2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
2.11.Aûnh hưởng của nồng độ ethanol
Nếu có ethanol ban đầu trong môi trường dinh dưỡng thì sẽ làm giảm sản xuất sinh khối, hấp thu cơ chất, sản xuất ethanol, hiệu suất và hệ số chuyển hóa đường. Tuy nhiên không ảnh hưởng đáng kể đến sản xuất levan và hệ số hiệu suất sinh khối (g sinh khối/ g đường hấp thu).
Cụ thể : Với môi trường là sucrose có 2.5% ethanol ban đầu thì hiệu suất ethanol giảm 48.8%, hiệu suất sinh khối giảm 25% và tổng lượng đường hấp thu giảm 28.3%. Với môi trường là glucose có 3% ethanol ban đầu thì hấp thu đường giảm 60 – 65% (Moreau và cộng sự, 1997).
Tích lũy ethanol trong quá trình lên men đi đôi với việc giảm tốc độ chuyển hóa đường thành ethanol bởi Z. mobilis và nấm men. Hiện tượng này đặc biệt
quan trọng trong suốt quá trình sản xuất ethanol thương mại và gia tăng thời gian chuyển hóa cơ chất thành ethanol và giới hạn nồng độ ethanol cuối cùng đạt được. Sự kìm hãm này là do tác động trực tiếp của ethanol lên các enzyme chủ chốt của
con đường đường phân và sản xuất ethanol. Cơ chế kìm hãm có thể là ức chế ngược (ức chế do sản phẩm cuối) hoặc ức chế hoạt động của các enzyme.
Ethanol gây ra sự kìm hãm phụ thuộc vào khối lượng đến quá trình lên men với mức kìm hãm có thể đo được ở nồng độ 0.4 M (2%, wt/vol) trong cơ thể sống và 3.3 M (15%, wt/vol) trong ống nghiệm. Sự khác nhau này được giải thích là do nồng độ ethanol trong tế bào cao hơn trong môi trường. Tuy nhiên màng tế bào củaZ. mobiliscó thể cho ethanol thấm qua một cách dễ dàng và nồng độ ethanol nội bào không cao đến mức kìm hãm sự hoạt động của các enzyme. Một số các yếu tố khác trong môi trường nội bào có thể làm gia tăng sự nhạy cảm của enzyme với ethanol. Sự kìm hãm ethanol làm cho màng tế bào bị rò rỉ dẫn đến kết quả một số cofactor và coenzyme bị mất. Bổ sung magiê và nucleotide sẽ làm gia tăng tốc độ lên men khi có ethanol.
Sự rò rỉ của ion Mg (phân tử kích thước nhỏ) và nucleotide (phân tử kích thước trung bình) chỉ là một dấu hiệu của sự gia tăng tính thấm của màng tế bào, mà có thể gây ra bởi các ion khác, các cofactor và các sản phẩm trung gian của con đường đường phân. Đa số các enzyme trong con đường Entner-Doudoroff cần Mg làm cofactor như : glucokinase, glucose-6-photphat, dehydrogenase, phosphoglycerate kinase và enolase. Nét đặc hiệu của ion kim loại cho sự bảo vệ và sửa chữa sự kìm hãm bởi ethanol thì cũng tương tự như nét đặc hiệu của ion kim loại cho những enzyme này, có nghĩa là không thể thay thế ion Mg bởi ion khác như ion canxi. Vì thế sự rò rỉ ion Mg sẽ gây kìm hãm quá trình lên men.
Không giống như S. cerevisiae, alcohol dehydrogenase của Z. mobilis
không cần Mg. Các cofactor kim loại khác cần cho sự lên men như canxi cần cho hoạt hóa pyruvate decarboxylase và kali thì cần cho pyruvate kinase. Nồng độ ethanol sẽ gây ra sự rò rỉ. Nồng độ ethanol cao gây ra sự rò rỉ nucleotide nhiều hơn là Mg.
Ở nồng độ ethanol rất cao (4.4 M) (20%, wt/vol), sự lên men bị kìm hãm hoàn toàn, 30% hoạt tính lên men của tế bào có thể được phục hồi bằng cách thêm nucleotide và ion Mg. Điều này được giải thích là do sự khuếch tán của các sản phẩm trung gian vào và ra tế bào và sự suy giảm hoạt tính xúc tác của các enzyme đường phân. Tuy nhiên, sự kìm hãm hoàn toàn bởi 4.4 M ethanol (20%, wt/vol) không phải là kết quả của sự kìm hãm ngược hoặc sự biến tính các enzyme.
Ethanol làm giảm hoạt tính của màng tế bào theo 3 cách : làm biến đổi đặc tính của các hạt trong môi trường hoặc tương tác gián tiếp với màng tế bào hoặc làm thay đổi tính chất điện môi của môi trường.
axyl (RCO-) tham gia vào tương tác kỵ nước để hình thành nên trung tâm kỵ nước của màng tế bào, tạo điều kiện xâm nhập các phân tử có cực lên bề mặt màng tế bào. Ở nồng độ cao, ethanol có xu hướng hòa tan một số thành phần của màng tế bào tạo chỗ trống cho các nhóm kỵ nước xâm nhập và có thể thay thế nước vì bản chất cũng có liên kết hydro.
Mặt khác, ethanol là một phân tử lưỡng cực nên sẽ xâm nhập vào khu vực kỵ nước của màng tế bào. Do ethanol có tính phân cực hơn lõi phân cực của màng tế bào cho nên ethanol có xu hướng làm gia tăng độ phân cực trung bình của môi trường và giảm chức năng chất mang kỵ nước. Ethanol xâm nhập vào màng tế bào còn làm gia tăng trạng thái lỏng (tính lỏng) cũng như khả năng hóa lỏng của màng tế bào nên dẫn đến tế bào bị rò rỉ .
Cuối cùng, sự có mặt của ethanol sẽ làm biến đổi tính chất điện môi của môi trường, tăng lực tương tác tĩnh điện và đưa các ion về dạng kết hợp trung tính, dễ dàng thấm qua màng tế bào hơn. Tuy nhiên chỉ có những phân tử nhỏ là bị thất thoát, còn các phân tử lớn hơn thì bị giữ lại. Ví dụ như trong trường hợp có 4.4M ethanol ban đầu thì quan sát có sự thất thoát ion Mg và các nucleotide nhưng không thấy có sự thất thoát các protein.
Trong dung dịch đệm photphat, khả năng ức chế sự lên men của ethanol cao hơn trong môi trường sinh trưởng mặc dù chất đệm photphat cũng là một thành phần của môi trường sinh trưởng. Điểm khác nhau cơ bản là sự nhạy cảm với ion Mg trong dịch chiết nấm men, cho nên khi bổ sung Mg vào dung dịch đệm photphat thì sẽ làm giảm sự kìm hãm của ethanol lên quá trình lên men xuống mức tương đương với môi trường sinh trưởng.
Thêm EDTA cũng làm tăng khả năng ức chế của ethanol, chứng tỏ các kim loại hóa trị 2 có vai trò quan trọng trong môi trường sinh trưởng. Nếu ion Mg có nhiều ở môi trường xung quanh bên ngoài tế bào, nhờ hệ thống vận chuyển xúc tiến, sự rò rỉ ion Mg nội bào giảm dần. Tương tự, sự gia tăng nồng độ Mg ngoại bào sẽ làm giảm cung cấp Mg nội bào cho chức năng cofactor của enzyme.
Kết luận : cơ chế vận chuyển xúc tiến của Mg chịu trách nhiệm cho việc sửa chữa những hư hỏng do ethanol gây ra trong quá trình lên men khi nuôi cấy trong môi trường sinh trưởng mới không có ethanol. Vì vậy, sự có mặt của Mg ngoại bào trong dịch chiết nấm men giải thích cho sự giảm hoạt tính kìm hãm của ethanol trong môi trường sinh trưởng so với dung dịch đệm.
2.12. Aûnh hưởng của việc bổ sung ethanol trong quá trình lên men
Thêm ethanol vào quá trình lên men sẽ ức chế khả năng lên men của tế bàoZ. mobilis trong hai môi trường dung dịch đệm và môi trường sinh trưởng .Tuy nhiên, quá trình lên men sẽ chịu ảnh hưởng nhiều hơn bởi nồng độ ethanol thấp trong môi trường đệm so với môi trường sinh trưởng. Với nồng độ 5% (wt/vol) ethanol 1.1 M trong môi trường đệm và 10% (wt/vol) ethanol 2.2 M trong môi trường sinh trưởng thì hoạt tính lên men sẽ bị kìm hãm 50%, và sự lên men bị kìm hãm hoàn toàn bởi nồng độ ethanol cao nhất là 20% (wt/vol) ethanol 4.4 M trong cả môi trường đệm và môi trường sinh trưởng.
Hình 22 : Aûnh hưởng của việc bổ sung ethanol lên hoạt tính lên men .
- Tế bào ngâm trong dung dịch đệm Natri photphat (pH 6.0) có ethanol.
- Tế bào được ngâm với nhiều nồng độ ethanol khác nhau ở 30oC trong 10 phút sau đó đem đi rửa và ngâm trong dung dịch đệm không có ethanol .
- Tế bào được ngâm với ethanol trong dung dịch đệm sau đó đem đi rửa và ngâm trong dung dịch đệm có bổ sung 5 mM MgSO4, không có ethanol .
- Tế bào ngâm trong môi trường sinh trưởng có ethanol .
- Tế bào được ngâm với ethanol trong môi trường sinh trưởng ở 30oC trong 10 phút sau đó đem đi rửa và ngâm trong môi trường sinh trưởng không có ethanol.