2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
2.8.Aûnh hưởng của môi trường kỵ khí
Zymomonas mobilis sinh thưởng hiếu khí với nồng độ glucose 20g/l (giới
hạn cacbon) trong thiết bị chemostat bị kìm hãm bởi sự gia tăng đồng thời hai yếu tố là hiệu suất sinh thưởng (Yx/s) và hiệu suất sinh trưởng cực đại (Yx/smax) và sự giảm đồng thời 2 yếu tố là tốc độ hấp thu cơ chất riêng (qs) và tốc độ hấp thu năng lượng dự trữ (me). Sự gia tăng về áp suất riêng phần của oxy cho thấy có sự chuyển tiếp thích nghi từ trạng thái kỵ khí sang hiếu khí xảy ra trong 4 trường hợp sau :
Kỵ khí : 0 mmHgO2
Oxy bị hạn chế : 7.6- 230 mmHgO2
Trung gian : 273 mmHgO2
Nồng độ sinh khối ổn định (Yx/s) và mức ATP nội bào gia tăng khi áp suất riêng phần của oxy tăng từ 7.6 đến 120 mm HgO2, cùng với sự giảm đồng thời thông số qs và tốc độ sản xuất acid riêng. Hoạt động của enzyme ATPase ở màng tế bào giảm dần khi tăng áp suất riêng phần của oxy và trở nên kém hoạt động nhất ở 273 mm HgO2, lúc đó áp suất riêng phần của oxy đạt cực đại mà vẫn duy trì được trạng thái ổn định.
Hoạt động của các enzyme glucokinase, glucose-6-photphat dehydrogenase, glyceraldehyde-3-photphat dehydrogenase, và alcohol dehydrogenase cũng giảm dần khi áp suất riêng phần của oxy tăng trên 15 mmHg, ngoại trừ enzyme pyruvate decarboxylase không bị tác động bởi điều kiện hiếu khí.
Sự kìm hãm sinh thưởng ở áp suất 290 mm HgO2 là đặc trưng cho sự giảm đáng kể hoạt động của enzyme pyruvate kinase và mức ATP tích lũy.
Kết luận : với nồng độ glucose thấp và điều kiện giới hạn oxy thì làm cho sản lượng sinh khối gia tăng, điều này phản ánh sự tái sử dụng lại gián tiếp ATP thì được ưa thích hơn là sự gia tăng năng lượng tạo ra cuối cùng.
2.9. Aûnh hưởng của Furfural :
Furfural là một chất độc kìm hãm sự sinh trưởng và khả năng sản xuất ethanol của chủngZymomonas mobilis CP4 (pZB5). Điều này đã được nghiên cứu
bằng cách lần lượt thêm 0.475 g/l và1.9 g/l furfural vào môi trường lên men. Sự kìm hãm của furfural thể hiện ở việc giảm 30% và 60% (w/v) trong sản xuất sinh khối và 19% và 76% trong sản xuất ethanol.
Thành phần phức tạp của các hợp chất lignocellulose trong chất xơ thực vật là vấn đề khó khăn trong việc chuyển hóa gỗ thành ethanol. Người ta thấy rằng việc nghiên cứu những ảnh hưởng của các sản phẩm từ quá trình thủy phân lên các thông số của quá trình lên men và từ đó có hướng giải quyết với những hợp chất độc hại.
3 yếu tố tồn tại cần phải tiền xử lý là : quá trình nghiền xé, sự nổ hơi và thủy phân acid loãng. Nhìn chung, phần gỗ dư sẽ được xử lý ở khoảng nhiệt độ từ 200 – 220oC, thời gian nấu từ 3 – 5 phút với 2 - 3% SO2 (v/v). Còn ở điều kiện nhiệt độ 170oC thì nấu trong vòng 15 – 60 phút với 0.01-0.1% (v/v) của H2SO4
(Um cùng cộng sự, 2001). Các thành phần của hemicellulose được chuyển hóa thành pentose và những sản phẩm khác theo phương trình phản ứng sau :
Pentosan ---(H2O)-- pentose (xylose)---(- 3 H2O) furfural
Hình 21 : Phản ứng chuyển hóa fufural
Hydroxymethylfurfural (HMF) còn được sinh ra từ các loại đường 6 cacbon trong điều kiện nhiệt độ cao và môi trường acid. Trong suốt quá trình sinh trưởng củaZ. mobilis, qua quan sát dưới kính hiển vi, người ta thấy sự thay đổi kiểu hình
một phần bị kìm hãm bởi nồng độ của các aldehyde. Tế bào sau 6 giờ có xu hướng kéo dài ra hoặc hình thành những chuỗi ngắn hơn so với tế bào ban đầu, và sau 24 giờ nó phồng to ra và có dạng hình tròn (Zaldivar, 1999). Shahab và Hadi (1995) lại cho rằng furfural ban đầu phản ứng với cặp base nitơ trong chuỗi ADN dẫn đến sự phá vỡ thông qua sự khử purin và pyridin tự phát.
Tốc độ tiêu thụ cơ chất, Qs, được thể hiện ở bảng 19. Ethanol được hình thành sau 15 giờ. Tuy nhiên nồng độ ethanol cuối cùng bị giảm gần 19.04% và 76.19% nếu sử dụng 0.475 g/l và 1.9 g/l furfural theo thứ tự. Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy có bổ sung furfural và được ủ trong 38 giờ.
Bảng 19 : Các thông số lên men
Furfural (g/l) Qs Cơ chất (g /h) Qetoh Sản phẩm (g /h) Yxs Sinh khối tế bào/cơ chất (g/g) Yps Sản phẩm/ cơ chất (g/g) µ (h/r) 0 0.475 1.9 0.45 0.40 0.17 0.22 0.18 0.05 0.00271 0.00261 0.00226 0.5 0.45 0.3 0.089 0.063 0.024 Sự kìm hãm của furfural lên quá trình lên men giảm dần cùng với sự gia tăng nồng độ sinh khối tế bào (Boyer cùng cộng sự, 1992; Navarro, 1994). Tuy nhiên sự sản xuất sinh khối không bị kìm hãm hoàn toàn bởi nồng độ furfural 0.475 g/l và 1.9 g/l. Chất độc này ảnh hưởng đến pha log của sự sinh trưởng vi sinh vật. Tốc độ tăng trưởng riêng (µ) giảm 29% (w/v) và 73% (w/v) nếu sử dụng 0.475 g/l và 1.9 g/l furfural theo thứ tự.
2.10. Aûnh hưởng của thành phần nitơ, kali và photpho trong môi trường dinh dưỡng
Nồng độ sinh khối tạo ra thấp khi hàm lượng nitơ quá nhiều. Tốc độ hình thành sản phẩm trong điều kiện hàm lượng nitơ vừa đủ cao hơn trong điều kiện hàm lượng nitơ đạt quá mức.
Cần tăng hàm lượng nitơ trong môi trường lên men khi nồng độ glucose tăng. Tuy nhiên, sự giới hạn về hàm lượng nitơ trong môi trường lên men không ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất sinh tổng hợp sản phẩm.
Trong phương pháp lên men liên tục, khi tốc độ pha loãng tăng dần, khi gia tăng hàm lượng nitơ sẽ dẫn đến nồng độ sinh khối trong thiết bị lên men cũng gia tăng, nhưng lượng sinh khối tạo ra trong điều kiện trường nitơ giới hạn ít hơn so với trong điều kiện nitơ quá mức.
Hàm lượng nitơ vừa đủ cho quá trình lên men phụ thuộc vào tốc độ pha loãng và phải gia tăng tốc độ pha loãng thì mới đạt mục tiêu chuyển hóa hoàn toàn glucose thành ethanol. Dưới điều kiện hàm lượng nitơ quá mức, tốc độ hấp thu riêng glucose và tốc độ sản xuất riêng ethanol sẽ gia tăng thuận nghịch với tốc độ pha loãng.
Hàm lượng kali : giới hạn về hàm lượng kali mà Z. mobilis có thể chịu được thì khá hẹp. Cũng như nitơ, giới hạn về hàm lượng kali phụ thuộc vào nồng độ glucose trong dòng nhập liệu và phải gia tăng hàm lượng kali (trong muối KCl) khi nồng độ glucose tăng.
2.11. Aûnh hưởng của nồng độ ethanol
Nếu có ethanol ban đầu trong môi trường dinh dưỡng thì sẽ làm giảm sản xuất sinh khối, hấp thu cơ chất, sản xuất ethanol, hiệu suất và hệ số chuyển hóa đường. Tuy nhiên không ảnh hưởng đáng kể đến sản xuất levan và hệ số hiệu suất sinh khối (g sinh khối/ g đường hấp thu).
Cụ thể : Với môi trường là sucrose có 2.5% ethanol ban đầu thì hiệu suất ethanol giảm 48.8%, hiệu suất sinh khối giảm 25% và tổng lượng đường hấp thu giảm 28.3%. Với môi trường là glucose có 3% ethanol ban đầu thì hấp thu đường giảm 60 – 65% (Moreau và cộng sự, 1997).
Tích lũy ethanol trong quá trình lên men đi đôi với việc giảm tốc độ chuyển hóa đường thành ethanol bởi Z. mobilis và nấm men. Hiện tượng này đặc biệt
quan trọng trong suốt quá trình sản xuất ethanol thương mại và gia tăng thời gian chuyển hóa cơ chất thành ethanol và giới hạn nồng độ ethanol cuối cùng đạt được. Sự kìm hãm này là do tác động trực tiếp của ethanol lên các enzyme chủ chốt của
con đường đường phân và sản xuất ethanol. Cơ chế kìm hãm có thể là ức chế ngược (ức chế do sản phẩm cuối) hoặc ức chế hoạt động của các enzyme.
Ethanol gây ra sự kìm hãm phụ thuộc vào khối lượng đến quá trình lên men với mức kìm hãm có thể đo được ở nồng độ 0.4 M (2%, wt/vol) trong cơ thể sống và 3.3 M (15%, wt/vol) trong ống nghiệm. Sự khác nhau này được giải thích là do nồng độ ethanol trong tế bào cao hơn trong môi trường. Tuy nhiên màng tế bào củaZ. mobiliscó thể cho ethanol thấm qua một cách dễ dàng và nồng độ ethanol nội bào không cao đến mức kìm hãm sự hoạt động của các enzyme. Một số các yếu tố khác trong môi trường nội bào có thể làm gia tăng sự nhạy cảm của enzyme với ethanol. Sự kìm hãm ethanol làm cho màng tế bào bị rò rỉ dẫn đến kết quả một số cofactor và coenzyme bị mất. Bổ sung magiê và nucleotide sẽ làm gia tăng tốc độ lên men khi có ethanol.
Sự rò rỉ của ion Mg (phân tử kích thước nhỏ) và nucleotide (phân tử kích thước trung bình) chỉ là một dấu hiệu của sự gia tăng tính thấm của màng tế bào, mà có thể gây ra bởi các ion khác, các cofactor và các sản phẩm trung gian của con đường đường phân. Đa số các enzyme trong con đường Entner-Doudoroff cần Mg làm cofactor như : glucokinase, glucose-6-photphat, dehydrogenase, phosphoglycerate kinase và enolase. Nét đặc hiệu của ion kim loại cho sự bảo vệ và sửa chữa sự kìm hãm bởi ethanol thì cũng tương tự như nét đặc hiệu của ion kim loại cho những enzyme này, có nghĩa là không thể thay thế ion Mg bởi ion khác như ion canxi. Vì thế sự rò rỉ ion Mg sẽ gây kìm hãm quá trình lên men.
Không giống như S. cerevisiae, alcohol dehydrogenase của Z. mobilis
không cần Mg. Các cofactor kim loại khác cần cho sự lên men như canxi cần cho hoạt hóa pyruvate decarboxylase và kali thì cần cho pyruvate kinase. Nồng độ ethanol sẽ gây ra sự rò rỉ. Nồng độ ethanol cao gây ra sự rò rỉ nucleotide nhiều hơn là Mg.
Ở nồng độ ethanol rất cao (4.4 M) (20%, wt/vol), sự lên men bị kìm hãm hoàn toàn, 30% hoạt tính lên men của tế bào có thể được phục hồi bằng cách thêm nucleotide và ion Mg. Điều này được giải thích là do sự khuếch tán của các sản phẩm trung gian vào và ra tế bào và sự suy giảm hoạt tính xúc tác của các enzyme đường phân. Tuy nhiên, sự kìm hãm hoàn toàn bởi 4.4 M ethanol (20%, wt/vol) không phải là kết quả của sự kìm hãm ngược hoặc sự biến tính các enzyme.
Ethanol làm giảm hoạt tính của màng tế bào theo 3 cách : làm biến đổi đặc tính của các hạt trong môi trường hoặc tương tác gián tiếp với màng tế bào hoặc làm thay đổi tính chất điện môi của môi trường.
axyl (RCO-) tham gia vào tương tác kỵ nước để hình thành nên trung tâm kỵ nước của màng tế bào, tạo điều kiện xâm nhập các phân tử có cực lên bề mặt màng tế bào. Ở nồng độ cao, ethanol có xu hướng hòa tan một số thành phần của màng tế bào tạo chỗ trống cho các nhóm kỵ nước xâm nhập và có thể thay thế nước vì bản chất cũng có liên kết hydro.
Mặt khác, ethanol là một phân tử lưỡng cực nên sẽ xâm nhập vào khu vực kỵ nước của màng tế bào. Do ethanol có tính phân cực hơn lõi phân cực của màng tế bào cho nên ethanol có xu hướng làm gia tăng độ phân cực trung bình của môi trường và giảm chức năng chất mang kỵ nước. Ethanol xâm nhập vào màng tế bào còn làm gia tăng trạng thái lỏng (tính lỏng) cũng như khả năng hóa lỏng của màng tế bào nên dẫn đến tế bào bị rò rỉ .
Cuối cùng, sự có mặt của ethanol sẽ làm biến đổi tính chất điện môi của môi trường, tăng lực tương tác tĩnh điện và đưa các ion về dạng kết hợp trung tính, dễ dàng thấm qua màng tế bào hơn. Tuy nhiên chỉ có những phân tử nhỏ là bị thất thoát, còn các phân tử lớn hơn thì bị giữ lại. Ví dụ như trong trường hợp có 4.4M ethanol ban đầu thì quan sát có sự thất thoát ion Mg và các nucleotide nhưng không thấy có sự thất thoát các protein.
Trong dung dịch đệm photphat, khả năng ức chế sự lên men của ethanol cao hơn trong môi trường sinh trưởng mặc dù chất đệm photphat cũng là một thành phần của môi trường sinh trưởng. Điểm khác nhau cơ bản là sự nhạy cảm với ion Mg trong dịch chiết nấm men, cho nên khi bổ sung Mg vào dung dịch đệm photphat thì sẽ làm giảm sự kìm hãm của ethanol lên quá trình lên men xuống mức tương đương với môi trường sinh trưởng.
Thêm EDTA cũng làm tăng khả năng ức chế của ethanol, chứng tỏ các kim loại hóa trị 2 có vai trò quan trọng trong môi trường sinh trưởng. Nếu ion Mg có nhiều ở môi trường xung quanh bên ngoài tế bào, nhờ hệ thống vận chuyển xúc tiến, sự rò rỉ ion Mg nội bào giảm dần. Tương tự, sự gia tăng nồng độ Mg ngoại bào sẽ làm giảm cung cấp Mg nội bào cho chức năng cofactor của enzyme.
Kết luận : cơ chế vận chuyển xúc tiến của Mg chịu trách nhiệm cho việc sửa chữa những hư hỏng do ethanol gây ra trong quá trình lên men khi nuôi cấy trong môi trường sinh trưởng mới không có ethanol. Vì vậy, sự có mặt của Mg ngoại bào trong dịch chiết nấm men giải thích cho sự giảm hoạt tính kìm hãm của ethanol trong môi trường sinh trưởng so với dung dịch đệm.
2.12. Aûnh hưởng của việc bổ sung ethanol trong quá trình lên men
Thêm ethanol vào quá trình lên men sẽ ức chế khả năng lên men của tế bàoZ. mobilis trong hai môi trường dung dịch đệm và môi trường sinh trưởng .Tuy nhiên, quá trình lên men sẽ chịu ảnh hưởng nhiều hơn bởi nồng độ ethanol thấp trong môi trường đệm so với môi trường sinh trưởng. Với nồng độ 5% (wt/vol) ethanol 1.1 M trong môi trường đệm và 10% (wt/vol) ethanol 2.2 M trong môi trường sinh trưởng thì hoạt tính lên men sẽ bị kìm hãm 50%, và sự lên men bị kìm hãm hoàn toàn bởi nồng độ ethanol cao nhất là 20% (wt/vol) ethanol 4.4 M trong cả môi trường đệm và môi trường sinh trưởng.
Hình 22 : Aûnh hưởng của việc bổ sung ethanol lên hoạt tính lên men .
- Tế bào ngâm trong dung dịch đệm Natri photphat (pH 6.0) có ethanol.
- Tế bào được ngâm với nhiều nồng độ ethanol khác nhau ở 30oC trong 10 phút sau đó đem đi rửa và ngâm trong dung dịch đệm không có ethanol .
- Tế bào được ngâm với ethanol trong dung dịch đệm sau đó đem đi rửa và ngâm trong dung dịch đệm có bổ sung 5 mM MgSO4, không có ethanol .
- Tế bào ngâm trong môi trường sinh trưởng có ethanol .
- Tế bào được ngâm với ethanol trong môi trường sinh trưởng ở 30oC trong 10 phút sau đó đem đi rửa và ngâm trong môi trường sinh trưởng không có ethanol.
3. Phương pháp thực hiện3.1. Vi khuẩn tự do : 3.1. Vi khuẩn tự do :
Khả năng kết bông củaZ. mobilis :
Đứng về mặt công nghiệp, khả năng kết bông của vi sinh vật là một đặc tính rất hữu ích, giúp ta dễ dàng tách tế bào và tái sử dụng tế bào trong khi vẫn đạt được nồng độ sinh khối và hiệu suất sinh tổng hợp ethanol cao.
Đặc tính này còn giúp tế bào vi khuẩn Z. mobilis kháng cự với các tác nhân kìm hãm như acid acetic và với các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH… So với bông tụ của nấm men, bông tụ củaZ. mobilis có thể chịu được điều kiện pH cao hơn (pH 6).
Các polyme nhân tạo như polyarcylamide, polyethylenimine và chitosan hoặc các đại phân tử ngoại bào như polysaccharide và protein được sản xuất bởi các chủng vi khuẩn có thể kết bông.
Z. mobilis còn có thể sản xuất ra polysaccharide (như levan, cellulose).
Những chủngZ. mobilis này có hiệu suất chuyển hóa glucose và fructose cao (gần 96%) và năng suất ethanol đạt cực đại ở độ pha loãng 0.9 – 1.8h-1. Mật độ tế bào trong thiết bị cao giúp vi khuẩn đạt được hiệu suất sinh tổng hợp ethanol cao. Ngoài ra, những chủng này còn có thể chịu được độ pha loãng cao gấp vài lần và thể hiện năng suất sản xuất cao hơn các chủng cha mẹ.
Hình 23 : Hình ảnhZymomonas mobilis ở trạng thái đơn lẻ và kết bông 3.1.1. Lên men gián đoạn
Lên men gián đoạn : là quá trình lên men không bổ sung bất kỳ chất gì vào hệ thống sau khi đã cấy giống vào bồn phản ứng ngoại trừ dung dịch acid hoặc