực ion

Trong phần lớn các ứng dụng của , việc gia nhiệt thấp để vô hoạt các enzym là cần thiết.Tuy nhiên trong một vài ứng dụng, khi protein

gia nhiệt ở nhiệt độ thấ thêm vào các chất có chứa lipoxygenase hoạt động xảy ra sự oxy hóa Sự ôxy hóa này có thể gây ra

sự phá hủy màu sắc và vì thế sản phẩm Nó cũng có thể gây ra sự oxy hóa những nhóm sunfit tự do từ liên kết disunfua Cả 2 chức năng này đều quan trọng trong việc chuẩn bị bột nguyên liệu cho công nghiệp làm bánh

Protein hydrolysate ( PHs: hỗn hợp của oligopeptides, polypeptides

và axit amin tự do) được sử dụng để chữa các bệnh về trao đổi chất, các công thức cho chế độ ăn kiêng và cho trẻ em, người già và vận động viên [30] Quá trình thủy phân protein đậu tương tạo ra các peptides nhỏ ng minh đượ ng, các peptides ngắn hấp thụ trong đường ruột với tốc độ cao hơn so với các axit amin tự do Điều này cho thấy lợi thế của protein hydrolysate với cùng một lượng axit amin được sử dụng trong chế độ dinh dưỡng của bênh nhân sau mổ hoặc cho người có tuổ cũng được sử dụng trong dinh dưỡng thể thao và kiểm soát trọng lượng, trong chế độ ăn uống đặc biệt đối với các bệnh nhân mắc một số bệnh như pancreatitis, short bowel syndrome, bệnh Crohn’s và dị ứng thực phẩm Hoạt tính chống oxy hóa của protein đậu tương đã được báo cáo [33] Những báo cáo cũng cho thấy hàm lượng các axit amin quan trọng trong protein đậu tương đáp ứng yêu cầu dinh dưỡng của người trừ lysine và methionine [27] Thủy phân protein đậu tương

các phương pháp khác nhau đã nhận được nhiều peptides hoạt tính sinh học với các đặc tính chống tăng huyết áp, chống tăng cholesterol, chống béo phì, chống oxy hóa, chống khối u, điều biến miễn dịch và đối kháng vi sinh vật [22], [32], [36], [59], [60] Wang và cs (2008) đã xác định được 3 peptides trong protein hydrolysate đậu tương có hoạt tính ức chế topoisomerase II [57] Các peptides chống tăng huyết áp và ức chế enzyme angiotesin – converting (ACE) Enzyme này làm tăng huyết áp bằng cách biến đổi decapeptide angiotensin I thành octapeptide angiotensin II làm co mạch, dẫn đến huyết áp tăng Rất nhiều tài liệu chỉ ra rằng, protein đậu tương

có thể làm giảm nồng độ cholesterol máu ở người và động vật, nhưng cơ chế này được các tác giả đưa ra không thống nhất Một số nhà nghiên cứu cho rằng, hiệu giảm cholesterol là do các hợp chất iosflavones tự nhiên, một

số khác lại tin rằng do protein hấp thụ, nhưng cũng có thể do các peptides hoạt tính điều biến cholesterol homeostasis tại gan [60] Hiệu chống béo phì của protein và peptides đậu tương đã được Nakamori (2002) tổng quan [36] Một số nghiên cứu chúng minh peptides đậu tương ức chế thu nhận thức

ăn và làm sạch ruột bằng cách tiết ra cholecystokinin kích thích (CCK) Kết này cho rằng cơ chế hoạt động của peptides đậu tương là điều chỉnh thu nhận thức ăn bằng cách cảm ứng sự no thông qua việc hoạt hóa các thụ thể opioid và CCK trong ruột [38]

Hiện có khá nhiều nghiên cứu liên quan đến thủy phân protein đậu tương

để thu các peptides ngắn, chủ yếu s dụng phương pháp nhiệt để thủy phân bằng enzymes Các enzymes proteases thường được sử dụng bao gồm papain, alcalase, bromelain, pancreatin hoặc trypsin, trong đó papain được sử dụng bởi nhiều tác giả [30], [31], [37], [48] Trong quá trình thủy phân các peptides

có axit amin kỵ nước ở đầu N hoặc C được tạo ra và chúng làm cho hydrolysate có vị đắng Để giảm vị đắng, sử dụng aminopeptidase để tách các

gốc axit amin kỵ nước ở đầu N, nhưng như vậy sẽ làm tăng hàm lượng axit amin tự do Các phương pháp khác làm giảm vị đắng như hạn chế cơ chất protein, sử dụng các chất để giấu vị đắng, phân đoạn và loại các peptides đắng, polyme hóa, sử dụng các hợp chất bọc… nhưng chúng đều có vấn đề, bao gồm làm mất các chức năng quan trọng của peptides, sản lượng thấp, cần máy móc đặc hiệu và giá thành cao… Việc sử dụng các protease có tính đặc hiệu thấp để tách các gốc axit amin kỵ nước ở đầu N đã được nhiều tác giả nghiên cứu và áp dụng [47], [49], 50] Một số tác giả sử dụng kết hợp với các phương pháp khác để tăng hiệu thủy phân protein đậu tương bằng enzymes [17]

CHƯƠNG 2: V 2.1 Vật liệu

- Dung dịch dioxane, acetonitril 70%

- Ethanol 96%, ether dầu, ethanol 85%, methanol

- Diisopropyl ether, aceton

- Dung môi cloroform-aceton-acidformic

- Bình Soxhlet

- Silybin chuẩn do hãng SIGMA cung cấp

- Dung dịch A: 0.1% trinitrobenzenesulfonic acid(TNBS) trong nước

- Dung dịch B: 0.2M sodium phosphate buffer pH 8.2

Tất cả thiết bị thuộc phòng Công nghệ sinh học,

500C ở áp suất thường Cân khối lượng tủa và xác định hàm lượng flavonolignan toàn phần trong tủa

- Chiết ngâm trong dung môi: 30g bột ại dầu béo như trên được cho vào bình ngấm kiệt Đổ EtOH 85% ngập dược liệu (300ml), ngâm 48h ở nhiệt độ phòng Rút dịch chiết đồng thời bổ sung dung

môi mới, tiến hành chiết đến khi dịch chiết hết màu Tập hợp dịch chiết, thu hồi dung môi dưới áp suất thấp đến dịch đậm đặc, tủa flavonolignan và tiếp tục làm như trên Dịch đậm đặc thu được sấy ở 500C để thu bột silymarrin thô

- Chiết hồi lưu trên bếp cách thuỷ: 30g bột ại dầu béo như trên được chiết hồi lưu trên bếp cách thuỷ với 300ml EtOH 85% x 4 lần x 1 giờ Tập hợp dịch chiết, thu hồi dung môi dưới áp suất thấp đến dịch đậm đặc và tiếp tục làm như trên Dịch đậm đặc thu được sấy ở 500C để thu bột silymarrin thô

2.2.2 Phương pháp HPLC

Chuẩn bị m

200 mg mẫu có chứa silymarin được chiết trong 1ml dung dịch dioxane lắc 2000v/phút 10phút ly tâm 12000v/phút 10 phút thu dịch Dịch mẫu thu được được tủa trong nước theo tỷ lệ 1mẫu/5nước Ly tâm 12000v/phút 10 phút thu tủa, lấy tủa hòa lại trong acetonitril 70% lắc 2000v/phút 10phút ly tâm 12000v/phút 10 phút thu dịch Dịch này được đem phân tích HPLC

Mẫu chuẩn là mẫu silybin của hãng Sigma pha trong acetonitril 70% Với những điều kiện chạy HPLC như sau:

- Cột Symmentry C18 (250mm x 4,6mm x 5 m)

- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng

- Thể tích bơm mẫu: 10 l

- Pha động: Gradien như sau:

Thời gian (phút) A Nước B Acetonitril Tốc độ dòng (ml/phút)

1.6ml dung dịch C (HCl 0,1 M) So mầu dung dịch thu được ở bước s ng 340nm

- Mẫu đối chứng: 0.1ml H2O + 0.8ml B + 0.8ml A + 1.6ml C

- Mẫu chuẩn: 0.1ml D + 0.8ml B + 0.8ml A + 1.6ml C

- Tính nhóm amin tự do:

- N=OD340(mẫu) x F x1.5/OD340(chuẩn) - OD340(đối chứng) (mM)

2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng axit amin tự do

Hàm lượng axit amin tự do được xác định trên máy phân tích axit amin

tự động HP-Amino Quant Seriese II

2.2.5

2.2.5.1

c sau: silymarin 50%, Axit amin 2%, Glucose 48%