Đồ án Lên men ethanol với vi khuẩn Zymomonas mobilis

Hình 4 thể hiện kết quả tóm tắt về sự sinh trưởng của Zymomonas trong môi trường rắn tiêu chuẩn với nhiều thuốc nhuộm khác nhau khảo sát trên 41 chủng thuộc loài Z.. Sản phẩm phụ là acid

MỤC LỤC

Trang

Phần thứ nhất : Tình hình sản xuất và sử dụng ethanol trên thế giới 3

Phần thứ hai : Lên men ethanol với vi khuẩn Zymomonas mobilis 6

Chương 1 : Giới thiệu về loài vi khuẩn Zymomonas mobilis 6

1 Sự xuất hiện của Zymomonas 6

2 Lịch sử phân lập 8

3 Đặc điểm nhận dạng 9

4 Danh pháp Zymomonas mobilis 10

5 Hình thái 11

6 Sinh lý 11

6.1 Một số môi trường thông dụng 12

6.2 Điều kiện sinh trưởng 13

Chương 2 : Cơ chế chuyển hóa đường thành ethanol với Z mobilis 18

1 Con đường Entner – Doudoroff (KDPG) 19

2 Sự hình thành các sản phẩm phụ 25

3 Một số kỹ thuật di truyền trên Zymomonas mobilis 29

Chương 3 : Phương pháp lên men ethanol với Z mobilis 33

1 Động học của quá trình lên men 33

2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 35

2.1 Aûnh hưởng của nồng độ đường ban đầu 35

2.2 Aûnh hưởng của cơ chất 36

2.2.1.Cơ chất là hexose (glucose và fructose) 36

2.2.2 Cơ chất là hỗn hợp glucose và xylose 37

2.2.3 Cơ chất là arabinose 41

2.3 Aûnh hưởng của các môi trường khác nhau 42

2.4 Aûnh hưởng của nồng độ glucose 46

2.5 Aûnh hưởng của pH ban đầu 46

2.6 Aûnh hưởng cuả ion Na+ và Cl- 47

2.7 Aûnh hưởng của nhiệt độ 49

2.8 Aûnh hưởng của môi trường kỵ khí 49

2.9 Aûnh hưởng của Fufural 50

2.10 Aûnh hưởng của các thành phần nitơ, kali, photpho 52

2.11 Aûnh hưởng của nồng độ ethanol 52

2.12 Aûnh hưởng của việc bổ sung ethanol 55

3 Phương pháp thực hiện 55

3.1 Vi khuẩn tự do 55

3.1.1 Lên men gián đoạn 56

3.1.2 Lên men liên tục 56

3.1.3 Lên men bán liên tục 60

3.2 Vi khuẩn cố định 61

3.2.1 Lên men gián đoạn 61

3.2.2 Lên men liên tục cố định tế bào trong cấu trúc ion gel 61

3.2.3 Lên men liên tục cố định tế bào trong cấu trúc non- covalent gel 63

3.2.4 Lên men liên tục – cố định tế bào trong cấu trúc cryogel 64

3.2.5 Lên men liên tục cố định tế bào bằng phương pháp hấp phụ 66

4 Ứng dụng lên men ethanol trong sản xuất công nghiệp 69

4.1 Sản xuất ethanol từ bã mía với Z mobilis 71

4.2 Sản xuất ethanol từ dịch thủy phân tinh bột với Z mobilis 72

Chương 4 : So sánh lên men ethanol với nấm men Saccharomyces cerevisiae và lên men ethanol với vi khuẩn Z mobilis 76

1 Lên men với S cerevisiae 76

2 Lên men với Z mobilis 77

3 So sánh lên men Z mobilis với S cerevisiae 78

4 So sánh lên men Z mobilis với các chủng vi sinh vật khác 84

Kết luận 85

Tài liệu tham khảo 86

Phần thứ nhất : TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ SỬ DỤNG

ETHANOL TRÊN THẾ GIỚI

“Ethanol, rượu etylic…” Những tên gọi từ rất lâu đã trở nên quen thuộc vớimọi người, trong đời sống cũng như trong sản xuất Vị cay nồng, hương thơm đặctrưng của ethanol đã được con người biết tới và vận dụng rất nhiều trong việc tạonên nhiều sản phẩm đồ uống, trong số đó thậm chí có những sản phẩm đã trở nêngắn liền với giá trị tinh thần của một cộng đồng, một quốc gia

Không dừng ở đó, với sự phát triển ngày càng to lớn của các ngành côngnghiệp hóa chất, công nghiệp hữu cơ… ethanol lại càng được con người tin dùnglàm một dung môi phổ biến, hữu dụng và ít độc hại

Khi nền công nghiệp tiếp tục sản xuất ra hàng hóa và cung cấp dịch vụ,người ta càng quan tâm nhiều hơn việc mở rộng phạm vi sử dụng cho các nguồnnăng lượng Việc giá cả gia tăng và không ổn định của thị trường dầu mỏ thế giớiđã thúc đẩy các nhà khoa học nghiên cứu sản xuất ra nhiên liệu thay thế làethanol

Thu nhận ethanol từ sinh khối là phương pháp hiệu quả để xúc tiến về nguồnnhiên liệu Việc chiết tách ethanol tự nhiên mang lại nguồn nhiên liệu có chấtlượng tốt với giá cả “kinh tế”

Gần đây, ethanol đã trở thành một phần của thị trường khí đốt Mỹ Việcsản xuất ethanol không những giảm sự phụ thuộc của Mỹ vào nguồn dầu mỏ nhậpkhẩu mà còn khuyến khích quốc gia này tập trung vào sản xuất ethanol như làmột nguồn nhiên liệu thay thế Ethanol có thể chịu được sự nén hơn xăng Sử dụngnhiên liệu ethanol còn góp phần giảm ô nhiễm môi trường, CO2 giải phóng ra cóthể tái sử dụng nhờ con đường quang hợp

Và một lần nữa, ethanol lại trở thành tâm điểm của mọi sự chú ý bởi vì nóđáp ứng khá tốt các mong đợi của những nhà nghiên cứu Đây chính là lý do tạisao việc sản xuất ethanol không ngừng mở rộng, các phương pháp cũng như quytrình sản xuất ngày càng được nâng cao và hoàn thiện

Thị trường nhiên liệu ethanol sẽ gia tăng một cách đáng kể trong tương laigần do EU và các tổ chức quốc tế khác đang khuyến khích sử dụng nguồn nhiênliệu sinh học trong các phương tiện vào việc vận chuyển Sử dụng nguồn nănglượng tái sử dụng sẽ góp phần quan trọng giảm lượng CO2 thải ra, do đó thúc đẩy

chuyển thành sản phẩm có giá trị và làm giảm sự phụ thuộc của con người vàonhiên liệu hóa thạch.

 Lợi ích từ ethanol sinh học (cồn sinh học)

 Là nguồn nhiên liệu có thể tái sử dụng

 Ethanol cháy sinh ra năng lượng lớn nhưng ít gây ô nhiễm

 Giảm lượng CO2 thải ra

 Ethanol có khả năng chống kích nổ cao

 Có thể sản xuất trên quy mô lớn và không cạn kiệt

 An toàn về năng lượng : ít phụ thuộc vào nguyên liệu dầu thô

 Mở rộng thị trường cho nền nông nghiệp

Hình 1 : Sản lượng ethanol trên thế giới

Ethanol thường được sử dụng ở dạng hỗn hợp 10% ethanol và 90% xăng dầu(Daishou, 2004) Khoảng 90% lượng ethanol hiện nay được sản xuất từ đường vàcác loại củ có chứa tinh bột, phần còn lại được sản xuất bằng phương pháp tổnghợp

Thị trường sản xuất ethanol trên thế giới chủ yếu tập trung ở Brazil và Anh,chiếm 62% sản lượng thế giới (Hamelinck và cộng sự, 2005) Các sản phẩm nôngnghiệp đa dạng được sử dụng như một nguồn nguyên vật liệu thô như : mía (chủ

Mỹ : 20 tỷ lít/nămChâu Á : 5.5 tỷ lít/nămChâu Âu : 4.7 tỷ lít/nămChâu Úc : 0.2 tỷ lít/nămBrazil : 13.5 tỷ lít/năm

yếu ở Brazil, Ấn Độ, Thái Lan), bắp ngọt (Anh, Trung Quốc), lúa mì (Pháp,Canada, Thụy Điển), khoai mì (Thái Lan) …và hiệu suất ethanol cũng thay đổitrong một giới hạn rộng phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu sử dụng (FIBGE, 2001).

Yêu cầu quan trọng cho một chủng vi sinh vật hiệu quả là có thể lên mennhiều loại đường khác nhau từ các cấu trúc thực vật để sản xuất ethanol Ban đầu,các nhà khoa học sử dụng nấm men lên men cellulose trong thực vật, tuy nhiênnấm men chỉ sử dụng được 2 trong 3 hợp chất của cellulose Năm 1994, chủng vi

khuẩn Zymomonas mobilis đã được phát hiện ra trong trái cây, một loại vi khuẩn

mà có thể lên men được cả 3 hợp chất của cellulose

Hiện nay nhiều loài vi sinh vật có khả năng lên men ethanol nhưng nấm

men Saccharomyces cerevisiae và vi khuẩn Zymomonas mobilis là hai ứng cử viên tốt nhất trong công nghiệp sản xuất ethanol Z mobilis trội hơn nấm men ở

khả năng chịu được nồng độ đường cao, từ đó khuyến khích các nhà nghiên cứu

tập trung khai thác khả năng của Z mobilis trong việc sử dụng sucrose, glucose,

và fructose nhờ con đường trao đổi chất Entner – Doudoroff

Phần thứ hai : LÊN MEN ETHANOL VỚI VI KHUẨN

ZYMOMONAS MOBILIS

Chương 1

Giới thiệu về loài vi khuẩn Zymomonas mobilis



1 Sự xuất hiện của Zymomonas

Rượu táo và rượu lê

Vào đầu thế kỷ 20, nhu cầu của người tiêu dùng về rượu táo đã thay đổi Họyêu cầu rượu táo phải trong, ngọt thay vì chát đắng và đục như trước Các nhà sảnxuất gặp phải khó khăn lớn, đó là rượu táo ngọt dễ dẫn đến hiện tượng lên menlần hai, tức là “bệnh rượu táo”

Triệu chứng đầu tiên là sự thối hỏng và sự thoát khí Vài ngày sau đó, ápsuất khí trong chai tăng vọt làm nổ chai Sự phát triển của một loài vi khuẩn đãlàm thay đổi mùi hương và làm giảm vị ngọt của rượu táo Rượu táo trở nên đục,sền sệt và sau đó trở nên trong hơn do có sự kết lắng Một vài yếu tố dễ dẫn đếnbệnh rượu táo như : độ acid thấp, hàm lượng đường dư và nhiệt độ tồn trữ cao

Barker và Hiller đã phân lập giống vi khuẩn trên vào năm 1911 và gọi chúnglà giống A Chúng lên men glucose và fructose mạnh mẽ tạo thành ethanol và CO2nhưng không lên men được đường sucrose, maltose và lactose

Năm 1943, Barker đã nghiên cứu và phân lập ra hai giống vi khuẩn từ nhữngmẫu rượu táo bị bệnh, đến năm 1948 ông đặt tên chúng là giống B và giống C.Trong khi giống B và C chỉ tạo nên mùi hương dịu cho rượu táo thì giống A lại tạo

ra mùi hương đặc trưng mạnh mẽ

Năm 1950, Millis đã phân lập được 33 giống vi khuẩn từ rượu táo và rượu lê,trong đó có 27 giống là tương tự giống B và 6 giống là tương tự giống C Millis đãtiến hành xác định vài đặc tính hóa sinh của một giống từ rượu táo và một giống từrượu lê Cả 2 giống này đều tạo ra xấp xỉ 1.87 mol ethanol, CO2, H2S, acetaldehydvà acid lactic ứng với mỗi mol glucose

Millis còn nghiên cứu những biến đổi trong các mẫu rượu táo với sự có mặtcủa nấm men rượu táo bị bệnh trong quá trình lên men bởi nấm men Ông thấynấm men ban đầu giảm dần khi vi khuẩn gây bệnh rượu táo phát triển nhưng sauđó lại tăng trở lại sau ngày thứ 45

Để ngăn chặn sự phát triển của bệnh rượu táo, Barker và Hiller đề nghị rượutáo phải có độ acid cao và nhiệt độ tồn trữ thấp Còn Grove lại đề nghị nên bổsung vào rượu táo (vốn có vị cay, chua gắt) acid tartaric hoặc nấm men bia Barkerđã đề nghị chế độ thanh trùng rượu táo là 60oC.

Carr cho rằng sự hư hỏng của rượu táo giống hiện tượng “framboisé” ở

Pháp gây nên bởi Z anaerobia Còn Guittoneau và cộng sự tìm thấy mùi trái cây

và vị rượu táo “framboisé” nhờ vào nồng độ acetaldehyd cao Bidan đã phân lậpđược vi khuẩn lactic và vi khuẩn acetic từ rượu táo “framboisé” Ông cho rằng sựtạo thành hơn 100mg acetaldehyd cho mỗi lít rượu táo là do nhiều chủng vi sinhvật gây nên Nhưng theo quan điểm của Auclair, hiện tượng “framboisé” của rượutáo là do điều kiện kỵ khí bắt buộc và giá trị pH thấp của rượu táo gây ra Pollardlại cho rằng hiện tượng “framboisé” này là kết quả lên men của 2 giống: vi khuẩn

kỵ khí gây bệnh rượu táo Zymomonas và vi khuẩn hiếu khí acid acetic.

Lên men nhựa cây thùa (Agave sap)

Hình 2 : Cây thùa Hình 3 : Rượu thùa (Pulque)

Từ năm 1923 đến 1924, khi sống ở Mexico, Lindner đã nghiên cứu lên menaguamiel Aguamiel là một loại nhựa của cây thùa, nó được sử dụng để lên menrượu thùa, một loại thức uống có cồn chứa khoảng 4 – 6% ethanol Lindner đãkhám phá ra rằng chủng vi sinh vật gây lên men là một giống vi khuẩn mà ông đặt

tên là Termobacterium mobile, ngày nay là một chủng thuộc Zymomonas mobilis.

Bia

Shimwell đã phân lập được Zymomonas lần đầu tiên từ bia, từ bề mặt sân

phơi nấm men bia và từ những bàn chải của các thiết bị rửa thùng bia Gần đây,

người ta thấy rằng Zymomonas là nguồn gây ô nhiễm nghiêm trọng trong sản xuất bia Trong những thùng hoặc két bia, sự nhiễm Zymomonas xảy ra do môi trường

kỵ khí và sự có mặt của các hợp chất đường có trong bia Vi khuẩn này tạo ra dungdịch nhớt và mùi táo thối do sự hình thành acetaldehyd và khí H2S Khi thời tiếtấm áp, sự hư hỏng chỉ xảy ra trong vòng từ 2 – 3 ngày Vì vậy, Harrison đã phát

biểu rằng Zymomonas là một giống vi sinh vật quan trọng rất phổ biến gây nên sự

phá hủy trầm trọng những két bia lớn với tốc độ cực nhanh ở các nhà máy bia Tuynhiên, hiện tượng này lại không xảy ra ở các loại bia nhẹ như bia Đức.

Lên men nhựa cây cọ

Rượu vang cọ là một thức uống có cồn phổ biến ở vùng nhiệt đới từ sự lênmen tự phát từ thành phần nhựa của cây Rượu vang cọ chứa khá nhiều chủng vi

sinh vật phức tạp, trong đó Zymomonas là một giống vi khuẩn quan trọng không

thể thiếu Chúng giúp lên men cồn và tạo bọt cho rượu nhờ sự hình thành khí CO2

CO2cùng với một lượng nhỏ acid lactic và acid acetic góp phần làm tăng độ acidcủa loại rượu vang này Bên cạnh đó, mùi và vị của rượu vang cọ cũng chịu ảnh

hưởng bởi thành phần acetaldehyd và mùi trái cây đặc trưng do Zymomonas gây

nên

Giống Zymomonas này rất thích nghi với môi trường giàu chất dinh dưỡng của nhựa cây cọ do có chứa sucrose, glucose, fructose, acid amin Zymomonas có

thể chịu được nồng độ cồn cao và pH thấp trong điều kiện yếm khí

Lên men nước mía

Gongalves de Lima và cộng sự đã phân lập Zymomonas từ quá trình lên

men nước mía, loại mía này được trồng ở miền Bắc Brazil

Mật ong chín

Ruiz-Argueso và Rodriguez-Navarro đã phân lập Zymomonas từ mật ong

chín hoặc từ con ong Hai giống vi sinh vật chủ yếu có trong mật ong chín là

Gluconobacter và Lactobacillus.

2 Lịch sử phân lập

Bảng 1 : Một số nguồn phân lập Z mobilis

Nguồn phân lập Môi trường Điều kiện, kết quả Tác giả

Hèm bia Thạch gelatin Xuất hiện khuẩn lạc sau

11 ngày ở 22oC

Barker và Hillier,1912Bia tiệt trùng Thạch agar

Dịch nước táo

Môi trường lỏng(1% chất chiết men,0.001% actidione)

Khuẩn lạc sau 4 -5 ngày

ở 30oC có dạng hình hạtđậu, đường kính từ 1 –4mm, màu xanh sậm

Swings và Deley,1974

3 Đặc điểm nhận dạng

­ Là một loại vi khuẩn gram âm, có roi dài từ 1 – 1.4µm

­ Không hình thành bào tử

­ Một số loài có từ 1 -4 tiên mao

­ Không phát triển trên môi trường thạch hoặc nước thịt dinh dưỡng

­ Là loài vi khuẩn vi hiếu khí (kỵ khí không bắt buộc)

­ Có thể lên men đường glucose và fructose

­ Tạo ra số mol ethanol và CO2 bằng nhau

­ Số lượng nucleotide: 2056416

­ Số gen : 1998

­ Số gen ARN: 60

­ Chứa khoảng 47.5 – 49.5% guanine và cytosine (G+C)

Hình 4 : Vi khuẩn Zymomonas mobilis

Thành phần môi trường thích hợp để phát hiện vi khuẩn (tính theo phần trămkhối lượng / thể tích) gồm :

Sự có mặt của Zymomonas được nhận biết khi có khí bay lên ở 25 – 30oCsau 2 – 6 ngày Kết quả dương tính có thể là do những vi khuẩn hoặc một vài nấmmen dại, cho nên cần phải có thuốc nhuộm màu gram, có thể sử dụng phương phápnhuộm màu miễn dịch huỳnh quang có độ nhạy phát hiện 160 – 2500 tế bào/ ml

4 Danh pháp Zymomonas mobilis

Một khóa phân loại cho giống vi khuẩn này cần dựa trên hệ thống phân tíchcác dữ liệu về kiểu hình, phân tích thành phần các cặp base nitơ trong chuỗi ADN,mức độ liên quan giữa các bộ gen (ADN tương đồng), sự giống nhau về phổ sắc kýprotein, phổ hồng ngoại của những tế bào nguyên…

Giống : Zymomonas (Kluyver và van Niel, 1936)

Loài : Zymomonas mobilis (Kluyver và van Niel, 1936)

Họ : Sphingomonadaceae

Bộ : Sphingomonadales

Lớp: Proteobacteria; Alphaproteobacteria

 Loài phụ Zymomonas mobilis subsp mobilis (Kluyver và van Niel, 1936;

De Ley và Swings, 1976)

Chủng tiêu biểu : ATCC 10988 (còn có các tên khác như NCIB 8938, NNRLB-806, DSM 424, IMG 1655, L192) (Phòng nghiên cứu vi sinh vật, Đại học Delft).Chủng tiêu biểu về kiểu hình : Z6 (còn có các tên khác như ATCC, 29191,NCIB 11199)

 Loài phụ Zymomonas mobilis subsp pomaceae (Millis, 1951 – 1956; De

Ley và Swings, 1976)

Chủng tiêu biểu : ATCC 29192 (còn có tên khác như NCIB 11200) (Barker,1948)

Bảng 2 : Danh pháp một số chủng thuộc loài Z.mobilis đại diện hiện nay

5 Hình thái

5.1 Hình thái tế bào vi khuẩn :

­ Zymomonas mobilis là loài vi khuẩn gram âm, hình que, kích thước 1.4 –

2.0 4.0 – 5.0 µm, thường xếp thành đôi, đôi khi xếp thành hình chuỗi ngắn

­ Có roi vận chuyển dài từ 2 - 6µm, dày 1 – 1.5µm

­ Hầu hết đều không chuyển động, một số ít có khả năng chuyển động nhờcó từ 1 – 4 tiên mao

5.2 Hình dạng khuẩn lạc :

Trong môi trường rắn tiêu chuẩn (gồm 2% agar, 0.5% dịch chiết men, 2%glucose), khuẩn lạc có hình hạt đậu, đều, mép đồng nhất, màu trắng hoặc kem,đường kính khuẩn lạc có thể đạt từ 1 -2mm sau 2 ngày Trên bề mặt môi trườngyếm khí, khuẩn lạc lan tỏa rộng, dạng lồi, đường kính từ 3 -4 mm

5.3 Thành phần hóa học của tế bào :

Bảng 3 : Thành phần cấu tạo của tế bào vi khuẩn Zymomonas

Thành phần Hàm lượng (theo chất khô)

1 – 5  g/mg

0 – 0.4  g/mg

6 Sinh lý

6.1 Một số môi trường thông dụng cho sự sinh trưởng của Zymomonas

Môi trường lỏng tiêu chuẩn : gồm 0.5% dịch chiết men, 2% glucose Trong môitrường lỏng tiêu chuẩn, người ta quan sát thấy có sự sinh trưởng tốt của

Zymomonas và sự thoát khí sau 24 giờ.

– Môi trường rắn tiêu chuẩn : có thành phần như trên, bổ sung thêm 2%

agar Giống Zymomonas nên được cấy chuyền 2 – 3 tuần một lần.

– Môi trường nước táo gồm : dịch nước táo,1% dịch chiết nấm men (Difco),10% gelatin, pH = 5.5 được chứa trong chai có nắp ren Ta có thể quan sát đượckhuẩn lạc trong vòng 17 tuần

– Môi trường bia gồm : dịch bia có 2% glucose, nên cấy chuyền giống hằngtuần Để giữ giống, ta có thể cố định vi khuẩn trong chất mang là gelatin trongdịch bia (Shimwell, 1950)

– Môi trường MYPG : bao gồm 0.3% dịch chiết malt, 0.3% dịch chiết men,0.5% pepton, 2% glucose và 2% agar

Môi trường tổng hợp : gồm 2% glucose, 0.1% K2HPO4, 0.1% (NH4)2S50, và0.05% MgSO4.7H20 trong nước máy (Kluyver và Hoppenbrouwersm) Tuy nhiên

Zymomonas không thể sinh trưởng trong những môi trường tổng hợp đơn giản,

chúng yêu cầu phải có sự cung cấp nguồn nitơ hữu cơ hoặc bổ sung thêm vài yếutố sinh trưởng khác như các vitamin sau : -aminobenzoic acid, biotin, folic acid,cyanocobalamin, lipoic acid, nicotinic acid, pyridoxine, thiamine, riboflavin (1 µg/ml), guanine, adenine, hypoxanthine, cytosine và uracil (60 µg/ ml) (Van Pee vàcộng sự, 1974)

– Môi trường do Gibbs và Demoss tạo ra gồm : 98ml dung dịch 1% glucose,1% tryptone, 1% dịch chiết men (Difco), 0.5% KH2PO4 cùng với 2 ml dung dịchmuối 0.8% MgSO4.7H20, 0.16% MnSO4.4H20, 0.04% NaCl và 0.04% FeSO4 7H20(Gibbs và Demoss,1951)

Zymomonas có thể phát triển ở 25 – 30oC Hầu hết các nhà nghiên cứu

thích nuôi cấy Zymomonas trong điều kiện yếm khí, nhưng điều kiện này chỉ cần

thiết cho sự nuôi cấy trên bề mặt thạch nghiêng hoặc trên đĩa Petri

Bên cạnh đó, Zymomonas không sinh trưởng và phát triển trong các môi

trường sau :

 Môi trường có chứa 0.5% chất chiết men

 Môi trường bia

 Môi trường bia + 0.5% chất chiết men

 Môi trường pepton nước luộc thịt

 Môi trường pepton nước luộc thịt+ 0.5% chất chiết men

 Môi trường nước thịt dinh dưỡng (hoặc thạch dinh dưỡng)

 Môi trường nước thịt dinh dưỡng (hoặc thạch dinh dưỡng) + 0.5% chấtchiết men

6.2 Điều kiện sinh trưởng :

6.2.1 Sinh trưởng ở các giá trị pH khác nhau

Sự sinh trưởng của Zymomonas phụ thuộc vào giá trị pH được thể hiện như sau :

pH = 2.5 – 3.4 : ngừng sinh trưởng

pH = 3.5 – 3.6 : sinh trưởng kém

pH = 3.5 – 7.5 : sinh trưởng tốt

Kết quả trên đã chứng minh rằng khả năng khả năng chịu được pH acid là

đặc trưng điển hình của Zymomonas Điều này cũng không gây ngạc nhiên vì

trong tự nhiên, loài vi khuẩn này có thể sống trong môi trường rượu vang cọ, rượutáo có pH < 4

Bảng 4 : Sự sinh trưởng của Zymomonas trong môi trường lỏng tiêu chuẩn ứng với

những giá trị pH ban đầu khác nhau

(Khảo sát trên 41 chủng thuộc loài Z mobilis - Swings và De Ley, 1977)

pH ban đầu % số chủng sinh trưởng

3.053.53.73.85

5 – 77.508.0

0437190100870

6.2.2 Sinh trưởng ở các giá trị nhiệt độ khác nhau

Qua nhiều nghiên cứu, người ta nhận thấy sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự

sinh trưởng của Zymomonas như sau :

Nhiệt độ < 30oC : ngừng sinh trưởng

Nhiệt độ = 40oC : sinh trưởng kém

Nhiệt độ  30oC : cả hai loài Zymomonas pomaceae và Z mobilis đều sinh trưởng tốt Riêng loài Zymomonas pomaceae rất nhạy cảm với nhiệt, không thể

sinh trưởng ở 34oC

Bên cạnh đó, các nhà khoa học còn rút ra một số kết luận về ảnh hưởng củanhiệt độ đến sự lên men :

Nhiệt độ 4 -5oC sau 28 ngày : không thấy dấu hiệu của sự lên men

Nhiệt độ 14 – 18oC : sự lên men xảy ra sau 4 ngày

Nhiệt độ phòng 16 – 26oC : sự lên men xảy ra sau 2 ngày

Vậy khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự lên men là 25 – 31oC

Bảng 5 : Sự sinh trưởng của Zymomonas trong môi trường lỏng tiêu chuẩn ứng với

những giá trị nhiệt độ nuôi cấy khác nhau

(Khảo sát trên 41 chủng Z mobilis - Swings và De Ley, 1977)

Nhiệt độ nuôi cấy ( o C) % số chủng sinh trưởng

3034363840

1009797745

Zymomonas bị tiêu diệt ở 60oC trong vòng 5 phút Grove (1914) lại cho rằng vikhuẩn gây bệnh rượu táo bị tiêu diệt ở 55oC trong 5phút

6.2.3 Sinh trưởng với sự hiện diện của ethanol

Z mobilis có khả năng chịu được cồn, vì vậy nó được phân lập từ thức uống

có cồn với nồng độ ethanol 2 – 10% Z mobilis có thể chịu được nồng độ ethanol

là 5.5% trong môi trường lỏng tiêu chuẩn Tuy nhiên, sự sinh trưởng của loài vikhuẩn gây bệnh rượu táo lại bị kìm hãm bởi nồng độ ethanol là 6.5%

Ở nồng độ ethanol 7% có 73% chủng thuộc loài Z mobilis sinh trưởng, còn với nồng độ ethanol 10% thì có 47% số chủng Z mobilis sinh trưởng (khảo sát trên

41 chủng thuộc loài Z mobilis - Swings và De Ley, 1977).

6.2.4 Sinh trưởng ở nồng độ glucose cao

Kluyver và Hoppenbrouwers (1931) thấy rằng các chủng Z mobilis trong

rượu thùa có thể sinh trưởng ở môi trường có 25% glucose

Khảo sát trên 41 chủng thuộc loài Z mobilis (Swings và De Ley, 1977) cho thấy :

o Với nồng độ glucose là 20% có 100% số chủng thuộc loài Z mobilis sinh

trưởng trong 34 giờ

o Với nồng độ glucose là 30% có 88% số chủng thuộc loài Z mobilis sinh

trưởng trong 2 – 5 ngày, riêng chủng Z1 và Z2 sinh trưởng chỉ trong vòng 1ngày

o Với nồng độ glucose là 40% có 54% số chủng thuộc loài Z mobilis sinh

trưởng sau pha lag, kéo dài từ 4 – 20 ngày

6.2.5 Sinh trưởng với sự hiện diện của KCN

Nếu dùng canh trường lỏng tiêu chuẩn có chứa 0.0075% KCN thì người ta

thấy các chủng Z mobilis ATCC 29192, NCIB 8777, NCIB 10065, CP3, CP4 và

Ag 11 không sinh trưởng, còn các chủng Zymomonas mobilis ATCC 10988, 410,

NCIB 8227, và 409 thì sinh trưởng sau 5 ngày và 12 chủng khác thì không bị kìm

hãm bởi nồng độ KCN và có thể phát triển sau 1 – 2 ngày (khảo sát trên 41 chủng

thuộc loài Z mobilis - Swings và De Ley, 1977).

6.2.6 Sinh trưởng với sự hiện diện của NaCl

Trong canh trường lỏng tiêu chuẩn có chứa 0.5% NaCl người ta thấy chỉ có

2 chủng Z mobilis var.pomaceae ATCC 29192 và NCIB 8777 là không sinh trưởng, 71% số chủng Z mobilis đều có thể sinh trưởng với nồng độ NaCl 1%, nhưng không có chủng Zymomonas nào có thể sinh trưởng ở nồng độ NaCl 2% (khảo sát trên 41 chủng Z mobilis - Swings và De Ley, 1977).

Grove (1923) đã tìm ra rằng vi khuẩn gây bệnh rượu táo bị kìm hãm bởinồng độ 0.7% NaCl

6.2.7 Sinh trưởng với sự hiện diện của 0.01% Acti-dione

Chất kháng sinh này là thành phần của môi trường Difco dùng cho sự phân

lập Zymomonas Millis đã bổ sung Acti-dione (cycloheximide) vào môi trường

nước táo phân lập

Người ta thấy rằng nấm mốc thì nhạy cảm với 0.01% Acti-dione, còn vi

khuẩn thì không Tất cả các chủng thuộc loài Z mobilis đều có thể sinh trưởng trong vòng 4 ngày (khảo sát trên 41 chủng thuộc loài Z mobilis - Swings và De

Ley, 1977)

6.2.8 Sinh trưởng với sự hiện diện của 0.01% thallium acetate

Trong môi trường rắn tiêu chuẩn, sự sinh trưởng của Z mobilis bị kìm hãm.

6.2.9 Sinh trưởng với sự hiện diện của 0.001% cadmium sulfate

Trong môi trường chứa 0.001% cadmium sulfate có 63% số chủng thuộc

loài Z mobilis sinh trưởng được (khảo sát trên 41 chủng thuộc loài Z mobilis

-Swings và De Ley, 1977)

6.2.10 Sinh trưởng với sự hiện diện của oxgall

Trong tổng số 17 chủng nghiên cứu thuộc loài Z mobilis chỉ có

Zymomonas ATCC 10988 và loài phụ 410 của nó là có thể phát triển trong môi

trường có nồng độ 0.2% oxgall Ở nồng độ 1% oxgall, cả 2 chủng này đều bị kìmhãm

Zymomonas có khả năng chịu được nồng độ oxgall cao hơn trong môi

trường rắn Với môi trường rắn có nồng độ oxgall 0.2%, tất cả các chủng thuộc

loài Z mobilis đều có thể sinh trưởng, ngoại trừ chủng Zymomonas pomaceae

ATCC 29192, còn ở nồng độ oxgall 1% thì có 53% số chủng nghiên cứu phát triển.Có 41% số chủng phát triển sau từ 2 đến 9 ngày ở nồng độ 1.5% oxgall (Swings và

De Ley, 1977)

6.2.11 Sinh trưởng với sự hiện diện của nhân tố vibriostatic 0/129

Kết quả nghiên cứu cho thấy tất cả các chủng Z mobilis đều nhạy cảm với

hợp chất 0/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropylpteridine) trong môi trường rắn tiêu

chuẩn (khảo sát trên 41 chủng Z mobilis - Swings và De Ley, 1977).

6.2.12 Sinh trưởng với sự hiện diện của thuốc nhuộm

Kết quả nghiên cứu cho thấy Zymomonas rất nhạy cảm với thuốc nhuộm Hình 4 thể hiện kết quả tóm tắt về sự sinh trưởng của Zymomonas trong môi

trường rắn tiêu chuẩn với nhiều thuốc nhuộm khác nhau (khảo sát trên 41 chủng

thuộc loài Z mobilis - Swings và De Ley, 1977).

Sự kìm hãm sinh trưởng của một vài chủng Z mobilis bởi thuốc nhuộm còn

phụ thuộc vào môi trường sử dụng là rắn hay lỏng Chủng VP2 có khả năng khángcự mạnh mẽ với thuốc nhuộm Nhìn chung, tất cả các chủng đều nhạy cảm vớibrilliant green

Malachite green được sử dụng với nồng độ là 0.025% trong môi trườngphân lập Tuy nhiên, với loại thuốc nhuộm này, người ta thấy rằng thậm chí vớinồng độ 0.0005% vẫn có một vài chủng không thể phát triển, vì thế không nên bổsung malachite green vào môi trường phân lập chủng vi sinh vật này (Millis,1951)

6.2.13 Sinh trưởng với sự hiện diện của một số chất kháng sinh

Các nghiên cứu được tiến hành trên môi trường rắn tiêu chuẩn có sử dụngdịch chiết nấm men (Difco) hoặc chất kháng sinh Oxoid Hình 5 biểu hiện khảnăng nhạy cảm cũng như khả năng kháng cự với 20 loại chất kháng sinh của 38

chủng thuộc giống Zymomonas.

Chủng 70.7 thể hiện khả năng nhạy cảm mạnh nhất – bị kìm hãm bởi 11loại chất kháng sinh Còn chủng VP2 như đã đề cập trên thì lại có khả năng khángcự mạnh mẽ hơn, chỉ bị kìm hãm bởi 5 loại chất kháng sinh (Swings và De Ley,1977)

Hình 5 : Biểu đồ biểu diễn sự nhạy cảm của Z mobilis với thuốc nhuộm

Hình 6 : Biểu đồ biểu diễn sức đề kháng và sự nhạy cảm của Zymomonas với một

số chất kháng sinh

Lên men rượu là một quá trình sinh học, trong đó từ cơ chất ban đầu là cácdạng đường lên men được sẽ chuyển hóa thành ethanol và khí CO2 thông qua hoạtđộng trao đổi chất của một số vi sinh vật đặc biệt (nấm men, vi khuẩn) ở điều kiện

kỵ khí

Năm 1912, Barker và Hillier là những nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu về

sự lên men của giống vi khuẩn Zymomonas (một giống vi sinh vật gây bệnh rượu

táo) Tuy nhiên họ chỉ nghiên cứu sự lên men này trên các cơ chất là glucose hoặcfructose, không có sucrose, maltose hoặc lactose Họ cho rằng khí tạo thành trongquá trình lên men hầu hết là CO2, có một vài acid tạo thành nhưng không đề cập

gì đến acid lactic Họ còn ước tính là có khoảng 1.9 mol ethanol tạo thành ứng vớimỗi mol glucose hấp thu

Nguồn cacbon được sử dụng cho quá trình lên men chỉ gồm glucose,fructose và sucrose Sự lên men glucose bắt đầu sau 10 giờ ở 30oC và ngày càngmạnh mẽ hơn sau 2 ngày Glucose được lên men hoàn toàn, bên cạnh sự tạo thànhethanol, người ta còn thấy có sự xuất hiện của acid lactic Trong số các sản phẩmtrung gian có acetaldehyde tạo thành, tuy nhiên chúng không phải là sản phẩmcuối cùng của quá trình lên men

Trong vi khuẩn Z mobilis , D-glucose và D-fructose được vận chuyển theo

cơ chế khuếch tán xúc tiến Vì dung dịch có nồng độ glucose cao không phải là tácnhân kìm hãm các enzyme của con đường Entner – Doudoroff nên glucose đượcchủng vi khuẩn này chuyển hóa thành ethanol một cách nhanh chóng Vì thế, ápsuất thẩm thấu ngoại bào của dung dịch glucose có thể nhanh chóng được cân

bằng với dung dịch đường nội bào Khả năng chịu nồng độ muối kém của Z.

mobilis đã dẫn đến vấn đề khó khăn trong quá trình lên men rỉ đường vốn là

nguồn nguyên liệu chứa nồng độ muối cao

1 Con đường Entner – Doudoroff (KDPG) (2- keto-3 photphatgluconat pathway)

deoxi-6-Hình 7 : Con đường Entner – Doudoroff

Đối với nhóm vi sinh vật kỵ khí, quá trình sinh năng lượng không kèm theoviệc liên kết với oxi không khí Ngày nay, người ta hiểu rằng oxi hóa không chỉ cónghĩa là liên kết với oxi mà còn bao gồm cả quá trình mất hydro (RH2 + A  R +

AH2), quá trình tách hydro ra sau khi kết hợp với nước (A + H2O  B  C) hoặcquá trình nất electron và làm tăng thêm hóa trị dương (Fe2+  Fe3+ + e, Cu+

Cu2+ + e …)

Năng lượng giải phóng ra từ các phản ứng oxi hóa sẽ được giữ lại trong mộtsố hợp chất giàu năng lượng có mặt trong tế bào vi sinh vật Đó là các hợp chấtnhư : nucleozit triphotphat (ATP, UTP …), các axyl photphat, các dẫn xuất của acidcacbonic (Axetyl- CoA …)

Hợp chất giàu năng lượng quan trọng nhất là ATP (adenozin triphotphat).Nó chứa 2 liên kết cao năng (), mỗi liên kết chứ khoảng 1200 cal (trong khi mỗiliên kết photphat bình thường chỉ chứa khoảng 300 cal)

ATP được coi như “tiền tệ” của năng lượng trong tế bào Chúng được tiêudùng trong tất cả các phản ứng trao đổi cần năng lượng Các phân tử giàu nănglượng này được hình thành trong tế bào của vi sinh vật Có thể nói sự hình thànhliên kết cao năng giữa P và O còn gọi là quá trình photphoryl hóa, là phương thứcchủ yếu để tích lũy năng lượng cần thiết cho tế bào

Sự mất hydro của cơ chất có thể theo 4 con đường khác nhau: oxi hóa phisinh học (sự cháy) và oxi hóa sinh học (EDP, EMP, HMP) Ở mỗi con đường đềucó chức năng mất hydro, sinh năng lượng và sản sinh các sản phẩm trao đổi chấtphân tử nhỏ cung cấp làm nguyên liệu cho các phản ứng sinh tổng hợp Hydro tách

ra được vận chuyển và cuối cùng được tiếp nhận bởi oxy để tạo ra nước

Trong điều kiện hiếu khí hay kỵ khí, glucose đều được chuển thành piruvatqua 10 phản ứng, trong đó chỉ có 3 phản ứng (1, 3 và 10) là một chiều, còn lại đềulà hai chiều Trừ glucose và piruvat, các chất trung gian đều ở dạng photphorylhóa Gốc photphoryl ở đây có 3 chức năng :

 Giúp cho chất trung gian mang điện tích âm cao không thể thoát rangoài

 Là vị trí gắn enzyme

 Là vị trí cung cấp liên kết photphat cao năng ()

EDP là con đường giúp cho Z mobilis chuyển hóa glucose thành piruvat

không qua con đường EMP (con đường Đường phân- Glycolysis) Trước hết, dướitác dụng của enzyme hexokinase và tiêu hao một phân tử ATP, phân tử glucoseđược chuyển thành glucose- 6- photphat Sau đó, glucose- 6-  được chuyển thành6- - gluconat như con đường Pentose photphat (con đường HMP) Tiếp theo, chất

thành piruvat và - glixeraldehyde nhờ một aldolase đặc hiệu Cuối cùng,

3-- glixeraldehyde lại đi vào con đường EMP để cho piruvat Do đó cân bằngchung của con đường KDPG là :

Glucose  2 piruvat + ATP + NADH2 + NADPH2

Hình 8 : Sơ đồ chuyển hóa từ glucose- 6- photphat thành

glyxeraldehyde- 3-photphat và piruvat

ATP ở đây được tạo thành ở 2 phản ứng (7) và (10) Phản ứng (6) là phản ứng oxihóa :

Glixeraldehyde- 3-photphat + NAD+ + Pi 1,3- diphotpho- glyxerat + NADPH

1,3- diphot- phoglyxerat + ADP  ATP + 3- photphoglyxerat

1,3- diphotpho- glyxerat chứa một ở C1 Với sự có mặt của arsenat, gốc AsO4,

do tương tự với gốc PO43-, đã liên kết cạnh tranh với  ở C1, kết quả là sự tạothành ATP ở đây bị kìm hãm

Phản ứng (9) là loại nước :

2- photpho- glyxerat  photphoenol piruvat (PEP) + H2O

PEP + ADP  Piruvat + ATPSự tạo thành ATP ở 2 phản ứng trên gọi là photphoryl hóa ở mức độ cơ chất

vì photphat cao năng  trước đó là một phần của phần tử chất trao đổi diphotpho- glyxerat và PEP) Khi có mặt ADP, chất trao đổi sẽ chuyển  choADP : X + ADP  Xylose + ATP

(1,3-Nghiên cứu về các sản phẩm trung gian của quá trình thủy phân cho thấyglucose-6-photphat dehydrogenase và phosphoglycerolmutase là hai enzyme giớihạn (limiting enzymes) và enzyme phosphofructokinase không có trong con đường

Entner – Doudoroff của Z mobilis.

Pyruvate decarboxylase (Pdc) và alcohol dehydrogenase (Adh) là haienzyme chủ lực tham gia vào sự hình thành ethanol Và Pdc là enzyme duy nhất

cần thiamin pyrophotphat cho sự hoạt động, trong khi Adh I của Z mobilis lại cần

nguyên tố Zn giống như Adh IV của nấm men, còn Adh II thì hiếm khi cần nguyêntố Fe và không cần nguyên tố Zn Sự có mặt của Adh II nhằm thúc đẩy quá trìnhlên men được diễn ra liên tục với nồng độ ethanol cao

Bảng 6 : Hệ thống các enzyme đường phân trong Zymomonas mobilis

Trong Z mobilis , các enzyme của con đường Entner – Doudoroff có thể kháng cự tốt hơn với ethanol, cho nên hệ thống tế bào tự do của Z mobilis có thể

nhanh chóng hấp thu glucose và sản xuất ethanol nhiều hơn 15% w/v Màng tế bào

của Z mobilis có chứa nhiều loại acid béo giúp nó kháng cự lại với những tác

động bất lợi của ethanol Các loại acid béo chính là : acid myristic, acid palmitic,

và acid cis-vaccenic Trong các loại phospholipid thì chiếm số lượng nhiều nhất là phosphotidyl ethanolamine Nồng độ acid cis-vaccenic và sự có mặt không thường

xuyên của hopanoid trong màng tế bào giúp nó kháng cự với nồng độ ethanol cao

Bên trong màng tế bào của Z mobilis có các enzyme oxi hóa khử với

cofactor là NADH và NADPH, ngoài ra còn có các enzyme catalase, superoxidedismutase và peroxidase Ở đây, việc vạân chuyển electron thông qua chuỗi hô hấpkhông đi đôi với quá trình phosphoryl oxy hóa khử Cảø hai enzyme glucose-fructose oxido-reductase và glucose dehydrogenase đều xúc tác cho phản ứng tạothành acid gluconic

Dưới sự xúc tác của enzyme mannitol dehydrogenase và oxidase vớicofactor là NAD(P)H có hình thành các sản phẩm phụ như : acetaldehyde, acetoin,

và acid acetic Việc sản xuất ra acetaldehyde bởi Z mobilis khi có mặt của oxy là

do sự tăng hoạt tính của enzyme NADH oxidase dẫn đến kết quả là giảm khả năngcủa NADH trong phản ứng khử acetaldehyde thành ethanol với sự xúc tác của

Adh Z mobilis không có enzyme acetaldehyde dehydrogenase để xúc tác cho

phản ứng oxy hóa acetaldehyde thành acid acetic

Z mobilis có cảø hai enzyme acid và alkaline phosphatases Trong khi hoạt

tính của acid phosphatase thì cao nhất khi có Mg2+, còn hoạt tính của alkalinephosphatase lại cao nhất khi có nguyên tố Zn(II) Trong suốt quá trình lên mensucrose, có 3 dạng chuyển hóa fructose dẫn đến sự hình thành fructose tự do,oligosaccharide và các polymer mạch dài của fructose và levan

 Một số phương trình cân bằng mol cho quá trình lên men:

1 mol glucose  1.8 mol ethanol + 1.9 mol CO2 + 0.15 mol lactic acid

(Kluyver và Hoppenbrouwer)

1 mol glucose  1.93 mol ethanol + 1.8 mol CO2 + 0.053 mol lactate

(Gibbs và DeMoss, 1951)

1 mol glucose  1.58 mol ethanol + 1.7 mol CO2 + 0.2 mol lactate

(Belaich và Senez, 1965)

1 mol glucose  1.63 mol ethanol + x mol CO2 + 0.02 mol lactate

(Dawes và cộng sự , 1970)

Nhận xét thấy ethanol và acid lactic ngày càng giảm khi vi khuẩn ngàycàng sinh trưởng Cho nên, vào những năm đầu 1930, người ta tiên đoán rằng cơ

chế lên men của Zymomonas cũng tương tự như giống nấm men Saccharomyces.

Theo Schreder và cộng sự có 98% glucose chuyển hóa thành CO2 vàethanol, chỉ có một lượng ít acetaldehyde, acetylmethylcarbinol, acid acetic, acidlactic và glycerol được tạo thành

 Acid pyruvic bị khử CO2 thành acetaldehyde Acetaldehyde được tích lũytrong quá trình lên men glucose Glucose-6-photphat (G6P) và hexose diphotphat

bị khử photphat (dephosphorylated) trước quá trình lên men Quá trình phosphorylhóa xảy ra Theo lý luận của Neuberg và Kobel, sự lên men glucose ở đây khôngtuân theo con đường đường phân (glycolysis pathway) như kết quả nghiên cứu của

hai nhà khoa học Gibbs và DeMoss với chủng Z mobilis ATCC 10988

 Đến năm 1954, hai nhà khoa học Gibbs và DeMoss đã khám phá ra cơ chế

lên men chính của vi khuẩn Zymomonas từ nguồn cơ chất glucose và fructose là

con đường Entner-Doudoroff

 Cân bằng oxi hóa khử của glucose và fructose bị phá vỡ, giúp tạo ra và duytrì phân tử NAD+, là loại phân tử có nhiều hơn NADP+ do không có mặt củaenzyme NAD+ - NADP+ transhydrogenase Với mỗi phân tử đường hexose tiêuthụ thì có 2 phân tử NADH+ được tạo thành, một phân tử NADH+ được tạo thànhnhờ enzyme G6P-dehydrogenase và một phân tử NADH+ được tạo thành nhờenzyme glyceraldehyde-3-photphat dehydrogenase Các coenzyme bị khử sẽ đượcoxi hóa trở lại nhờ enzyme ethanol dehydrogenase và acetaldehyde – một hợpchất sau này cũng bị khử thành ethanol và một lượng tối thiểu các hợp chất khácnhờ một enzyme kém hoạt động là lactate dehydrogenase

 Hình 7 cho thấy hiệu suất ATP tổng quát là : tương ứng với mỗi phân tửglucose lên men thì có một phân tử ATP được tạo thành

 Con đường enzyme hoàn chỉnh phá vỡ phân tử gluconate đã có sẵn, tuynhiên gluconate không phải là một nguồn cacbon hay một nguồn năng lượng

 Phản ứng chủ đạo của con đường Entner – Doudoroff là phản ứng táchnước của 6-phosphogluconate thành 3-deoxy-2-oxo-6-phosphogluconate nhờ

enzyme 6-phosphogluconate dehydratase Triose photphat sau đó được chuyển hóathành pyruvate.

 Vì sự kỵ khí của con đường Entner – Doudoroff liên quan đến cân bằng oxyhóa khử giữa glucose 6-photphat dehydrogenase, glyceraldehyde 3-photphat

dehydrogenase và ethanol dehydrogenase Do Z mobilis thiếu enzyme

phosphofructokinase, một enzyme chủ chốt trong con đường đường phân EMP

(Raps & DeMoss, 1962) nên Z mobilis trao đổi chất không đi theo con đường

EMP mặc dù có enzyme fructose 1,6-diphotphat aldolase (DeMoss & Gibbs,1952),

 Sự có mặt của gluconokinase và sự vắng mặt của gluconate dehydrogenasechứng tỏ rằng glucose được trao đổi chất nhờ 6-phosphogluconate và hệ thống cácenzyme của con đường Entner – Doudoroff

2 Sự hình thành các sản phẩm phụ :

2.1 Sản phẩm phụ là Acrolein :

Allyl alcohol, được xem là những cơ chất độc hại với tế bào, nó được oxyhóa thành acrolein nhờ sự xúc tác của enzyme alcohol dehydrogenase, và ethanollà chất kìm hãm cạnh tranh với phản ứng oxy hóa này

Hình 9 : Phản ứng tạo acrolein

2.2 Sản phẩm phụ là Acetaldehyde :

Z mobilis là một trong số ít các vi khuẩn sở hữu enzyme pyruvate

decarboxylase giống như trong nấm men và vì vậy có thể sản xuất ethanol bằngcách giảm acetaldehyde Những loài vi khuẩn khác lên men ethanol cũng có

enzyme này là Zymomonas anaerobia (D J McGill, D W Ribbons & E A Dawes), Zymosarcina ventriculi (Arbuthnott, Bauchop & Dawes, 1960) và Erwinia

amylovora (A Haq & E A Dawes) Enzyme ethanol dehydrogenase xúc tác cho

phản ứng khử acetaldehyde

2.3 Sản phẩm phụ là sorbitol :

Enzyme glucose-fructose oxidoreductase (GFOR) có trong tế bào vi khuẩnxúc tác phản ứng tạo thành sorbitol, đồng thời xúc tác phản ứng chuyển hóaglucose và fructose thành glucono-δ-lactone và sorbitol GFOR giữ một chức năng

sinh lý rất quan trọng cho tế bào vi khuẩn vì sorbitol hình thành giúp Z mobilis

kháng cự với áp suất thẩm thấu cao gây ra bởi môi trường lên men có nồng độđường cao

2.4 Sản phẩm phụ là acid lactic :

Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol trong quá trình lên men glucose bởi loài

Zymomonas mobilis liên quan đến điều kiện sinh trưởng, thông thường khoảng

95% cơ chất (5% w/v glucose) được chuyển hóa thành ethanol và CO2, còn 5% cơchất được sử dụng cho tổng hợp sinh khối tế bào Nếu tạo điều kiện tăng hiệu suấtchuyển hóa lên 98% thì sẽ làm giảm hiệu suất sinh trưởng (tức là giảm sinh khốitế bào)

Khi sinh trưởng trong điều kiện giới hạn glucose trong thiết bị chemostat,với pH = 6, hiệu quả chuyển hóa quan sát thấy giảm từ 95% (với D = 0.2h-1) xuốngcòn 80% (với D = 0.042h-1) Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol giảm chỉ có thể giảithích là do sự thay đổi phụ thuộc vào pH trong quá trình trao đổi chất pyruvate,dẫn đến hình thành acid lactic là một sản phẩm phụ của quá trình lên men

Ở độ pha loãng D = 0.042 h-1, khi giảm pH từ 6.0 xuống 5.5 dẫn đến giảmnồng độ acid lactic từ 10.8 xuống 7.5 g/L Sự sinh tổng hợp acid lactic phụ thuộcvào sự có mặt của dịch chiết nấm men hoặc tryptone trong môi trường muốikhoáng chứa 5% (w/v) glucose Còn với độ pha loãng D = 0.15 h-1, nồng độ dịchchiết nấm men giảm từ 3 đến 1 g/L, pH = 6 thì nồng độ acid lactic giảm 3 lần.Acid lactic sẽ không được tạo ra trong môi trường muối khoáng trên có bổ sung

NH4Cl được xem là nguồn dự trữ nitơ duy nhất Còn trong môi trường muối xácđịnh (defined salts medium) thì hiệu suất chuyển hóa cực đại lý thuyết là 98%

Khi chemostat được sử dụng cho sự lên men từng mẻ có ổn định pH stat batch) thì acid lactic sản xuất ra có sự tương quan tốt với hoạt động củachemostat, tuy nhiên cơ chế gây ra vẫn chưa rõ ràng

(pH-2.5 Sự hình thành các sản phẩm phụ glycerol 3-photphat, dihydroxyacetone

và glycerol ở Zymomonas mobilis

Vi khuẩn gram âm Z mobilis là vi khuẩn duy nhất lên men đường kỵ khí

bằng con đường Entner – Doudoroff, có enzyme pyruvate decarboxylase và

alcohol dehydrogenase tham gia xúc tác pyruvate thành ethanol Khi Z mobilis sử

dụng glucose làm nguồn cacbon chính trong sự tăng trưởng kỵ khí của mình, chỉ cómột số ít các sản phẩm phụ được hình thành, do đó hiệu suất sản xuất ethanol hiểnnhiên cao, chiếm 95% hiệu suất lý thuyết Tuy nhiên khi lên men fructose, đặcbiệt với nồng độ cao, sự tăng trưởng chậm lại, sản lượng sinh khối tạo thành chỉbằng một nửa so với glucose và hiệu suất ethanol chỉ bằng 90% hiệu suất lýthuyết Điều này được giải thích là do sự hình thành các sản phẩm phụdihydroxyacetone và glycerol

Có hai giả thuyết đặt ra giải thích cho sự hình thành các sản phẩm phụ là :

– Enzyme 2-keto-3-desoxy-6-phosphogluconate (KDPG) aldolase hoặc mộtaldolase đặc trưng nào đó xúc tác phản ứng tách fructose 6-photphat tạo thànhdihydroxyacetone (Sprenger) và sau đó nó bị khử tạo thành glycerol

– Dihydroxyacetone photphat bị khử tạo thành glycerol-3-photphat, sau đóhợp chất này bị dephosphoryl hóa tạo thành glycerol (Viikari và Korhola)

1, KDPG aldolase; 2, Glycerol dehydrogenase; 3, Các enzyme đường phân; 4,Triosephotphat isomerase, 5, Glycerol 3-photphat dehydrogenase; 6, Glycerolphosphatase; 7, Dihydroxyacetone phosphatase

Hình 10 : Hai con đường hình thành các sản phẩm phụ dihydroxyacetone, glycerol

3-photphat và glycerol.

Hình 11 : Con đường hình thành sản phẩm phụ dihydroxyacetone, glycerol và

glycerol 3-photphat Bảng 7 : Hoạt tính của enzyme dihydroxyacetone reductase và glycerokinase của

Z mobilis

 Glycerol-3-photphat và sản phẩm phụ dihydroxyacetone, glycerol được sinh

tổng hợp trong Z mobilis nhờ thứ tự xúc tác của các enzyme sau : triosephotphat

isomerase, dihydroxyacetone phosphatase, dihydroxyacetone reductase vàglycerokinase

 Mặc dù dihydroxyacetone reductase có ái lực thấp với cơ chất của nó làdihydroxyacetone (K = 2.5 mM) nhưng trong cơ thể sống có thể hình thành đến

43 mM dihydroxyacetone Dihydroxyacetone bị khử thành sản phẩm phụ glycerol,là chất cạnh tranh với ethanol, cho nên khi bổ sung 28 mM dihydroxyacetone vàomôi trường lúc bắt đầu quá trình lên men dẫn đến kết quả là giảm lượng sinh khốiđến 15%.

Bảng 8 : Nồng độ của sản phẩm trao đổi chất trong tế bào Z mobilis ZM4

3 Một số kỹ thuật di truyền trên Zymomonas mobilis nhằm cải thiện khả

năng lên men ethanol

Vấn đề khó khăn ở Z mobilis là :

­ Không có khả năng chuyển hóa các polysaccharide phức tạp như :cellulose, hemicellulose và tinh bột thành ethanol

­ Tạo ra các sản phẩm phụ như : sorbitol, acetoin, glycerol và acid acetic

­ Hình thành một loại polymer levan ngoại bào

Để giải quyết những vấn đề trên, người ta tiến hành các kỹ thuật di truyền

trên Z mobilis nhằm mở rộng phạm vi ứng dụng của Z mobilis, có nghĩa là gen

mã hóa cho các enzyme thủy phân từ các loài vi khuẩn có liên quan sẽ được phát

triển thành dòng vô tính rồi sau đó được cấy truyền vào Z mobilis Một điều thú vị

nữa là, một loại operon được quan tâm (sản xuất ethanol) được tạo ra bằng cáchkết nối hai gen pdc (pyruvate decarboxylase) và adhII (alcohol dehydrogenase)

của Z mobilis được cấy truyền vào các chủng vi khuẩn khác làm cho chúng có

hoạt tính lên men ethanol Ngoài ra, nhờ các phương pháp gây đột biến cổ điển có

chọn lọc, ngày nay người ta đã tạo ra các thể đột biến Z mobilis có đặc tính lên

men được cải thiện và không có sự hình thành các sản phẩm phụ

Bên cạnh ethanol, Z mobilis còn được sử dụng trong sản xuất L-alanine và

L-lactic acid Gen mã hóa sinh tổng hợp - carotene được phát triển thành dòng

vô tính và cấy truyền vào Z mobilis Nhờ một số ứng dụng của levan trong công

nghiệp thực phẩm và dược phẩm, từ đó Z mobilis được quan tâm khai thác nhiều hơn trong việc sản xuất levan ở quy mô lớn Và Z mobilis còn được đánh giá là

chủng vi sinh vật có tiềm năng trong sản xuất các sản phẩm lên men công nghiệp

Mặc dù là tác nhân lên men ethanol nhưng Z mobilis lại không thích hợp

cho chuyển hóa sinh khối vì nó chỉ có thể lên men glucose, fructose và sucrose.Tuy nhiên, trong thập kỷ vừa qua, các nhà nghiên cứu ở Phòng Thí NghiệmNguyên liệu Tái sử dụng Quốc gia (Khoa Năng lượng, Mỹ) đã thành công trongviệc tạo ra những chủng vi khuẩn có thể lên men xylose và arabinose

Chủng tái tổ hợp đầu tiên lên men xylose (Zhang và cộng sự 1995a) được

cấy ghép 4 gen của E coli là : xylose isomerase (xylA), xylulose kinase (xylB),

transketolase (tktA), và transaldolase (talB) (Zhang và cộng sự.1995a) Xyloseisomerase và xylulose kinase chuyển hóa xylose thành xylulose-5-photphat, mộthợp chất trung gian quan trọng trong con đường Pentose photphat Xylulose-5-photphat sau đó được chuyển hóa thành các hợp chất trung gian của con đườngEntner – Doudoroff bằng các enzyme transketolase và transaldolase

5 gen phân lập từ E.coli đưa vào vòng plasmid là : L-arabinose isomerase

(araA), L-ribulose kinase (araB), L-ribulose-5-photphat-4-epimerase (araD),transketolase (tktA) và transaldolase (talB) 3 enzyme đầu tiên chịu trách nhiệmcho việc chuyển hóa arabinose thành xylulose-5-photphat

Hình 12 : Con đường trao đổi chất glucose, xylose và arabinose ở Z mobilis

 Chủng tái tổ hợp CP4 trội hơn chủng cha mẹ CP4 về tốc độ và khả năngchuyển hóa hoàn toàn glucose thành ethanol

 Chủng Y02 có thể sản xuất được 9.5% ethanol về khối lượng hoặc 11.9%ethanol về thể tích sau 17.4 giờ so với 31.8 giờ của CP4 thuần chủng

 Enzyme alcohol dehydrogenase isozymes được làm mất hoạt tính ở cácchủng đột biến này, không còn khả năng xúc tác cho sự oxy hóa các allyl alcoholtạo ra sản phẩm acrolein độc hại

 Một số chủng được cải tiến về khả năng hấp thu cơ chất, có thể sản xuấtethanol từ dung dịch syrup nước mía 25%

 Nếu như trước đây các chủng dại thuộc loài Z mobilis dại sinh trưởng và

lên men ethanol từ mật rỉ kém do nồng độ muối cao thì ngày nay các chủng tái tổhợp đã được cải thiện khả năng lên men gấp 2 lần, chịu được muối và pH thấp

 Z mobilis ZM4 là một chủng tái tổ hợp có khả năng chịu được nhiệt độ cao

(42oC)

 Một vài chủng tái tổ hợp Z mobilis có khả năng sử dụng mannitol như là

nguồn cacbon chính cho quá trình sinh trưởng và lên men nhờ được cấy gen mãhóa enzyme mannitol dehydrogenase

Bảng 9 : Hệ thống các enzyme được mã hóa trong Z mobilis

Chương 3

Phương pháp lên men ethanol với Zymomonas mobilis



1 Động học của quá trình lên men

 Con đường trao đổi chất là con đường mà tất cả các quá trình lên men đềuđược diễn ra với sự sinh tổng hợp adenosine triphotphat - ATP, là chất cung cấpnăng lượng cho tế bào hoạt động Dưới những điều kiện sinh lý thích hợp thì tế

bào vi khuẩn Z mobilis cần có một năng lượng khoảng 42 và 50 kJ/mol để sinh

tổng hợp ATP , tuy nhiên thực tế thường nó cần khoảng 63 kJ/mol

 Theo con đường Embden-Meyerhof ở nấm men Saccharomyces cerevisiae

thì có 2 mol ATP và 2 mol NADH tạo thành ứng với mỗi mol glucose hấp thu

 Theo con đường Entner – Doudoroff ở vi khuẩn Zymomonas mobilis thì chỉ

có 1 mol ATP và 2 mol NADH ứng với mỗi mol glucose hấp thu và acid pyruvic làsản phẩm trung gian của con đường này

 Ở cả 2 con đường trên đều có sự giảm năng lượng tự do khoảng –235kJ/mol glucose được lên men

 Đối với các phản ứng hóa học, động học của một quá trình phản ánh tốc độphản ứng ở mức phân tử, còn trong cơ thể vi sinh vật động học lại phản ánh tươngtác giữa tế bào sống và môi trường nuôi cấy

 Z mobilis rất nhạy cảm với acid acetic (đặc biệt với pH ngoại bào thấp).

Acid acetic là một thành phần điển hình có trong các sản phẩm thủy phân củacellulose Tuy nhiên cơ chế kìm hãm của acid acetic lên quá trình lên men vẫnchưa được giải thích rõ ràng

Hình 13 : Cơ chế vận chuyển Hac, Ac - và H + qua màng tế bào

Zymomonas mobilis

 Nếu nồng độ acid acetic cao thì sẽ có sự tiêu hao ATP để duy trì pH nộibào (pHin) Hiện tượng này xảy ra là do sự gia tăng dòng proton vào tế bào nhờ cơchế khuếch tán của dạng proton acid acetic (HAc)

 Khi pH ngoại bào thấp (pHext), HAc khuếch tán qua màng tế bào , bị phân

ly một phần do pHin cao hơn Vì pHin > pHext , đối với Z mobilis (cũng như với các

chủng vi sinh vật lên men ethanol khác), pH có xu hướng cân bằng trở lại nhờdạng phân ly của acid acetic (Ac-) Vì thế chúng ta cần quan tâm đến dòng vào củaHAc và dòng ra của Ac- Các nhà nghiên cứu cho rằng sự vận chuyển của 2 yếu tốnày được xúc tiến bởi gradient nồng độ

 Các kết quả thí nghiệm cho thấy nếu không có acid acetic, tốc độ lên menethanol cực đại tính theo thể tích khi lên men liên tục ở pH 5.0 là 3.54 g/L h.Trong suốt quá trình lên men liên tục kéo dài, hiệu quả chuyển hóa đường thànhethanol (dựa trên tổng lượng đường hấp thu) luôn được duy trì > 85% Nếu có acidacetic với nồng độ 0.25% (w/v), tốc độ lên men giảm còn 1.17 g/L.h ở pH 5.5

 Ion H+ dễ dàng thẩm thấu và khuếch tán qua màng tế bào (dòng vào H+

được xúc tiến bởi gradient nồng độ) Cơ chế vận chuyển tự động của ion H+ nhằmduy trì mức sinh lý thích hợp cho tế bào Cần lưu ý rằng pHin luôn cao hơn pHext

trong suốt quá trình lên men của Z mobilis

 pH nội bào của của Z mobilis khoảng 6.4 và gradient pH bắt đầu giảm

dần trước khi mức ATP giảm mạnh Trong khi đó, gradient pH vẫn tiếp tục tăngmãi đến khi mức ATP cạn kiệt Gradient pH được tạo một phần là do quá trình

thủy phân ATP bởi ATPases liên kết với màng tế bào và do sự bài tiết ra môitrường các sản phẩm trao đổi chất như : acid acetic, acid lactic…

 Một điều quan trọng là chỉ có 1 mol ATP được tạo ra từ 1 mol glucose hấpthu bằng con đường Entner – Doudoroff Một phần đáng kể lượng ATP này đượcchuyển hóa thành ADP và tham gia phosphoryl hóa đồng thời UDP Vì vậy, nồngđộ ATP nội bào có sẵn cho quá trình thủy phân xúc tác bởi ATPases sẽ ít hơn

 Một số nghiên cứu gần đây về đặc tính của các enzyme trong Z mobilis

cho rằng glucokinase có thể sử dụng UTP, GTP, và CTP tốt như ATP trong cácphản ứng phosphoryl hóa glucose ban đầu UTP là một nucleoside triphotphatchính trong tế bào khi lên men Ngoài ra, glucokinase bị kìm hãm khoảng 35% bởi0.05 mM glucose 6-photphat và 71% bởi 0.2 mM glucose 6-photphat

2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

2.1 Nồng độ đường ban đầu

Để tìm ra nồng độ đường tối ưu cho sự lên men, ta tiến hành lên men tĩnhtương ứng với các nồng độ đường ban đầu khác nhau Bảng 10 thể hiện khả năng

lên men ethanol của 4 chủng thuộc loài Z mobilis ứng với các nồng độ đường ban

đầu khác nhau

Hiệu suất lên men cực đại ứng với 15% (w/v) nồng độ đường ban đầu vớichủng ATCC 10988 và ATCC 12526, nếu gia tăng nồng độ đường ban đầu từ 15–20% sẽ làm giảm hiệu suất lên men của các chủng này Tuy nhiên, chủng IFO

13756 và NRRL Β 4286 lại có hiệu suất lên men tăng ở 20% (w/v) nồng độ đườngban đầu nhưng không có sự gia tăng đáng kể trong việc hấp thu cơ chất Với 25 %(w/v) tất cả các chủng đều giảm khả năng hấp thu cơ chất và lên men ethanol

Bảng 10 : Aûnh hưởng của nồng độ đường ban đầu lên sản xuất ethanol với các

chủng Z mobilis khác nhau

Chú thích : P : % (v/v) ethanol tạo thành;

Su : % (w/v) cơ chất hấp thu

g/gs : tỷ số gam ethanol tạo thành/ gam cơ chất hấp thu

E : % hiệu suất lý thuyết

2.2 Aûnh hưởng của cơ chất

2.2.1 Cơ chất là đường hexose (glucose hoặc fructose)

Trường hợp lên men riêng lẻ glucose hoặc fructose :

Chủng tái tổ hợp Zymomonas mobilis CP4 (pZB5) được nuôi cấy trong môi

trường lên men gián đoạn và liên tục có sự điều chỉnh pH với cơ chất là glucosehoặc fructose được xem là nguồn cacbon cũng như là nguồn năng lượng chủ yếu

Bảng 11 : Thông số của quá trình lên men với cơ chất glucose hoặc fructose

Tốc độ hấp thu đường riêng cực đại (g

Tốc độ sản xuất ethanol riêng cực đại (g

Hiệu suất sinh trưởng trung bình

Giá trị hiệu suất ATP (YATP)

Trường hợp lên men đồng bộ hỗn hợp glucose và fructose :

 Sự kìm hãm cạnh tranh enzyme fructokinase bởi glucose được cho là một

cơ chế của việc Z mobilis ưu tiên hấp thu glucose từ hỗn hợp glucose và fructose

và tích lũy fructose khi sinh trưởng trên cơ chất là sucrose Với cùng một nồng độ

trong hỗn hợp glucose và fructose thì fructose được Z mobilis hấp thu chậm hơn

và sự kìm hãm enzyme fructokinase bởi glucose được diễn ra mãnh liệt trong tế

bào vi khuẩn Một điều thú vị là khi bổ sung glucose vào canh trường của chủng Z.

mobilis CP4-M2, một chủng thiếu enzyme glucokinase, thì sự kìm hãm trên xảy ra

hoàn toàn và ngay lập tức

 Ngoài ra khi thêm một chất tương tự glucose nhưng không tham gia trao đổichất thì cũng có những ảnh hưởng kìm hãm lên sự trao đổi chất fructose giống nhưvậy Điều này chứng tỏ rằng sự cạnh tranh chuyển hóa với fructose của glucoseđóng vai trò rất quan trọng trong quá trình sử dụng cơ chất là glucose và fructose

 Bên cạnh đó, enzyme glucose-fructose oxidoreductase xúc tác phản ứng

hình thành sorbitol từ fructose, đây là một chất giúp Z mobilis chịu được áp suất

thẩm thấu trong môi trường có nồng độ đường cao

Hình 14 : Cơ chế tích lũy và chuyển hóa glucose và fructose ở Z mobilis

2.2.2 Cơ chất là hỗn hợp glucose - xylose

Tốc độ sinh trưởng, sử dụng cơ chất riêng, cũng như sản lượng sinh khối và

sản xuất ethanol trên cơ chất là xylose của chủng Zymomonas mobilis ZM4

(pZP5) tái tổ hợp thấp hơn trên cơ chất là glucose hoặc hỗn hợp glucose – xylose

Quan sát sự lên men điển hình của chủng ZM4 (pZB5) trên cơ chất là hỗn

hợp glucose – xylose, ta thấy Z mobilis hấp thu đường glucose trước, còn xylose

thì được hấp thu sau với tốc độ chậm hơn và có sự trao đổi chất không đồng bộ saukhi glucose đã được sử dụng hết

Tốc độ và hiệu suất trao đổi chất trên xylose giảm được giải thích là donhiều nguyên nhân như :

 Trao đổi chất thay đổi do duy trì chức năng liên quan đến plasmid

 Tạo ra một số sản phẩm phụ như : xylitol, acetate, lactate, acetoin vàdihydroxyacetone

 Do tác nhân kìm hãm là xylitol photphat

Nhưng ngày nay, nhiều chủng Z mobilis kỹ thuật có thể chuyển xylose

thành ethanol bằng cách kết hợp cách sử dụng 2 con đường trao đổi chất Doudoroff và pentose pathways nhờ việc cấy ghép hệ thống các enzyme xyloseisomerase và xylulokinase trong việc tích lũy xylose và các enzyme transketolasevà transaldolase trong cơ chế trao đổi chất pentose

Entner-Hình 15 : Sự lên men của chủng tái tổ hợp ZM4 (pZB5) trên các cơ chất khác nhau

Hình 16 : Sự tạo thành ethanol, sinh khối và sản phẩm phụ của chủng tái tổ hợp

ZM4 (pZB5) trên các cơ chất khác nhau

A : sử dụng xylose (27.5g/l)

B : sử dụng hỗn hợp glucose (26.8g/l) và xylose (32g/l)

●- Xylose;  - glucose; ■- ethanol; - sinh khối

- xylitol;  - acetic acid; □, glycerol; - acetoin

Bảng 12 : Thông số động học của Z mobilis ZM4 (pZB5) trên môi trường có chứa

xylose, glucose hoặc hỗn hợp glucose-xylose

Nồng độ xylose (g/l) Nồng độ glucose (g/l) Nồng độ hỗn hợp

max(h−1), tốc độ sinh trưởng riêng cực đại

q s (g/g/h), lượng cơ chất hấp thu riêng

q p (g/g/h), tốc độ sản xuất ethanol riêng

Y x/s (g/g), hiệu suất sinh tổng hợp sinh khối

Y p/s(g/g), hiệu suất sinh tổng hợp ethanol

b –Thông số động học cho pha sử dụng xylose sau khi glucose đã được sử dụng hếttrong suốt quá trình đồng lên men hỗn hợp glucose – xylose