Nghiên cứu kỹ thuật tách chiết silymarin từ hạt kế sữa và axit amin từ đậu tương làm nguyên liệu cho thực phẩm chức năng tăng cường chức năng gan

Một trong những hoạt tính triển vọng của silymarin là chống ung thư, vì vậy có thể sử dụng silymarin kết hợp với phương pháp hóa trị liệu.. Protein đậu tương được sử dụng rộng rãi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ QUY

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT SILYMARIN TỪ HA ̣T KẾ SỮA VÀ AXIT AMIN TỪ ĐẬU TƯƠNG LÀM NGUYÊN LIỆU CHO THỰC PHẨM CHỨC NĂNG TĂNG CƯỜNG CHỨC NĂNG GAN

Ngành : Sinh học Chuyên ngành : Động vật học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS PHẠM VIỆT CƯỜNG

Hà nội 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh, bên cạnh sự

nỗ lực cố gắng của bản thân còn có sự hướng dẫn nhiệt tình của quý Thầy Cô, cũng như sự động viên ủng hộ của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian học tập nghiên cứu và thực hiện luận văn thạc sĩ

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Việt Cường- Phòng Công nghệ sinh học - Viện Hóa sinh Biển, người đã hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này

Đồng thời, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới TS Lê Thi ̣ Hồng Minh cùng các anh chị em trong phòng Công nghệ sinh học - Viện Hóa sinh Biển đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành đề tài luận văn Xin chân thành biết ơn đến toàn thể quý Thầy Cô trong bộ môn Vi sinh vật học đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu và cho đến khi thực hiện đề tài luận văn

Cuối cùng xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã không ngừng động viên, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn

Hà Nội, Ngày 21 tháng11năm 2014

Học viên

Nguyễn Thị Quy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 5

DANH MỤC CÁC BẢNG 6

DANH MỤC HÌNH ẢNH 7

MỞ ĐẦU 8

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 10

1.1 Tổng quan về silymarin 10

1.1.1 Cây kế sữa 10

1.1.2 Thành phần hóa ho ̣c của quả kế sũa 10

1.1.3 Đặc điểm và tính chất của flavonoid 11

1.1.4 Tác dụng sinh học của cây kế sữa 15

1.1.4.1 Sơ lược về lịch sử sử dụng cây kế sữa làm thuốc 15

1.1.4.2 Tác du ̣ng dươ ̣c lý của silymarin và ứng dụng 16

1.1.5 Một số nghiên cứu về tách chiết silymarin 18

1.1.6 Những thành tựu trong nghiên cứu chế phẩm silymarin 19

1.2 Tổng quan về protein đậu tương 21

1.2.1 Cây đậu tương 21

1.2.2 Thành phần hóa ho ̣c trong quả đâ ̣u tương 21

1.2.3 Protein đâ ̣u tương 21

1.2.3.1 Thành phần Protein đậu tương 22

1.2.3.2 Tính chất của Protein đậu tương 22

1.2.4 Tác du ̣ng dươ ̣c lý của Protein hydrolysate đậu tương 24

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠN PHÁP 26

2.1 Vật liệu 26

2.1.1 Nguyên liệu 26

2.1.2 Hoá chất và thiết bi ̣ 26

2.2 Phương pháp 27

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.2.1 Phương pháp chiết silymarinbằng dung môi hữu cơ 27

2.2.2 Phương pháp Sắc ký HPLC 28

2.2.3 Phương pháp xác đi ̣nh hàm lươ ̣ng nhóm amin tự do 29

2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng axit amin tự do 30

2.2.5 Xác đi ̣nh đô ̣ đô ̣c và hoa ̣t tính của chế phẩm 30

2.2.5.1 Nghiên cứ u tác du ̣ng sinh ho ̣c 30

2.2.5.2 Thử đô ̣c tính cấp 30

2.2.5.3 Thử tác du ̣ng bảo vê ̣ gan 31

2.2.5.4 Thử tác du ̣ng lợi mâ ̣t 31

2.2.6 Phương pháp xử lý số liê ̣u 32

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ 33

3.1 Xây dựng quy trình chiết xuất silymarin 33

3.1.1 Nghiên cứ u khảo sát dung môi để chiết xuất silymarin 33

3.1.2 Kết quả sắc kí HPLC 37

3.2 Nghiên cứ u khả năng thủy phân protein bằng chế phẩm enzyme 40

3.3 Nghiên cứ u quy trình thủy phân thu nhận axit amin tự do từ protein đâ ̣u tương 43

3.4 Một số đặc tính sinh học của chế phẩm chứa sylimarin 48

3.4.1 Xác đi ̣nh đô ̣c tính cấp 49

3.4.2 Tác du ̣ng bảo vê ̣ gan 50

3.4.3 Tác du ̣ng lơ ̣i mâ ̣t 53

3.4.3.1 Tác dụng trên lưu lượng mật 53

3.4.3.2 Tác dụng trên hàm lượng cắn khô và bilirubin trong dịch mật 54

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI ̣ 56

4.1 Kết luận 56

4.2 Kiến nghi ̣ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid Deoxyribo Nucleic

ALT Alanine Aminotransaminase

AST Aspartate Aminotransaminase

CCI4 Cacbon Tetrachlorid

NaCl Muố i Natriclorua

cAMP Cyclic Adenosine Monophosphat- Chất truyền tin

TFN-α Tumor Necrosis Factor- Chất trung gian chính của phản

ứng viêm cấp

LD50 Lethal Dose- Liều lượng gây ra cái chết 50% của mô ̣t

nhó m đô ̣ng vật dùng thử nghiê ̣m HPLC Sắ c kí lỏng hiê ̣u năng cao

SKLM Sắ c kí lớp mỏng

TPCN Thực phẩm chức năng

WHO World Health Organization- Tổ chức y tế thế giới

UV Ultravioler- Phổ tử ngoại

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MU ̣C CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát dung môi để chiết xuất silymarin 34

Bảng 3.2 Kết quả chiết xuất silymarin bằng các phương pháp khác nhau 35

Bảng 3.3: Hàm lượng axit amin trong các di ̣ch thủy phân 40

Bảng 3.4: ảnh hưởng của thời gian thủy phân bột đậu tương bằng protease lên hàm lươ ̣ng amin tự do 45

Bảng 3.5: Kết quả kiểm tra lươ ̣ng amin tự do ở bước 3 45

Bảng 3.6: Hàm lượng axit amin tự do của di ̣ch thủy phân đâ ̣u tương 46

Bảng 3.7: Hàm lượng axit amin tự do của di ̣ch thủy phân đâ ̣u tương sau cô đă ̣c 47

Bảng 3.8: Liều uống chế phẩm silymarin trong các lô chuột thực nghiệm thử độc tính cấp 49

Bảng 3.9: Tác dụng của chế phẩm silymarin trên hoạt độ enzym ALT huyết thanh chuột thực nghiệm 52

Bảng 3.10: Tác dụng của chế phẩm silymarin trên bilirubin huyết thanh chuột thực nghiệm 53

Bảng 3.11: Lưu lượng mật ở các lô chuột thí nghiệm 54

Bảng 3.12: Hàm lượng cắn khô trong dịch mật của chuột thực nghiệm 54

Bảng 3.13: Hàm lượng bilirubin trong dịch mật của chuột thực nghiệm 55

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MU ̣C HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Mô ̣t số chất chính trong silymarin 10

Hình 3.1: Sơ đồ quy trình chiết suất silymarin quy mô phòng thí nghiê ̣m 37

Hình 3.2: Sắc ký đồ mẫu silymarinthu được sau khi tách chiết theo quy trình ở quy mô phò ng thí nghiê ̣m 38

Hình 3.3: Sắc ký đồ mẫu silybin chuẩn 38

Hình 3.4:Sơ đồ thủy phân protein đâ ̣u tương 40

Hình 3.5: Sơ đồ quy trình thủy phân protein đâ ̣u tương 44

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

MỞ ĐẦU

Việc dùng thuốc có nguồn gốc từ thảo dược hoặc phối hợp sử dụng thuốc đông dược và tân dược hiện đang đươ ̣c cộng đồng rất coi tro ̣ng Do các loại thuốc thảo dược và sự kết hợp đông –tây y không những chữa được bệnh mà

ít có tác dụng phụ Vì vậy, thuốc có nguồn gốc thảo dươ ̣c, đặc biệt là những cây thuốc đã được dùng rộng rãi theo kinh nghiệm cổ truyền để chữa bệnh được các nhà khoa học trên thế giới và Việt Nam quan tâm nghiên cứu

Gan là mô ̣t trong những cơ quan quan trọng về mặt chuyển hóa các chất

củ a cơ thể con người Một trong những chức năng quan tro ̣ng của gan là tham gia vào quá trình giải độc các chất nội sinh và ngoa ̣i sinh Trong các trường

hợp bê ̣nh lý hay sự quá tải các chất đô ̣c trong gan, các tế bào gan sẽ bi ̣ hủy hoại, dẫn đến các tổn thương trên gan, dần dần làm các tổn thương không hồi phục làm cho gan bị xơ, và mất chức năng giải đô ̣c Bệnh gan là mô ̣t trong những bệnh phổ biến trong cô ̣ng đồng Có nhiều loa ̣i bê ̣nh gan trong đó thường gă ̣p là viêm gan siêu vi, đó là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến nhất trên thế giới, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng trong thập niên này Hiện có 6 loại virus gây viêm gan : A, B, C, D, E và G, trong đó phổ biến

và nguy hiểm nhất là siêu vi B và C Khoảng 2 tỷ người trên thế giới đã hoặc đang nhiễm virus viêm gan B, tâ ̣p trung chủ yếu ở châu Á và châu Phi Theo báo cáo của tổ chứ c y tế thế giới, viêm gan B là mô ̣t trong mười nguyên nhân gây tử vong nhiều nhất, khoảng 1 triê ̣u ca tử vong mỗi năm do bê ̣nh này và hơn 350 triê ̣u người mang virus này mãn tính Có khoảng 3% dân số thế giới nhiễm virus viêm gan C và trên 170 triệu người mang virus này mãn tính Việt Nam là mô ̣t trong những nước có tỷ lê ̣ viêm gan B cao nhất trên thế giới Người bi ̣ viêm gan ma ̣n tính có nguy cơ ung thư gan cao gấp 20 lần so với người bình thường và 40% trong số họ sẽ tử vong vì ung thư gan [62], [63]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Đã có những bằng chứng cho thấy silymarin trong cây kế sữa có tác dụng chữa bệnh xơ gan do rượu Một trong những hoạt tính triển vọng của silymarin là chống ung thư, vì vậy có thể sử dụng silymarin kết hợp với phương pháp hóa trị liệu Silymarin hoạt động như chất chống oxy hóa, bảo

vệ mô và loại bỏ chất gây độc cho gan [5], [10]

Protein đậu tương được sử dụng rộng rãi như một thành phần chức năng trong rất nhiều loại thực phẩm chế biến bởi khả năng tạo gel và các tính chất hóa lý, cảm quan và dinh dưỡng cao Việc thủy phân protein các hạt họ đậu cải thiện các đặc tính dinh dưỡng của chúng như làm chậm quá trình hư hỏng, cải thiện cấu trúc, tăng hoặc giảm độ hòa tan, ngăn cản những tương tác không mong muốn, loại mùi khó chịu và các thành phần độc [27], [57]

Vì vâ ̣y, để có thể sản xuất một số loại sản phẩm tăng cường chức năng gan cũng như hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến gan tại Việt Nam, thay thế các sản phẩm nhập ngoại, chính là cơ sở để chúng tôi thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu kỹ thuâ ̣t tách chiết silymarin từ ha ̣t kế sữa và axit amin từ đâ ̣u tương làm nguyên liê ̣u cho thực phẩm chức năng tăng cường chức năng gan.”

Mu ̣c tiêu của đề tài

1 Nghiên cứu quy trình tách chiết Sylimarin từ hạt kế sữa

2 Nghiên cứu quy trình thuỷ phân thu nhận axit amin tự do từ đâ ̣u tương

Nô ̣i dung nghiên cứu

 Xây dựng quy trình tách chiết silymarin từ ha ̣t kế sữa

 Xây dựng quy trình thủy phân thu nhâ ̣n axit amin tự do từ đâ ̣u tương

 Thử đô ̣ độc tính cấp của chế phẩm thu được

 Chứng minh được mô ̣t số đă ̣c tính sinh ho ̣c của chế phẩm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về silymarin

1.1.1 Cây kế sư ̃a

Kế sữa (Sylibum marianum (L.) Gaernt) là mô ̣t loài thực vật có hoa

thuộc ho ̣ cúc, là loa ̣i cây thảo sống mô ̣t hoă ̣c hai năm, cao 30-150cm Thân thẳng và phân nhánh Lá xanh, không có lá kèm, bóng láng, thường có nhiều đốm trắng dọc theo các gân, mép có răng dạng gai, gai màu vàng và rất nhọn; các lá phía trên và ở giữa ôm lấy thân; các lá ở dưới rất to, có phiến chia thuỳ

và có cuống Cụm hoa đầu đơn độc, rộng 3-10cm Lá bắc ngoài và giữa có một phần phụ hình tam giác màu lục thu lại thành một gai to, ở gốc có 4-6 gai nhỏ, ngắn hơn, ở mỗi bên Hoa màu tím, hiếm gặp màu trắng, hơi giống nhau, đều có 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 1 ô với 2 lá noãn và 2 vòi nhuỵ phình ở gốc Quả bế hình bầu dục thuôn, dài 7-8mm, màu đen bóng có vân vàng nhiều

hoặc ít, tùy thuộc vào nguồ n giống S.marianum và điều kiê ̣n canh tác [15], [24], [26] Ra hoa vào tháng 5 đến tháng 8 của năm thứ hai

Cây có nguồn gốc ở Địa Trung Hải và mọc hoang dại ở nhiều nơi trên thế giới như miền Nam và Trung Âu, Bắc Phi, Trung Đông, Ấn Độ, Trung Quốc, Bắc và Nam Mỹ [26]

1.1.2 Tha ̀nh phần hóa ho ̣c của ha ̣t kế sữa

Thành phần hoá ho ̣c chính của ha ̣t kế sữa là silymarin Silymarin flavonolignan là phenol tự nhiên gồ m mô ̣t phần flavonoid và mô ̣t phần lignan Dịch chiết của hạt cây chứa khoảng 70-80% silymarin flavonolignans và khoảng 20-30% thành phần không xác định, chủ yếu là các hợp chất polyphenol oxy hóa và trùng hợp Thành phần chính của tổ hợp silymarin là silybin, đồng nghĩa với silybinin Ngoài silybin là hỗn hợp của 2 diastereomers A và B với tỉ lệ khoảng 1:1, một lượng lớn các flavonolygnants

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

khác có trong silymarin, đó là iosilybin, dehydrosilybin, silychristin, silydanin, và một số flavonoids, chủ yếu là taxifolin (hình 1.1) [28]

Những tài liệu dược lý, y học và quang hóa, tranh luận rất nhiều về hiệu quả của silymarin/silybin Nguyên nhân chính của sự không thống nhất và không chắc chắn về hiệu quả của silymarin/silybin là thành phần khác nhau của chế phẩm silymarin được sử dụng trong phần lớn nghiên cứu Các dẫn chứng tài liệu cho thấy tỉ lệ của từng chất trong các loại silymarin khác nhau

phụ thuộc rất lớn vào nguồn S.marianum (giống cây và điều kiện trồng) và

quá trình tách chiết, xử lý Gần đây, silymarin/silybin nhận được sự quan tâm

do các hoạt tính có lợi của nó không liên quan trực tiếp đến hiệu quả bảo vệ gan và chống oxy hóa [28], [39], [42], [53], [54]

Hi ̀nh 1.1: Một số chất chính trong silymarin

1.1.3 Đặc điểm và ti ́nh chất của flavonoid

Flavonoid là một trong những nhóm chất polyphenol thường gặp trong thực vật, là những sắc tố phần lớn có màu vàng, tan trong nước nên có tên là

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

“flavonoid” Tuy nhiên, một số sắc tố có màu xanh, đỏ, tím hoặc không màu nhưng cũng được sắp xếp vào nhóm flavonoid vì nó cũng có đặc điểm về cấu trúc giống nhau [2], [10]

 Tính chất lý học

Flavonoid là một hợp chất phenol có một số tính chất sau:

Flavonoid tinh khiết có dạng tinh thể hoặc dạng vô định hình, có nhiệt độ nóng chảy nhất định, có màu vàng như flavon, chalcon hoặc không màu như isoflavonoid, catechin, hay có màu sắc thay đổi tùy thuộc pH môi trường như antoxyanidin (ở môi trường acidcó màu đỏ, ở môi trường kiềm có màu xanh) Các aglycon (nhân phenol) của flavonoid hòa tan trong dung môi hữu cơ như ether, cồn etylic, aceton và hầu như không tan trong nước

Flavonoid ở dạng liên kết (glycosid) hòa tan được trong nước nhưng không tan trong ether và chloroform Flavonoid có hương thơm và vị đắng

Có khả năng hấp thụ tia tử ngoại nhờ hai vòng benzen A và B Có hai dải hấp

thụ cực đại: Dải I ở bước sóng 320-380nm, dải II ở bước sóng 220-280nm

 Tính chất hóa học

Do đặc điểm cấu tạo của flavonoid có các nhóm hydroxyl phenolic, nhóm carbonyl, vòng thơm benzen nên chúng có khả năng phản ứng rất lớn Tính chất hóa học của flavonoid còn phụ thuộc vào vị trí nhóm OH, hệ nối đôi liên hợp và các nhóm thế

Sau đây là các phản ứng hóa học đặc trưng của flavonoid:

*Phản ứng của nhóm hydroxyl (OH)

Tính oxy hóa: Dưới tác dụng của các chất oxy hóa ( nitrat bạc, ferricyanit, persulfate, các gốc tự do…) hay enzym polyphenoloxydase ,flavonoid sẽ bị oxy hóa thành các gốc phenoxy ArO* (gốc tự do bền) Các gốc này có thể dimer hóa hay phản ứng oxy hóa và các phản ứng làm bẻ gãy vòng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Tính axit: Các flavonoid có tính acidyếu nên dễ dàng phản ứng với dung dịch kiềm để tạo thành muối tan trong nước khi đun nóng, cho màu vàng cam hay đỏ thắm Antoxyan trong dung dịch amoniac hay natri cacbonate cho màu xanh hoặc tím

Sự tạo thành liên kết hydro: Khi không có trở ngại gì về mặt cấu trúc không gian liên kết hydro được hình thành giữa các nhóm OH trong cùng phân tử hoặc giữa các phân tử với nhau

Đặc điểm này làm ảnh hưởng đến tính chất hóa học như: Điểm sôi, điểm nóng chảy, độ hòa tan, đặc tính phổ tử ngoại, cấu trúc phân tử và khả năng phản ứng

Phản ứng ether hóa: Ether thiên nhiên của phenol thường gặp trong thực vật, đặc biệt là những ether etylic Những nhóm OH phenol dễ dàng tham gia phản ứng ether hóa

*Phản ứng của nhóm cacbonyl

Phản ứng này đặc trưng cho các chất flavonoid có nhóm cacbonyl ở vị trí C4 và có nối đôi ở giữa C2 và C3, điển hình là flanonol, flavon không có OH

ở C3 nên phản ứng khó hơn và cho màu nhạt nên đôi khi khó phát hiện

Phản ứng tạo phức với kim loại: Khả năng tạo chelat với kim loại nặng

là một trong những tính chất quan trọng của flavonoid, liên quan đến hoạt tính sinh học của chúng Các phức màu xanh đen với molipden và sắt Các flavonoid có nhóm cacbonyl ở vị trí C4 và hydroxyl ở vị trí C3-C5 dễ tạo phức với kim loại, đặc biệt với nhôm cho màu vàng hoặc vàng xanh, phát quang ở bước sóng 365nm

 Tác dụng dươ ̣c lý của flavonoid

Flavonoid có nhiều ứng dụng quan trọng trong y học Những flavonoid

có hoạt tính sinh học gọi là bioflavonoid phụ thuộc vào cấu trúc của chúng Khi đưa flavonoid vào cơ thể sẽ sinh ra các gốc tự do bền vững hơn các gốc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tự do hình thành trong quá trình viêm nhiễm bệnh lý Chúng có khả năng giải tỏa các điện tử tự do trên mạch vòng của nhân thơm và hệ thống nối đôi liên hợp, làm triệt tiêu các nguồn gốc tự do sinh ra trong quá trình viêm nhiễm, do tính bền vững về mặt hó a học nên chúng không tham gia vào dây chuyền phản ứng oxy hóa [23]

Flavonoid còn có tác dụng bảo vệ cho adrenalin hoạt động một cách bình thường do chúng có khả năng tạo phức với Cu2+,có tác dụng là chất xúc tác cho phản ứng oxy hóa adrenalin, leucholamin [23]

Flavonoid ảnh hưởng đến hệ thống nội tiết, làm tăng sức đề kháng của

cơ thể đối với tác dụng gây độc bất kể loại nào, tăng chức năng thải độc của gan, tăng trao đổi glucose, tăng tổng hợp glucogene, ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp prothrombin của gan [25]

Các chất thuộc nhóm flavonoid có tác dụng làm giảm sức thấm của mạch mao như sinh tố P, một trong những chất quan trọng đó là rutin Rutin có tác dụng chữa các bệnh xuất huyết mao quả n, làm cho thành mạch được bền vững, chữa cao huyết áp tăng, cường công hiệu vitamin khỏi bị oxy hóa Nó còn ảnh hưởng tốt đến chuyển hóa canxi và còn chống được tia phóng xạ

Về mặt dược lý, các bioflavonoid có tác dụng chống viêm, giãn cơ trơn, chống dị ứng, ức chế sự phát triển của ung thư, làm giảm các tổn thương xuất huyết nhỏ trong bệnh đái đường

Về mặt miễn dịch học, nhiều bioflavonoid có tác dụng kích thích lympho bào, sản xuất interferol, ức chế hiện tượng thoát bọng chứa các amin hoạt mạch từ tế bào mastocyte, ức chế sụ nhân lên của virus

Việc nghiên cứu và ứng dụng các chế phẩm flavonoid trên thế giới ngày càng phát triển Ở Việt Nam đã có những nghiên cứu mà kết quả được ứng dụng vào thực tiễn, tạo một số thuốc chữa bệnh có hiệu quả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1.1.4 Tác dụng sinh học của cây kế sư ̃a

1.1.4.1 Sơ lược về lịch sử sử dụng cây kế sư ̃a làm thuốc

Cao chiết kế sữa đã được sử dụng làm thuốc từ thời Hy Lạp cổ đại Dioscorides, một nhà dược thảo học Hy Lạp thế kỷ thứ I đã viết rằng, ha ̣t kế

sũa pha thành trà uống có thể chữa được rắn độc cắn Pliney The Elder (năm 23-79 sau CN) ghi lại rằng, nước ép cây kế sữa trộn với mật ong làm thuốc lợi mật rất tốt Đây có thể là ghi nhận đầu tiên về tác dụng của cây kế sữa liên quan đến gan [20]

Nhiều thế kỷ sau, kế sữa đã trở thành một cây thuốc quen thuộc ở Đức và đã được nhắc đến trong một bản thảo tiếng Đức cổ “Physica” của Hildegarde viết năm 1150 và được xuất bản vào năm 1533 Tác giả đã viết về công dụng của rễ, toàn cây và lá kế sữa Một số tác giả khác như Otto Brunfels (1534), Hieronimus Bock (1595), Jacobus Theodorus (1664) và Adam Lonicerus (1679) đã giới thiệu dùng kế sữa để trị bệnh về gan [24] Vào cuối thế kỷ XVIII, Culpepper (1787) cho rằng kế sữa là thứ thuốc tuyệt vời làm thông tắc gan, lách và vì vậy dùng rất tốt để chữa bệnh vàng da Giữa những năm 1772 đến 1850, một chế phẩm có tên gọi là “Cồn thuốc của Rademacher”, cao chiết cồn hạt kế sữa đã được dùng phổ biến để trị các rối loạn về gan, lách Tương tự, cuối thế kỷ XIX đầu thế kỷ XX, một trường đào tạo các nhà dược thảo học tên là “Eclectic” đã dùng cao chiết kế sữa để điều trị sung huyết gan, giãn tĩnh mạch, rối loạn kinh nguyệt và các bất thường của

lá lách và thận [20], [21]

Năm 1958, các nhà khoa học người Đức bắt đầu chú ý nghiên cứu cây kế

sữa Các nghiên cứu về tác dụng bảo vệ gan, thành phần hoạt chất và cơ chế tác dụng đã được thực hiện Thành phần hoạt chất trong quả kế sữa đã được xác định là silymarin, một hỗn hợp các flavonolignan mà các chất chính là silybin, silychristin và silydianin Từ năm 1969, chế phẩm silymarin chiết

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

xuất từ ha ̣t kế sữa bắt đầu được sử dụng rộng rãi trong điều trị ở Đức và sau

đó là trên khắp thế giới Vào những năm 1990, doanh số bán chế phẩm này ở Đức lên tới trên 180 triệu đôla/năm 31% số bệnh nhân mắc bệnh về gan ở

Mỹ đã dùng dược thảo mà chủ yếu là dùng kế sữa [20]

1.1.4.2 Ta ́ c du ̣ng dươ ̣c lý của silymarin và ứng dụng

Hạt của cây kế sữa (Sylibum marianum (L.) Gaernt.) đã được sử dụng

hơn 2000 năm nay để chữa các bệnh rối loạn gan và túi mật như viêm gan, xơ gan, vàng da và bảo vệ gan khỏi tác động có hại của hóa chất và các chất độc ngoài môi trường như nọc rắn, côn trùng, ngộ độc nấm hoặc rượu [43], [52]

 Hiệu quả bảo vệ gan: Tác du ̣ng bảo vê ̣ gan của kế sữa là do nhóm chất

mớ i có hoa ̣t tính sinh ho ̣c đó là các silymarin flavonolignans mà thành phần chính là silymarin Đã có những bằng chứng cho thấy silymarin có tác dụng chữa bệnh xơ gan do rượu Cơ chế của quá trình này do silymarin phục hồi alanin transaminase, aspartate transaminase và bilirubin huyết thanh về mức bình thường, giảm γ-glutamyl transpeptidase, làm tăng đáng kể vận tốc biến đổi của lymphhoccytes và giảm rõ ràng lượng tế bào CD8+ Có thể thấy cơ chế này dựa trên hoạt tính điều biến miễn dịch của silymarin Silymarin cũng được dùng để chữa xơ gan do biến chứng tiểu đường và viêm gan C mãn tính cùng với các chất khác, gan nhiễm mỡ và đều cho kết quả khả quan [18]

Các cơ chế bảo vệ chống bệnh gan

- Chống oxy hóa: Khả năng chống oxy hóa của silymarin đã được chứng minh bởi nhiều thử nghiệm Các kết quả nhận được chỉ ra rằng silymarin là dạng chống oxy hóa bẻ chuỗi (chain-breaking) và loại gốc tự do Cơ chế phân

tử của hoạt tính chống oxy hóa có thể suy ra từ cấu trúc các sản phẩm nhị trùng nhận được từ các phản ứng của silybin

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

- Ức chế tạo NO: Trường hợp gan nhiễm mỡ, NO dư thừa sẽ cảm ứng sự thiếu oxy máu và tăng độc tính đối với mononuclear macrophage hoạt tính Silymarin ức chế tế bào Kupffer của gan tạo NO và giảm tương tác với O2

- Giảm hoạt tính của phospholipase và bảo vệ màng gan bằng cách chống lại thromboxane A, làm cho mạch máu chắc, ngăn phản ứng độc của tế bào T và tăng lượng cAMP nội bào

- Bảo vệ màng tế bào: Thông qua phản ứng chống oxy hóa lipid Silymarin điều chỉnh tính lưu động của microsome gan và màng mitochondria

và giữ cho tính lưu động của màng ở trạng thái chuyển động hoàn hảo

- Màng tế bào ổn định và trao đổi năng lượng thuận tiện: Sử dụng silymarin làm giảm đáng kể chức năng dị thường và quá trình xơ hóa

- Đẩy mạnh hepatic cytothesis: Silymarin có thể kết hợp với estradiol receptor và hoạt hóa nó trong tế bào gan và kết quả là tăng hoạt tính của RNA polymerase nội bào

- Cytokine và chức năng miễn dịch: Hiệu quả kháng viêm và kháng xơ hóa là do silymarin hoạt hóa tế bào hình sao (stellate) của gan và ổn định tế bào lớn (mast) Silymarin có thể làm giảm lượng và hoạt tính cytotoxic lymphocytes và các tế bào natural killer trong máu, điều đó cho thấy silymarin có chức năng điều biến miễn dịch

 Chất bảo vệ và chống ung thư : Silymarin/silybin ức chế tác dụng gây

ung thư của nhiều loại hóa chất Một số khối u phụ thuộc hormone steroid cũng bị ức chế Những kết quả nhận được khi thử nghiệm với các dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt, buồng trứng…cho rằng điều chỉnh xuống thụ thể phát triển màng trong mạch (vascular endothelial growth recptor 4 – VEGR) và điều chỉnh lên angiopoietin-2 là các cơ chế tiềm năng chịu trách nhiệm cho hoạt tính của các chất này [28], [45], [58]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Chất hỗ trợ trong liệu pháp chống ung thư: Một trong những hoạt tính triển vọng của silybin là chống ung thư, vì vậy có thế sử dụng kết hợp với phương pháp hóa trị liệu Silybin hoạt động như chất chống oxy hóa và bảo

vệ mô và loại bỏ chất độc cho gan

 Bảo vệ thần kinh: Nhờ hoạt tính chống oxy hóa của chất này

Silymarin ức chế sựu tạo thành các chất trung gian gây viêm như TFN-α và nitric oxide và như vậy làm giảm hư tổn cho thần kinh dopaminergic Dịch chiết kế sữa bảo vệ thần kinh cá ngựa khỏi stress oxy hóa [40]

 Chữa và phòng chống các vấn đề dạ dày – ruột: Hiệu quả phòng

bệnh đái đường của silymarin là do hoạt tính chống oxy hóa hoặc tăng nồng độ glutathione tuyến tụy và huyết tương, hoặc cả hai Silymarin là một khả năng mới trong chữa bệnh đái tháo đường do khả năng tăng lượng insulin và phục hồi chức năng tuyến tụy Silymarin cũng hoạt động trong ruột kết như các chất ức chế đặc biệt β-glucoronidase vi khuẩn đường ruột [40]

 Phòng và chữa bệnh thận: Cũng như đối với các bộ phận khác,

silymarin bảo vệ thận và chống oxy hóa

 Phòng và chữa bệnh tim phổi: Silymarin tăng hiệu quả chữa bệnh tim

phổi khi được sử dụng kết hợp với các loại thuốc Hiệu quả chữa bệnh của silymarin có thể giải thích bởi tác dụng sinh học khác nhau của chất này, đó là ổn định màng tế bào, chống viêm và ức chế con đường arachiddonic axit Hiệu quả phòng bệnh của silymarin có lẽ do cơ chế gián tiếp làm giảm đáp ứng đến histamine và kết quả là đáp ứng quá mẫn tức thì [40]

 Bảo vệ da: Cả silymarin và silybin đều biểu hiện hiê ̣u quả bảo vệ

chống ung thư do ánh sáng gây ra trên mô hình chuột Cơ chế bảo vệ da được chứng minh do khả năng làm giảm và ức chế tác dụng có hại của tia UV mặt trời như stress oxy hóa, viêm, đáp ứng miễn dịch và tổn thương DNA cũng như cảm ứng chương trình tự chết của tế bào [40]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

 Tương tác với các thụ thể hormone steroid: Cả silymarin và silybin

đều biểu hiê ̣n hoạt tính antiandrogenic trong dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt, chúng ức chế sựu tăng sinh của tế bào ung thư phụ thuộc thụ thể homonee steroid

 Điều biến sự vận chuyển thuốc: Một cơ chế nhờn thuốc quan trọng là

do protein màng, ví dụ Pgp trong tế bào động vật Silymarin ức chế protein này và làm tăng sự tích tụ của thuốc trong tế bào

 Điều khiển chương trình tự chết tế bào (apoptosis) và quá trình viêm:

Silybin biết được cảm ứng chương trình tự chết của tế bào màng trong (endothelial) và ức chế hình thành mạch, là quá trình quan trọng để khối u phát triển và di căn Slymarin có hoạt tính chống xơ vữa động mạch, có thể là

do bảo vệ lipoprotein vận chuyển cholesterol khỏi bị oxy hóa

1.1.5 Mô ̣t số nghiên cứu về tách chiết silymarin

Việc nghiên cứu chiết xuất silymarin từ hạt kế sữa được Wagner, nhà nghiên cứ u người Đức thực hiện lần đầu tiên vào năm 1958 và chứng minh silymarin là hỗn hơ ̣p của flavonolignans gồm silyibin, silychristin, silydianin

và các thành phần có tác du ̣ng bảo vệ gan, chố ng xơ gan trong ha ̣t kế sữa Từ đó đến nay, nhiều nước châu Âu có cây kế sữa đều đã nghiên cứu quy trình chiết xuất silymarin Điểm chung của các quy trình này là dùng mô ̣t lượng rất lớn dung môi đắt tiền và dễ gây cháy nổ như dầu ether, aceton, methanol, clorofom [35], [55]

Wang Xin và cs (2008) sử du ̣ng phương pháp chiết bằng dung môi EtOH ở các nồng độ 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% kết hợp với vi sóng công suất 500w trong thời gian 40, 50, 60, 70 và 80 phút, ở các nhiê ̣t đô ̣ khác nhau

là 70, 90, 110, 130 và 1500 C, tỷ lệ rắn-lỏng lần lươ ̣t là 1:10, 1:20, 1:30, 1:40

và 1:50 để chiết silymarin [56]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Trên thế giới cũng có vài nghiên cứu được đưa ra như của Madaus 1980 đã chiết thành công flavonolignan bằng acetat ethyl [35] Năm 1977 Ba Lan công bố một công trình dùng methanol để chiết [29] Trung Quốc dùng cồn để chiết [61]

1.1.6 Những thành tựu trong nghiên cứu chế phẩm silymarin

Các chế phẩm chủ yếu của slymarin là viên nang, viên rắn, thể nhũ,

muối silymarin tiêm, hoặc phối trộn với một số tá dược khác như PEG, PVP, cyclodextrin…[18]

Thuốc viên: Nature,s Bounty Milk Thistl, 175 mg Sản xuất ta ̣i Mỹ bởi Nature,s Bounty

Trunature Liver Helth Complex viên nén 250mg chứa 200mg silymarin

và các thành phần khác như bồ công anh, bô ̣t nghê ̣ tây, N- Acetyl Cysteine Đươ ̣c sản xuất ta ̣i Mỹ bởi Costo Wholesale Inc

Viên nang: Hiện nay trên thi ̣ trường có rất nhiều loa ̣i như: Viên nang Silymarin Milk Thistle 1000mg trong đó mỗi viên nang chứa 250 mg silymarin và các thành phần khác là dầu đâ ̣u nành, lecithin từ đâ ̣u nành, caramel, titanim Dioxid Sản xuất ta ̣i Mỹ bởi công ty US Trusted LLC

Viên Esteem Liver Detox 300mg sản xuất ta ̣i Mỹ bởi Bio Nutrition, Inc

Bột: Hepatis B Xintai của Quả ng Châu, Trung Quốc có 5 loại thảo dược khác nhau: Dành dành (gardenia); rễ hòe (sophora), cành cây amoorcom, rễ danshen và silymarin

Thuốc tiêm: Muối meglumine là sản phẩm của phản ứng giữa silibin và

amine hữu cơ Muối Di-meta-succinate sodium có chức năng bảo vệ gan mạnh

Các sản phẩm khác: Hỗn hợp β-cyclodextrin (β-CD) với silymarin; chất

phân bố silymarin rắn là PVP hoặc PEG; liposome; hỗn hợp phospholipid; các hạt nano

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Có nhiều phương pháp để chiết silymarin như ép lạnh và chiết bằng các loại dung môi khác nhau [51] hoặc sử dụng n-hexane [52] Mỗi phương pháp

có những lợi thế và những bất lợi khác nhau

1.2 Tổng quan về protein đâ ̣u tương

1.2.1 Cây đậu tương

Đâ ̣u tương hay đỗ tương (tên khoa ho ̣c Glycine max) là cây ho ̣ đâ ̣u

(Fabaceae), là loại bản đi ̣a của Đông Á Loa ̣i này giàu hàm lươ ̣ng chất đa ̣m protein, đươ ̣c trồng để làm thức ăn cho người và gia súc Trên thế giới có trên

1000 loại đậu tương với nhiều đặc điểm khác nhau, hạt đậu tương có kích thước nhỏ nhất như hạt đậu Hà lan (pea) cho tới lớn nhất giống trái anh đào (cherry), hạt đậu có nhiều màu sắc như đỏ, vàng, xanh, nâu và màu đen [12], [13]

Cây đâ ̣u tương là cây thực phẩm có hiê ̣u quả kinh tế cao la ̣i dễ trồng Sản phẩm từ cây đâ ̣u tương được

sư ̉ du ̣ng rất đa da ̣ng như dùng trực tiếp quả thô hoặc chế biến thành đâ ̣u phu ̣, ép thành dầu đâ ̣u tương, nước tương, làm bánh ke ̣o, sữa đâ ̣u tương đáp ứng nhu cầu đạm trong khẩu phần ăn hàng ngày của người cũng như gia súc [41]

Ngoa ̀i ra , cây đâ ̣u tương còn có tác dụng cải tạo đất, tăng năng suất các cây trồng khác Điều này có được là nhờ hoạt đô ̣ng cố định N 2 củ a loài vi khuẩn Rhizobium cô ̣ng sinh trên rễ cây ho ̣ đâ ̣u [12], [13]

1.2.2 Tha ̀nh phần hóa ho ̣c trong quả đậu tương

Trong qua ̉ đâ ̣u tương có thành phần hóa ho ̣c chủ yếu là protein , lipid, glucid, các muối khoáng Ca,

Fe, Mg, K, Na, S; ca ́c vitamin A, B1, B2, D, E, F; các enzyme, sáp, nhựa, cellulose với thành phần cu ̣ thể là: Độ ẩm 8-10%, Protein 35-45%, Lipid 15-20%, Hydratecarbon 15-16%, Cellulose 4-6%, Vitamin A 710 UI, Vitamin B1 300 UI, Vitamin B2 90 UI, Vitamin C 11 UI, Muối khoáng 4,6% Hàm lượng axit amin không thay thế trong protein đâ ̣u tương là: Tryptophan 1,1%, Leucine 8,4%, Isoleucine 5,8%, Valine 5,8%, Threonine 4,8%, Lysine 6,0%, Methionine 1,4%, Phenylalanine 3,8% Co ́ chứa các acidbéo không thay thế

có giá trị dinh dưỡng cao, cu ̣ thể như acidkhông no: linoleic 52-65%, oleic 25-36%, linolenoic 2-3%, các acidda ̣ng no: Acidpanmitic 6-8%, stearic 3-5%, arachidoic 0,1-1,0% [7], [12], [13]

Carbohydrates trong đậu tương thường có : Các polysaccharide không hòa tan như hemicellulose, các peptin, cellulose và các oligosaccharide như hexose, rafinose, stachiose, verbascose Tro của đậu tương rất giàu sắt và kẽm [7], [12], [13]

1.2.3 Protein đâ ̣u tương

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1.2.3.1 Thành phần Protein đậu tương

Sau khi hoà tan trong nước hoặc ở pH kiềm nhẹ, các protein của đâ ̣u tương có thể tách ra nhiều đoạn bằng các sắc kí thấm gel, bằng điện di, bằng siên li tâm… Với phương pháp siên li tâm người ta tách ra được 4 đoạn ứng với các hệ số sa lắng S20,W là 2S, 7S, 11S, 15S Trong đó thành phần chính là globulin 7S và 11 S, hay cò n gọi là -conglixinin và glixinin chiếm trên 70% tổng lượng protein của hạt Lượng glixinin chiếm 60% trong tổng lươ ̣ng protein chiếm giữ và -conglixinin chiếm 40% cò n la ̣i Glixinin gồ m năm tiểu đơn vị có nồ ng đô ̣ acid amino 3-4,5%, ngươ ̣c la ̣i -conglixinin gồm ba tiểu đơn vi ̣ chứa ít hơn 1% axit amin S [34]

Trong thực phẩm có PH trung tính và không gia nhiệt thì các globulin 7S và 11S nói chung đều ở trạng thái hoạt động, không bị biến tính, phân tử ở dạng dime (7S) và oligome (11S) vì lực ion yếu Các xử lí nhiệt và thay đổi

PH sẽ làm cho protein bi ̣ biến tính và các cấu trúc bâ ̣c cao bi ̣ phá hủy

1.2.3.2 Tính chất của Protein đậu tương

 Sự phân li và sự tập hợp của protein đậu tương

Khi đun nóng dung dịch -conglixinin loãng ở pH=7-8 và lực ion yếu, đến 1000C thì các phân tử của chúng sẽ phân li thành các dưới đơn vị mà không kèm theo các hiện tượng tập hợp phân tử

Khi gia nhiệt đến 1000C dung dịch glixinin có nồng độ loãng(<1%P/V( số gam chất tan trên 100ml thể tích của dung dịch) ), ở pH=7-7,6 và lực ion 0,2-0,4 thì các phân tử cũng phân li thành các dưới đơn vị và sau đó thì tập hợp lại

Khi đun nóng đến 800C một dung dịch vừa chứa glixinin và conglixinin có nồng độ loãng (<1%P/V) ở PH =8 thì các phản ứng phân li và tập hợp sẽ xảy ra

-Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

 Sự tạo gel của protein đậu tương

Khi dung dịch protein đậu tương có nồng độ đậm đặc (>5% P/V) được đun nóng ở PH gần trung tính thì sẽ ta ̣o gel Dung dịch đầu tiên qua một trạng thái lỏng có độ nhớt tăng cao, giai đoạn tiền gel Khi lực ion còn yếu thì trạng thái này sẽ xảy ra từ 700C là thời điểm mà -conglixinin được giãn mạch hoàn toàn Khi lực ion cao thì việc tăng độ nhớt chỉ xảy ra ở nhiệt độ cao hơn Việc tạo thành gel protein sẽ phụ thuộc vào cân bằng giữa liên kết protein – nước

và liên kết protein – protein

Độ cứng của gel protein đậu nành sẽ giảm cùng nồng độ NaCl và khi ở nhiệt đô ̣ quá cao

Axit hoá dung dịch protein đậu tương đến pH =5,5 hoặc thêm ion Ca2+sẽ làm đông tụ protein thành từng cục tương đối đàn hồi Nếu đun nóng các cục đã thu được bằng kết tủa đẳng điện hoặc bằng canxi sẽ làm các chuỗi polypeptide bị giãn mạch và tạo nên một mạng lưới protein ba chiều có kết cấu của một gel thực thụ

 Một vài tính chất khác

Protein đậu tương cực kỳ bền nhiệt, có thể chịu nhiệt đến 77oC Tuy nhiên ở nhiệt độ đó protein không thể tan trở lại Protein đậu tương có thể bền nhiệt đến 100oC khi thêm vào các yếu tố làm tăng lực ion

Trong phần lớn các ứng dụng của đậu tương, việc gia nhiệt thấp để vô hoạt các enzym là cần thiết.Tuy nhiên trong một vài ứng dụng, khi protein

đâ ̣u tương gia nhiệt ở nhiệt độ thấp và thêm vào đó các chất có chứa lipoxygenase hoạt động thì xảy ra sự oxy hóa Sự ôxy hóa này có thể gây ra

sự phá hủy màu sắc và vì thế sẽ dẫn đến mất màu sản phẩm Nó cũng có thể gây ra sự oxy hóa những nhóm sunfit tự do từ liên kết disunfua Cả 2 chức năng này đều quan trọng trong việc chuẩn bị bột nguyên liệu cho công nghiệp làm bánh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1.2.4 Ta ́ c du ̣ng dươ ̣c lý của Protein hydrolysate đậu tương

Protein hydrolysate ( PHs: là hỗn hợp của oligopeptides, polypeptides

và axit amin tự do) được sử dụng để chữa các bệnh về trao đổi chất, các công thức cho chế độ ăn kiêng và cho trẻ em, người già và vận động viên [30] Quá trình thủy phân protein đậu tương tạo ra các peptides nhỏ và đã chứ ng minh được rằng, các peptides ngắn hấp thụ trong đường ruột với tốc độ cao hơn so với các axit amin tự do Điều này cho thấy lợi thế của protein hydrolysate với cùng một lượng axit amin được sử dụng trong chế độ dinh dưỡng của bênh nhân sau mổ hoặc cho người có tuổi Protein đậu tương cũng được sử dụng trong dinh dưỡng thể thao và kiểm soát trọng lượng, trong chế độ ăn uống đặc biệt đối với các bệnh nhân mắc một số bệnh như pancreatitis, short bowel syndrome, bệnh Crohn’s và dị ứng thực phẩm Hoạt tính chống oxy hóa của protein đậu tương đã được báo cáo [33] Những báo cáo cũng cho thấy hàm lượng các axit amin quan trọng trong protein đậu tương đáp ứng yêu cầu dinh dưỡng của người trừ lysine và methionine [27] Thủy phân protein đậu tương bằng các phương pháp khác nhau đã nhận được nhiều peptides hoạt tính sinh học với các đặc tính chống tăng huyết áp, chống tăng cholesterol, chống béo phì, chống oxy hóa, chống khối u, điều biến miễn dịch và đối kháng vi sinh vật [22], [32], [36], [59], [60] Wang và cs (2008) đã xác định được 3 peptides trong protein hydrolysate đậu tương có hoạt tính ức chế topoisomerase II [57] Các peptides chống tăng huyết áp và ức chế enzyme angiotesin – converting (ACE) Enzyme này làm tăng huyết áp bằng cách biến đổi decapeptide angiotensin I thành octapeptide angiotensin II làm co mạch, dẫn đến huyết áp tăng Rất nhiều tài liệu chỉ ra rằng, protein đậu tương

có thể làm giảm nồng độ cholesterol máu ở người và động vật, nhưng cơ chế này được các tác giả đưa ra không thống nhất Một số nhà nghiên cứu cho rằng, hiệu quả giảm cholesterol là do các hợp chất iosflavones tự nhiên, một

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

số khác lại tin rằng do protein hấp thụ, nhưng cũng có thể do các peptides hoạt tính điều biến cholesterol homeostasis tại gan [60] Hiệu quả chống béo phì của protein và peptides đậu tương đã được Nakamori (2002) tổng quan [36] Một số nghiên cứu chúng minh peptides đậu tương ức chế thu nhận thức

ăn và làm sạch ruột bằng cách tiết ra cholecystokinin kích thích (CCK) Kết quả này cho rằng cơ chế hoạt động của peptides đậu tương là điều chỉnh thu nhận thức ăn bằng cách cảm ứng sự no thông qua việc hoạt hóa các thụ thể opioid và CCK trong ruột [38]

Hiện có khá nhiều nghiên cứu liên quan đến thủy phân protein đậu tương

để thu các peptides ngắn, chủ yếu sử dụng phương pháp nhiệt để thủy phân bằng enzymes Các enzymes proteases thường được sử dụng bao gồm papain, alcalase, bromelain, pancreatin hoặc trypsin, trong đó papain được sử dụng bởi nhiều tác giả [30], [31], [37], [48] Trong quá trình thủy phân các peptides

có axit amin kỵ nước ở đầu N hoặc C được tạo ra và chúng làm cho hydrolysate có vị đắng Để giảm vị đắng, sử dụng aminopeptidase để tách các gốc axit amin kỵ nước ở đầu N, nhưng như vậy sẽ làm tăng hàm lượng axit amin tự do Các phương pháp khác làm giảm vị đắng như hạn chế cơ chất protein, sử dụng các chất để giấu vị đắng, phân đoạn và loại các peptides đắng, polyme hóa, sử dụng các hợp chất bọc… nhưng chúng đều có vấn đề, bao gồm làm mất các chức năng quan trọng của peptides, sản lượng thấp, cần máy móc đặc hiệu và giá thành cao… Việc sử dụng các protease có tính đặc hiệu thấp để tách các gốc axit amin kỵ nước ở đầu N đã được nhiều tác giả nghiên cứu và áp dụng [47], [49], 50] Một số tác giả sử dụng kết hợp với các phương pháp khác để tăng hiệu quả thủy phân protein đậu tương bằng enzymes [17]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠN PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Nguyên liệu

- Hạt của cây kế sữa (Sylibum marianum (L.) Gaernt)

- Bột đâ ̣u tương mịn đã loa ̣i dầu nhâ ̣p khẩu

- Enzyme peptidase

2.1.2 Hoá chất và thiết bi ̣

Ho ́ a chất

- Dung dịch dioxane, acetonitril 70%

- Ethanol 96%, ether dầu, ethanol 85%, methanol

- Diisopropyl ether, aceton

- Dung môi cloroform-aceton-acidformic

- Bình Soxhlet

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

- Silybin chuẩn do hãng SIGMA cung cấp

- Dung dịch A: 0.1% trinitrobenzenesulfonic acid(TNBS) trong nước

- Dung dịch B: 0.2M sodium phosphate buffer pH 8.2

2.2.1 Phương pháp chiết silymarinbằng dung môi hư ̃u cơ

Tiến hành: Ha ̣t kế sữa được xay mi ̣n, lấy mỗi mẫu 30 g bột ha ̣t kế sữa đem chiết với ether dầu bằng Soxhlet trong 6 giờ để loại dầu béo Sau khi để bay hơi hết ether dầu, tiếp tục chiết hồi lưu trên bếp cách thuỷ với 60ml dung môi (methanol hoặc ethanol) x 5 lần x 1giờ Gộp dịch chiết và thu hồi dung

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

môi dưới áp suất thấp đến cặn Tiến hành xác đi ̣nh hàm lượng flavolignan toàn phần trong că ̣n theo phương pháp phổ tử ngoa ̣i để tính hiê ̣u suất chiết

So sánh hiệu suất thu hồi silymarin bằng các phương pháp chiết xuất khác nhau:

- Chiết Soxhlet: 30g bột hạt kế sữa được chiết trên Soxhlet với ether dầu trong 6 giờ để loại dầu béo Sau khi để bay hơi hết ether dầu, dược liệu được chiết tiếp với MeOH trên Soxhlet 10 giờ liên tục Dịch chiết được thu hồi dung môi dưới áp suất thấp đến khi thu được dịch đậm đặc Tủa flavonolignan trong nước Để hỗn hợp trong tủ lạnh qua đêm Sau đó lọc, rửa và sấy tủa ở

500C ở áp suất thường Cân khối lượng tủa và xác định hàm lượng flavonolignan toàn phần trong tủa

- Chiết ngâm trong dung môi: 30g bột hạt kế sữa sau khi loại dầu béo như trên được cho vào bình ngấm kiệt Đổ EtOH 85% ngập dược liệu (300ml), ngâm 48h ở nhiệt độ phòng Rút dịch chiết đồng thời bổ sung dung môi mới, tiến hành chiết đến khi dịch chiết hết màu Tập hợp dịch chiết, thu hồi dung môi dưới áp suất thấp đến dịch đậm đặc, tủa flavonolignan và tiếp tục làm như trên Dịch đậm đặc thu được sấy ở 500C để thu bột silymarrin thô

- Chiết hồi lưu trên bếp cách thuỷ: 30g bột hạt kế sữa sau khi loại dầu béo như trên được chiết hồi lưu trên bếp cách thuỷ với 300ml EtOH 85% x 4 lần x 1 giờ Tập hợp dịch chiết, thu hồi dung môi dưới áp suất thấp đến dịch đậm đặc và tiếp tục làm như trên Dịch đậm đặc thu được sấy ở 500C để thu bột silymarrin thô

2.2.2 Phương pháp HPLC

Chuẩn bị mẫu

200 mg mẫu có chứa silymarin được chiết trong 1ml dung dịch dioxane lắc 2000v/phút 10phút ly tâm 12000v/phút 10 phút thu dịch Dịch mẫu thu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

được được tủa trong nước theo tỷ lệ 1mẫu/5nước Ly tâm 12000v/phút 10 phút thu tủa, lấy tủa hòa lại trong acetonitril 70% lắc 2000v/phút 10phút ly tâm 12000v/phút 10 phút thu dịch Dịch này được đem phân tích HPLC

Mẫu chuẩn là mẫu silybin của hãng Sigma pha trong acetonitril 70% Với những điều kiện chạy HPLC như sau:

- Cột Symmentry C18 (250mm x 4,6mm x 5m)

- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng

- Thể tích bơm mẫu: 10 l

- Pha động: Gradien như sau:

Thời gian (phút) A Nước B Acetonitril Tốc độ dòng (ml/phút)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng axit amin tự do

Hàm lượng axit amin tự do được xác định trên máy phân tích axit amin

tự động HP-Amino Quant Seriese II

2.2.5 Xa ́ c đi ̣nh đô ̣ đô ̣c và hoa ̣t tính của chế phẩm

2.2.5.1 Nghiên cư ́ u tác du ̣ng sinh ho ̣c

Mẫu thư ̉ : Mẫu thử là chế phẩm có chứa silymarin theo công thức sau:

silymarin 50%, Axit amin 2%, Glucose 48%

Liều thư ̉ : Liều dùng cho tất cả các thử nghiê ̣m dược lý là 4-20g

sylymarin/kg cân nặng/ ngày tương đương với 100-500g dược liê ̣u/kg cân

nặng/ ngày

Đô ̣ng vâ ̣t thí nghiê ̣m:

- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống, trọng lượng 20±2g, khỏe

mạnh, do Viê ̣n Vê ̣ sinh di ̣ch tễ Trung ương cung cấp

- Chuột cống trắng chủng wistar, cả hai giống, trọng lượng 90-130g,

mạnh khỏe, do tra ̣i chăn nuôi Ho ̣c viê ̣n Quân y Hà Đông cung cấp

- Chuột lang, nặng 350-550g, khỏe mạnh, cả hai giống, do Trung tâm chăn nuôi Ba Vì, Hà Nô ̣i cung cấp

Thuố c thư ̉ và hóa chất: Các hóa chất và thuốc thử đa ̣t tiêu chuẩn phân

tích theo quy định của Dược điển Việt Nam III Kit định lươ ̣ng hoạt đô ̣ enzyme ALT và bilirubin do hãng Sigma cung cấp

2.2.5.2 Thư ̉ đô ̣c tính cấp

Được thực hiê ̣n ta ̣i Viện Dươ ̣c liê ̣u, theo hướng dẫn khảo sát đô ̣c tính cấp của thuố c do Bộ Y tế ban hành và các tài liê ̣u [1], [4], [14]

Tiến hành thi ́ nghiê ̣m

Chuột nhắt trắng có tro ̣ng lượng 18-22g khỏe ma ̣nh, không phân biê ̣t giố ng, được chia ngẫu nhiên thành các lô Để chuô ̣t nhi ̣n đói 16h trước khi đi thí nghiê ̣m, Dùng kim đầu tù cho chuô ̣t uống thuố c theo mức liều quy đi ̣nh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

cho từ ng lô mỗi lần không quá 2ml/10g thể tro ̣ng, với các liều tăng dần Theo

dõi tình tra ̣ng chung, hoa ̣t đô ̣ng tự nhiên, hô hấp và tiêu hóa của chuô ̣t liên tu ̣c trong 7 ngày sau dùng thuố c Đếm số chuô ̣t chết ở trong lô để xác đi ̣nh liều thấp nhất gây chết 100% và liều cao nhất gây chết 0% Chuô ̣t chết đươ ̣c mổ để đánh giá tổn thương đa ̣i thể Tính LD50 theo phương pháp cải tiến của Litchffield-Wilcoxon

2.2.5.3 Thư ̉ tác du ̣ng bảo vê ̣ gan

Đươ ̣c thử trên mô hình gây tổn thương tế bào gan bằng CCI4 ta ̣i Viện Dươ ̣c liê ̣u theo các tài liê ̣u [9], [11]

Tiến hành thi ́ nghiê ̣m

Thí nghiê ̣m đươ ̣c tiến hành trên chuô ̣t nhắt trắng có tro ̣ng lượng 20-22g Chuột đươ ̣c chia thành 3 lô, mỗi lô 10 con:

- Lô chứa bệnh lý: Tiêm phúc mạc du ̣ng di ̣ch 10% CCI4 trong dầu oliu 2 lần vào ngày thứ 1 và ngày thứ 5 của thí nghiê ̣m với liều 2ml CCI4/20g chuô ̣t

- Lô chứ ng sinh lý: Tiêm dầu oliu cùng thể tích, cùng số lần như lô chứa

bệnh lý

- Lô thử thuốc: gây bê ̣nh như lô chứng bệnh lý, đồng thời cho uống chế phẩm 0,04g/kg thể trọng/ ngày, trong 8 ngày liên tu ̣c

Ngày thứ 8, sau khi cho uống 1,5giờ, lấy máu chuô ̣t để định lươ ̣ng hoa ̣t

đô ̣ enzyme ALT và bilirubin/ huyết thanh Phép đo được thực hiê ̣n trên máy

đi ̣nh lươ ̣ng sinh hóa

Chỉ tiêu đánh giá: Tác du ̣ng bảo vê ̣ gan của thuố c đươ ̣c biểu thi ̣ bằng đô ̣ giảm hoa ̣t đô ̣ enzyme ALT và hàm lượng bilirubin huyết thanh của lô chuô ̣t gây bệnh đươ ̣c điều tri ̣ bằng thuố c so với lô chứng bê ̣nh lý

2.2.5.4 Thư ̉ tác du ̣ng lơ ̣i mâ ̣t

Đươ ̣c thử trên chuô ̣t lang theo phương pháp Turner R.A [46] Ta ̣i phòng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Công nghệ Sinh ho ̣c- Viện Hóa Sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam

Tiến ha ̀nh thí nghiê ̣m

Thí nghiê ̣m đươ ̣c thực hiê ̣n trên chuô ̣t lang có tro ̣ng lươ ̣ng 350-550g Chuột được gây mê bằng cách tiêm phú c ma ̣c rethan 10% (1ml/100g chuô ̣t) Sau khi chuột mê, cố định chuô ̣t trên bàn mổ, rạch mô ̣t đường ở giữa bu ̣ng từ

mũi ức xuống một đoa ̣n 2cm Bộc lô ̣ ống mâ ̣t chủ, luồn ống dẫn lưu mâ ̣t vào

đó rồi buộc lại Đặt mô ̣t kim trực tiếp vào tá tràng để bơm thuốc vào tá tràng Sau đó khâu ổ bụng lại Lượng mâ ̣t chảy ra được hứng vào ống nghiê ̣m và đo chính xác trong khoảng thời gian 30 phút một lần Sau 1 giờ để cho lượng mật chảy đều, bơm thuốc trực tiếp vào tá tràng với liều 4g Silymarin/kg thể tro ̣ng

Lô chứng thay chất nghiên cứ u bằng dung di ̣ch NaCl 0,9% với cùng thể tích

- Các mẫu mâ ̣t sau khi thu đươ ̣c, đo thể tích bằng pipet chính xác Lưu lươ ̣ng mật đươ ̣c tính bằng số ml mật thu đươ ̣c trong 30 phút cho 100g chuô ̣t

- Xác đi ̣nh hàm lượng cắn khô của mâ ̣t bằng cách đong chính xác 1ml

di ̣ch mật, sấy khô ở 600C cho tớ i khố i lượng không đổi

- Đi ̣nh lươ ̣ng bilirubin có trong các mẫu mâ ̣t trước và sau khi bơm thuốc bằng phương pháp so màu với thuốc thử 2-4 dichlranilin trên máy định lươ ̣ng sinh hó a bán tự động Scout

- Chỉ tiêu đánh giá: Tác dụng lơ ̣i mâ ̣t của thuố c đươ ̣c biểu thi ̣ bằng đô ̣ tăng lưu lươ ̣ng mâ ̣t sau khi bơm thuốc và so với lô đối chứng

2.2.6 Phương pha ́ p xử lý số liê ̣u

Các số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê theo phương pháp thống

kê sinh học, sử du ̣ng công cụ Data analysis Microsoft Exel [3] Kết quả thí nghiệm được biểu thi ̣ bằng tri ̣ số trung bình cô ̣ng/trừ sai số chuẩn (M±SE) Đánh giá, so sánh thống kê giữa các lô thí nghiê ̣m bằng nghiệm pháp t-Studen